131株耐多藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福布丁與利福平交叉耐藥的研究

沈靜 趙雁林 逄宇 張舜 杜昌廷 劉潔

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·論著·

131株耐多藥結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福布丁與利福平交叉耐藥的研究

沈靜 趙雁林 逄宇 張舜 杜昌廷 劉潔

目的 觀察利福布丁對(duì)MDR-TB菌株的抑菌效力及其與利福平的交叉耐藥性，了解對(duì)利福布丁與利福平交叉耐藥菌株rpoB基因突變特征。 方法 采用間隔抽樣法，從2007—2008年全國結(jié)核病耐藥基線調(diào)查的401株MDR-TB菌株中抽樣，傳代后獲得131株MDR-TB菌株。用微孔板Alamar blue法測(cè)定利福平和利福布丁對(duì)MDR-TB菌株的最低抑菌濃度(MIC)，采用直接測(cè)序法檢測(cè)MDR-TB菌株rpoB基因突變，分析rpoB基因突變對(duì)兩者交叉耐藥性的影響。采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，交叉耐藥率比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果 在131株MDR-TB菌株中，利福平MIC中位數(shù)值為256 μg/ml，利福布丁MIC中位數(shù)值為2 μg/ml。通過測(cè)定MIC的方法，利福平與利福布丁交叉耐藥率為76.47%(91/119)。在MDR-TB菌株中，發(fā)生rpoB基因突變113株(86.26%，113/131)，包括531、526、516、513、511、522、533等7種單位點(diǎn)突變，其中以密碼子531(56.50%，74/131)、526(16.03%，21/131)突變最為常見。不同rpoB基因突變的MDR-TB菌株，526、531位點(diǎn)突變出現(xiàn)利福平與利福布丁交叉耐藥的比例最高，分別占90.48%(19/21)、78.38%(58/74)，與無突變組(44.44%，8/18)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為9.641、8.223，P值均<0.05)。 結(jié)論 利福布丁與利福平存在交叉耐藥性，但利福布丁有更強(qiáng)的抑菌能力。MDR-TB菌株不同rpoB突變類型，利福平與利福布丁交叉耐藥性不同。

結(jié)核分枝桿菌; 抗藥性, 多種, 細(xì)菌； 利福布?。?利福平； 微生物敏感性試驗(yàn)； 細(xì)菌蛋白質(zhì)類

我國耐藥結(jié)核病疫情嚴(yán)重，MDR-TB已成為結(jié)核病控制中亟待解決的問題。根據(jù)2007—2008年全國結(jié)核病耐藥基線調(diào)查報(bào)告顯示：我國涂陽肺結(jié)核耐多藥率為8.32%，其中初治耐多藥率5.71%，復(fù)治耐多藥率25.64%，據(jù)此估算，我國每年新發(fā)耐多藥肺結(jié)核患者約12萬例[1]。

利福平是主要的抗結(jié)核藥物之一。rpoB基因突變的結(jié)核分枝桿菌常會(huì)對(duì)利福平耐藥，該基因利福平耐藥決定區(qū)(rifampin resistance-determining region, RRDR)不同位點(diǎn)突變的菌株最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)存在較大差別[2-5]。利福布丁是利福霉素類新藥，其作用機(jī)制與利福平一樣；與利福平相比較，利福布丁誘導(dǎo)細(xì)胞色素P-450CYP3A異構(gòu)酶可能性較低[6]，胃腸吸收少，大部分隨血液分布至全身各部位。利福布丁與利福平存在交叉耐藥性。為此本研究通過測(cè)定利福平、利福布丁對(duì)MDR-TB菌株的MIC，對(duì)兩藥的抑菌效力進(jìn)行比較；并根據(jù)MDR-TB菌株rpoB基因測(cè)序結(jié)果，對(duì)利福布丁與利福平交叉耐藥進(jìn)行分析。

材料和方法

一、材料和試劑

1. 菌株來源：從2007—2008年全國結(jié)核病耐藥基線調(diào)查菌株庫401株MDR-TB菌株中采用間隔抽樣法，間隔抽取134株。具體抽樣方法為：MDR-TB菌株按編號(hào)遞增順序排序，隨機(jī)選擇其中的一株，向后間隔2個(gè)編號(hào)抽取菌株，抽到編號(hào)尾部再接著從編號(hào)前部按序間隔2個(gè)編號(hào)抽取。抽取菌株經(jīng)轉(zhuǎn)種，其中3株污染，轉(zhuǎn)種后得到131株MDR-TB菌株。MDR-TB菌株的篩選采用傳統(tǒng)固體藥敏試驗(yàn)比例法。

