施馬倫貝格病毒RT-LAMP檢測(cè)方法的建立

袁向芬，吳紹強(qiáng)，張永寧，林祥梅

（中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)物檢疫研究所，北京 100029）

2011年秋季，德國(guó)北部和荷蘭西部等地一些奶牛場(chǎng)暴發(fā)了一種以發(fā)熱、產(chǎn)奶量下降、腹瀉、嚴(yán)重時(shí)流產(chǎn)等為臨床癥狀的新型動(dòng)物疫病。德國(guó)弗里德里希洛福勒研究所（Friedrich-Loeffler-Institut，F(xiàn)LI）通過(guò)實(shí)驗(yàn)室診斷與研究，確定導(dǎo)致此次疫病的病原體為一種新型布尼亞病毒，并將其命名為施馬倫貝格病毒（Schmallenberg virus，SBV），將其引起的疫病稱為施馬倫貝格病[1]。該病主要感染綿羊、牛、山羊以及鹿等反芻動(dòng)物，截至2013年10月，其已迅速蔓延至28個(gè)國(guó)家，引起了世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）、歐盟和國(guó)際社會(huì)的高度重視。

鑒于SBV可通過(guò)精液等遺傳物質(zhì)傳播，加之我國(guó)與歐盟國(guó)家之間的反芻動(dòng)物遺傳物質(zhì)貿(mào)易頻繁，建立一種敏感、快速、特異及臨床診斷可行的檢測(cè)方法尤為迫切，目前，可用于施馬倫貝格病診斷的技術(shù)主要包括：病毒分離[2，3]、中和試驗(yàn)[4]、免疫熒光[5]、ELISA[5]及Real-Time RT-PCR[6]等方法。然而，以上幾種檢測(cè)方法或需借助特殊儀器，或需較長(zhǎng)周期，對(duì)試驗(yàn)環(huán)境的要求也較為嚴(yán)謹(jǐn)，因此并不完全適用于養(yǎng)殖場(chǎng)、野外及口岸的現(xiàn)場(chǎng)檢疫。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-medieated isothermal amplif i cation，LAMP）自2000年首次報(bào)道以來(lái)，因其高效、快速、高特異性等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物疫病的檢測(cè)工作[7-10]。該技術(shù)依賴于能夠識(shí)別靶序列上6個(gè)特異性區(qū)域的引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在簡(jiǎn)單的等溫條件下即可實(shí)現(xiàn)靶序列的高效擴(kuò)增[11，12]，整個(gè)過(guò)程中對(duì)環(huán)境、儀器等條件的要求均極其簡(jiǎn)單，特別適用于動(dòng)物疫病的現(xiàn)場(chǎng)檢疫。本研究針對(duì)SBV的S基因節(jié)段建立了其RTLAMP方法，并通過(guò)一系列試驗(yàn)證明該方法與實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法相比具有良好的敏感性和特異性，同時(shí)對(duì)于臨床樣品的快速檢測(cè)也具有高度適用性。

1 材料和方法

1.1 樣品

SBV陽(yáng)性RNA樣品由德國(guó)FLI實(shí)驗(yàn)室提供，用于提取RNA的病毒培養(yǎng)液濃度為6×107TCID50/mL。由于與SBV同屬、且親緣關(guān)系很近[13]的赤羽病病毒（Akabane virus，AKAV）、沙門達(dá)病毒（Shamonda virus，SHAV）、艾羅病毒（Aino virus，AINOV）、道格拉斯病毒（Douglas virus，DOUV）Australia 株、道格拉斯病毒（Douglas virus）Texas株和辛波病毒（Simbu virus）多為國(guó)外動(dòng)物疫病，因此特異性試驗(yàn)所需的相關(guān)病毒S基因節(jié)段核酸均由寶生物工程（大連）有限公司全基因合成獲得，合成序列參考表1。

103份牛、羊臨床全血樣品采集自內(nèi)蒙、天津等地養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

本研究對(duì)比了GenBank中SBV及其同屬各病毒的基因序列，針對(duì)SBV的S基因節(jié)段序列，利用Primer Explorer version 4在線引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)了一套用于LAMP反應(yīng)的引物（表2），引物交寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 病毒參考序列

表2 引物設(shè)計(jì)