2. 試劑：采用美國BD公司生產(chǎn)的7H9干粉、OADC營養(yǎng)添加劑，配制為含10%OADC營養(yǎng)添加劑的7H9液體培養(yǎng)基；采用美國Sigma公司生產(chǎn)的利福布丁和利福平藥粉，分別配制濃度為640 μg/ml、5120 μg/ml，-80 ℃保存?zhèn)溆?。使用北京康為世紀(jì)生物科技有限公司的2×Taq Master Mix，擴(kuò)增引物由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

二、實(shí)驗(yàn)室檢查方法

1. MDR-TB菌株的篩選[傳統(tǒng)固體藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)比例法]：含藥培養(yǎng)基藥物濃度為異煙肼0.2 μg/ml、利福平40 μg/ml、乙胺丁醇2 μg/ml、鏈霉素4 μg/ml、卡那霉素30 μg/ml、氧氟沙星2 μg/ml[7]。

2. MDR-TB菌株對(duì)利福布丁和利福平MIC檢測(cè)：采用微孔板Alamar blue法，7H9液體培養(yǎng)基，操作步驟參照文獻(xiàn)[8]。利福平MIC濃度梯度設(shè)置為：0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256、512 μg/ml，利福布丁濃度梯度設(shè)置為：0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64 μg/ml。耐藥臨界濃度根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)并參照文獻(xiàn)[9]的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置：利福布丁為0.5 μg/ml，利福平為1 μg/ml。

3. MDR-TB菌株rpoB基因測(cè)序：采用序列為5′-ACCGACGACATCGACCACTT-3′F和5′-GTACGGCGTTTCGATGAACC-3′R的2條引物擴(kuò)增rpoB基因，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為450 bp，含81 bp的RRDR區(qū)。擴(kuò)增體系(50 μl)：25 μl 2×Taq Master Mix，引物各1 μl、4 μl DNA樣品及19 μl H2O。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司用ABI3730測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用BioEdit軟件與標(biāo)準(zhǔn)敏感株H37Rv(標(biāo)準(zhǔn)菌株由國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室提供)基因序列進(jìn)行比對(duì)。

三、質(zhì)量控制

檢測(cè)H37Rv菌株MIC作為藥物質(zhì)量的控制。對(duì)MIC法藥物耐藥表型與基因突變結(jié)果不符的菌株，則重復(fù)測(cè)定MIC。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有資料錄入Excel建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行分析。利福平與利福布丁MIC比較采用相關(guān)樣本W(wǎng)ilcoxon帶符號(hào)秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；rpoB基因不同突變位點(diǎn)交叉耐藥頻率的比較采用R×2表χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如果組間總的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，再進(jìn)一步做兩兩比較。

結(jié) 果

一、利福布丁、利福平對(duì)MDR-TB菌株的MIC值及交叉耐藥情況

微信小程序[1-6]是一種不需要下載安裝即可使用的應(yīng)用，它實(shí)現(xiàn)了應(yīng)用“觸手可及”的夢(mèng)想，用戶掃一掃或者搜一下即可打開應(yīng)用。也體現(xiàn)了“用完即走”的理念，用戶不用關(guān)心是否安裝太多應(yīng)用的問題。應(yīng)用將無處不在，隨時(shí)可用，但又無需安裝卸載。對(duì)于開發(fā)者而言，小程序開發(fā)門檻相對(duì)較低，難度不及APP，能夠滿足簡單的基礎(chǔ)應(yīng)用，適合生活服務(wù)類線下商鋪以及非剛需低頻應(yīng)用的轉(zhuǎn)換。小程序能夠?qū)崿F(xiàn)消息通知、線下掃碼、公眾號(hào)關(guān)聯(lián)等七大功能。其中，由于小程序不存在入口，通過公眾號(hào)關(guān)聯(lián)，用戶可以實(shí)現(xiàn)公眾號(hào)與小程序之間相互跳轉(zhuǎn)。

利福平對(duì)MDR-TB菌株的MIC中位數(shù)值為256 μg/ml，利福布丁的MIC中位數(shù)值為2 μg/ml，利福布丁與利福平兩藥的MIC梯度分布不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-9.886，P<0.05)；參照耐藥臨界濃度，131株MDR-TB菌株對(duì)利福平敏感12株，耐藥119株，對(duì)利福布丁敏感40株，耐藥91株。在119株耐利福平菌株中，有91株對(duì)利福布丁耐藥，利福布丁與利福平的交叉耐藥率為76.47%(91/119)(表1，2)。

表1 不同利福平MIC梯度下131株MDR-TB菌株耐藥情況統(tǒng)計(jì)

注 -：因藥敏試驗(yàn)結(jié)果為敏感，此處無意義

表2 不同利福布丁MIC梯度下131株MDR-TB菌株耐藥情況統(tǒng)計(jì)

注 -：因藥敏試驗(yàn)結(jié)果為敏感，此處無意義

二、MDR-TB菌株rpoB基因測(cè)序結(jié)果

119株利福平耐藥株中，有103株rpoB基因發(fā)生突變(占86.55%，103/119)；在所有131株MDR-TB菌株中，共有113株rpoB基因發(fā)生突變，突變率86.26%(113/131)，其中單位點(diǎn)突變110株(83.97%，110/131)，包括7種位點(diǎn)，按突變率遞減順序排列依次為531、526、516、511和522(并列)、513和533(并列)，其中以密碼子531、526、516突變最為常見，兩位點(diǎn)聯(lián)合突變3株(2.29%，3/131)(表3)。

表3 131株MDR-TB菌株的rpoB基因測(cè)序結(jié)果

注 -：因rpoB基因測(cè)序無突變，此處無意義

三、MDR-TB菌株不同rpoB基因突變類型對(duì)利福布丁和利福平MIC的影響

統(tǒng)計(jì)不同MDR-TB菌株rpoB基因突變類型菌株對(duì)利福布丁和利福平的敏感性情況(表4)，Ser531Leu、Ser531Phe、His526Tyr、His526Asp、His526Asn、His526Arg、His526Leu利福平與利福布丁交叉耐藥的株數(shù)最多，共77株(占突變68.14%，77/113)。表5顯示，MDR-TB菌株不同rpoB基因位點(diǎn)突變，出現(xiàn)利福平與利福布丁的交叉耐藥的比例也不同，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=23.344，P<0.05)。531、526位點(diǎn)突變利福平與利福布丁交叉耐藥率最高，分別為48.74%(58/119)、15.97%(19/119)，在同類型突變菌株中出現(xiàn)交叉耐藥的比例也是最高的，分別為78.38%(58/74)、90.48%(19/21)。18株MDR-TB菌株rpoB基因未突變，其中16株對(duì)利福平耐藥，8株對(duì)利福布丁耐藥。

表4 131株MDR-TB菌株不同rpoB基因突變類型對(duì)利福布丁和利福平的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注 -：因rpoB基因測(cè)序無突變，此處無意義

表5 131株MDR-TB菌株不同rpoB基因突變類型對(duì)利福布丁和利福平的交叉耐藥情況

注 交叉耐藥率=交叉耐藥株數(shù)/利福平耐藥總株數(shù)(119株)×100%；比率=某類型交叉耐藥株數(shù)/某類型株數(shù)×100%；a：比率與無突變組比較，χ2值分別為8.223、9.641，P值均<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；b：比率與無突變組比較，F(xiàn)isher確切概率法，P值均>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

討 論

一、利福布丁與利福平對(duì)MDR-TB菌株的MIC

利福布丁是一種新的半合成藥物，為利福霉素類的衍生物之一，與利福平之間存在交叉耐藥性，近年來國內(nèi)外已有許多關(guān)于利福布丁與利福平交叉耐藥性的研究和報(bào)道，不同的報(bào)道之間可能由于選例地區(qū)、流行株遺傳背景、樣本量等差異，兩藥交叉耐藥率差別較大。本研究結(jié)果顯示所有對(duì)利福平敏感的菌株，對(duì)利福布丁也是敏感的，MDR-TB菌株對(duì)利福平與利福布丁兩藥間存在交叉耐藥性(交叉耐藥率76.47%)，與韓喜琴等[9]報(bào)道的72.5%接近，但低于高麗等[10]報(bào)道的85.9%。

利福平與利福布丁對(duì)MDR-TB菌株的MIC梯度分布顯示，利福布丁有較強(qiáng)的抑菌能力，對(duì)耐利福平尤其是MDR-TB患者，在進(jìn)行利福布丁藥敏試驗(yàn)基礎(chǔ)上，可酌情使用利福布丁。

二、不同rpoB基因突變的MDR-TB菌株耐藥情況

在所有檢測(cè)到rpoB基因突變的MDR-TB菌株中，531、526位點(diǎn)突變率總和72.52% (95/131)，這2個(gè)位點(diǎn)的突變率最高，這與梁慶福等[11]報(bào)道的福建地區(qū)75例MDR-TB菌株531、526位點(diǎn)突變率總和72.1%幾乎相同，但蘇雯婕等[12]報(bào)道的廣東地區(qū)95例MDR-TB菌株rpoB基因2種位點(diǎn)以上基因突變率更高，達(dá)83.91%。531、526位點(diǎn)突變率總和與后者有較大差異，這可能是由于研究地域不同、樣本量不同，并且本研究樣本是來自全國性的菌株庫，菌株來自全國各耐藥監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)，具有廣泛的代表性。

在檢測(cè)到rpoB基因突變的MDR-TB菌株中，531、526位點(diǎn)突變株數(shù)最多，在同類型突變菌株中出現(xiàn)交叉耐藥的比例也是最高的。結(jié)核分枝桿菌rpoB基因526、531位點(diǎn)突變，強(qiáng)烈提示對(duì)利福平耐藥，并且對(duì)利福平與利福布丁交叉耐藥的可能性較大，不建議使用利福布?。欢?16位點(diǎn)突變，對(duì)利福平與利福布丁交叉耐藥的可能性較小[13-14]。

rpoB基因未突變的MDR-TB菌株中，部分利福平的MIC微孔板Alamar blue法結(jié)果為耐藥，這可能是因?yàn)楸狙芯繑U(kuò)增產(chǎn)物大小為450 bp，含81 bp的RRDR區(qū)(密碼子507-533)，測(cè)序主要能檢出RRDR區(qū)突變，RRDR以外兩側(cè)區(qū)域的突變不能完全檢出。并且結(jié)核分枝桿菌耐藥不僅與耐藥相關(guān)基因突變有關(guān)，還與其藥物外排泵的作用機(jī)制有關(guān)。大量研究結(jié)果表明，結(jié)核分枝桿菌對(duì)利福霉素類藥物的耐藥與rpoB基因突變有關(guān)，近年來也有文獻(xiàn)報(bào)道在rpoB未突變的單耐利福平的結(jié)核分枝桿菌中，Rv2936和Rv0783可能是與利福平耐藥相關(guān)的藥物外排泵基因[15]。下一步工作，可以對(duì)直接測(cè)序未檢出rpoB基因突變的18例MDR-TB菌株進(jìn)行全基因測(cè)序，了解其RRDR以外兩側(cè)區(qū)域的突變情況[16]。全基因測(cè)序后對(duì)rpoB基因未突變株進(jìn)一步做利福平耐藥相關(guān)的藥物外排泵基因的檢測(cè)，再結(jié)合藥物MIC結(jié)果進(jìn)行交叉耐藥性的分析。

三、MIC法與傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)比例法比較

關(guān)于受試菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果的差異，通過測(cè)定MIC的方法，在131株MDR-TB菌株中有12株對(duì)利福平敏感，與傳統(tǒng)的藥敏試驗(yàn)結(jié)果存在差異。這是由于研究對(duì)象(131株MDR-TB菌株)均采用傳統(tǒng)固體藥敏試驗(yàn)比例法進(jìn)行篩選，其含藥培養(yǎng)基藥物濃度為利福平40 μg/ml，判定標(biāo)準(zhǔn)為藥物培養(yǎng)基生長菌落數(shù)/對(duì)照培養(yǎng)基生長菌落數(shù)≥1%則判定耐藥[8]。Kim[17]報(bào)道結(jié)核分枝桿菌傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)存在與臨床表型不一致的情況，在眾多抗結(jié)核藥物中，對(duì)利福平的藥敏試驗(yàn)結(jié)果是最可靠的，即使這樣對(duì)利福平的傳統(tǒng)比例法藥敏試驗(yàn)也只能區(qū)分85.6%對(duì)利福平可能敏感的菌株(來自從未使用抗結(jié)核藥物的患者)和可能耐藥的菌株(來自按規(guī)程抗結(jié)核治療失敗的患者)。本研究使用測(cè)定MIC的方法，利福平MIC≥臨界濃度(1 μg/ml)則判定為耐藥，存在2種方法判定標(biāo)準(zhǔn)不一、藥物含量不同、使用培養(yǎng)基不同(固體與液體介質(zhì)分子通量不同)、培養(yǎng)時(shí)間不同等差異。這可能是造成本研究中這12株菌株出現(xiàn)對(duì)利福平藥敏試驗(yàn)結(jié)果差異的原因。

MIC微孔板Alamar blue法較傳統(tǒng)固體藥敏試驗(yàn)方法用時(shí)短，一般7～14 d可判讀結(jié)果，不需要任何儀器，較采用全自動(dòng)培養(yǎng)儀(如Bactec MGIT 960、BacT/Alert 3D)價(jià)格便宜，更有利于患者的診斷和治療。微孔板Alamar blue法測(cè)定MIC所用試劑都是自行配置，暫無成品化試劑，因此不同的操作時(shí)間、不同的試劑配置批次(尤其是藥物配置批次)、操作熟練度等因素對(duì)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)一定影響。如果通過多中心大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證微孔板Alamar blue法，通過評(píng)估后，可確立其為快速藥敏試驗(yàn)方法。

四、本研究的不足

MDR-TB菌株的傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)是由國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室在2007—2008年完成和復(fù)核的，本研究對(duì)其中抽取的131株進(jìn)行了微孔板Alamar blue法測(cè)定。微孔板Alamar blue法不是傳統(tǒng)的方法，部分試劑需自行配置，不同的時(shí)間、地點(diǎn)和操作者所獲得結(jié)果可能會(huì)出現(xiàn)差異，因此應(yīng)對(duì)關(guān)鍵性的檢測(cè)條件、耐藥臨界值進(jìn)行研究，本研究對(duì)以上方面的研究較少。

本研究中2種方法藥敏試驗(yàn)結(jié)果不符的菌株雖然進(jìn)行了MIC的復(fù)核，但未采用第3種標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)藥敏試驗(yàn)結(jié)果再進(jìn)行客觀評(píng)價(jià)。并且結(jié)核分枝桿菌耐藥不僅與耐藥相關(guān)基因突變有關(guān)，還與其藥物外排泵的作用機(jī)制有關(guān)，本研究中菌株全部為MDR-TB菌株，較普通菌株其各種耐藥風(fēng)險(xiǎn)更高，但是本研究主要著眼于不同的MDR-TB菌株rpoB基因突變類型對(duì)交叉耐藥性的影響，沒有對(duì)其他耐藥機(jī)制進(jìn)行探討，可能存在耐藥表型和耐藥基因突變不符的情況。

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(本文編輯：郭萌)

Investigation of cross-resistance between rifampin and rifabutin in multidrug-resistantM.tuberculosisstrains

SHENJing*，ZHAOYan-lin，PANGYu，ZHANGShun，DUChang-ting，LIUJie.

*TuberculosisReferenceLaboratory，ChongqingInstitutionofTuberculosisControlandPrevention，Chongqing400050，China

ZHANGShun，Email：ZS52077@sina.com

Objective To investigate the antibacterial effect of rifabutin and the cross-resistance between rifabutin and rifampin in multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosis(MDR-TB)strains, to understand the mutation characteristics ofrpoBgene among the strains with rifampin and rifabutin cross-resistance. Methods Using interval sampling method, 131 MDR-TB clinical strains were obtained from 401 MDR-TB isolates of National Drug Resistance Tuberculosis Baseline Survey in 2007—2008. Minimum inhibitory concentrations (MICs) of rifampin and rifabutin for these MDR-TB isolates were determined by microplate Alamar blue assay method.The mutations ofrpoBgene were determined by DNA sequencing, and analyzed the effect of therpoBgene mutations on rifabutin and rifampin cross resistance. Using SPSS 11.0 statistical analysis software, the cross-resistance was compared with Chi-square test. The difference was considered as statistical significance whenP<0.05. Results Of 131 MDR-TB strains, the median of rifampin MICs was 256 μg/ml, and the median of rifabutin MICs was 2 μg/ml. The cross resistant rate between rifampin and rifabutin was 76.47%(91/119). In addition, 113 isolates(86.26%, 113/131) harboredrpoBmutations, in which there were 7 types of single mutations, including codon 531, 526, 516, 513, 511, 522, and 533, codon 531(56.50%, 74/131) and codon 526(16.03%, 21/131) were the most frequently observed. Besides, the mutations at codon 526 and 531 were associated with cross-resistance between rifampin and rifabutin, their cross-resistance rates were 90.48%(19/21) and 78.38%(58/74) respectively, which had no statistically significant difference(χ2were 9.641 and 8.223,P<0.05). Conclusion Rifabutin has cross-resistance with rifampin, but rifabutin showed better antimicrobial ability. TheM.tuberculosisisolates with differentrpoBmutations showed different cross-resistance between rifabutin and rifampin.

Mycobacteriumtuberculosis； Drug resistance, multiple, bacterial； Rifabutin； Rifampin； Microbial sensitivity tests； Bacterial proteins

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.04.010

400050 重慶市結(jié)核病防治所 結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室(沈靜、張舜、杜昌廷、劉潔)；中國疾病預(yù)防控制中心國家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室(趙雁林、逄宇)

張舜，Email：ZS52077@sina.com

2014-06-23)