1.3 RNA提取

陽(yáng)性RNA樣品由德國(guó)FLI實(shí)驗(yàn)室提供，其提取按照Trizol法進(jìn)行，取1mLSBV病毒培養(yǎng) 液（6×107TCID50/mL） 進(jìn) 行RNA的 提 取，用30μLDEPC水進(jìn)行RNA的溶解，經(jīng)換算可知RNA濃度相當(dāng)于2×106TCID50/μL。臨床血液樣品RNA的提取，有本實(shí)驗(yàn)室按照Trizol法提取，具體操作參照說(shuō)明書進(jìn)行。提取的RNA均置于-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 RT-LAMP條件優(yōu)化與方法建立

為實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)不同反應(yīng)條件下RT-LAMP的進(jìn)展情況，反應(yīng)條件的優(yōu)化借助環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增實(shí)時(shí)濁度儀LA-320c進(jìn)行，在Loopamp RNA Amplification Kit（RT-LAMP）試劑盒（Eiken Chemical Co.，Ltd，Tokyo，Japan）基礎(chǔ)上，主要對(duì)反應(yīng)的引物濃度、退火溫度（60-65℃）、反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化（表3）。

1.5 RT-LAMP方法敏感性及特異性分析

用優(yōu)化后的RT-LAMP檢測(cè)方法對(duì)SBV同屬的 AKAV、SHAV、AINOV、DOUV Australia株、DOUV Texas株及Simbu病毒的S節(jié)段核酸樣品進(jìn)行擴(kuò)增，評(píng)估本方法的特異性。設(shè)置SBV RNA樣品為陽(yáng)性對(duì)照，滅菌水為陰性對(duì)照。另外，按照優(yōu)化后的條件和程序?qū)Ρ痉椒`敏度進(jìn)行評(píng)估，采用10倍系列稀釋的SBV RNA樣品（2×106～2×10-1TCID50/μL）進(jìn)行，來(lái)確定本方法的最低檢測(cè)限。反應(yīng)結(jié)果可通過(guò)肉眼觀察判定：當(dāng)反應(yīng)液中加入熒光染料鈣黃綠素（Calcein）時(shí)，可根據(jù)反應(yīng)后溶液的顏色變化進(jìn)行鑒定，陽(yáng)性反應(yīng)溶液會(huì)由原來(lái)的橙色變?yōu)榱辆G色，陰性仍保持橙色；還可利用電泳分析進(jìn)行判定：取5μL反應(yīng)液于2.5%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，在紫外下觀察電泳條帶并拍照記錄。

表3 溫度和內(nèi)引物濃度優(yōu)化

1.6 SBV與SHAV的鑒別診斷

SBV和SHAV S基因節(jié)段序列同源性極高，可達(dá)97%，因此基于S節(jié)段的常規(guī)核酸擴(kuò)增技術(shù)無(wú)法實(shí)現(xiàn)兩者的準(zhǔn)確鑒別。通過(guò)對(duì)GenBank中SBV和SHAV的S節(jié)段基因序列進(jìn)行酶切位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，引物F1和F2對(duì)應(yīng)序列之間的靶序列上，SHAV存在一特異性酶切位點(diǎn)Af l II（5'C^TTAAG3'）（表4），而SBV并不存在該位點(diǎn)，因此，可通過(guò)對(duì)RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行酶切來(lái)進(jìn)一步鑒別SBV與SHAV。

表4 酶切位點(diǎn)序列分析

1.7 Real-time RT-PCR方法

德國(guó)FLI實(shí)驗(yàn)室針對(duì)SBV的S基因節(jié)段建立了檢測(cè)施馬倫貝格病的熒光定量RT-PCR方法[6]。該方法的商品化試劑盒已由Qiagen公司進(jìn)行生產(chǎn)與銷售（貨號(hào)FLI B585）。參照該試劑盒說(shuō)明書，對(duì)10倍系列稀釋的SBV陽(yáng)性RNA及制備的其同屬6種病毒S節(jié)段核酸樣品進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，與RT-LAMP檢測(cè)方法的靈敏度及特異性進(jìn)行比較。其反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 10min（反轉(zhuǎn)錄）；95℃ 10min（預(yù)變性）；95℃ 15s，56℃ 30，72℃30s，42個(gè)循環(huán)（PCR反應(yīng)），在56℃退火階段進(jìn)行熒光信號(hào)的收集，全程108min。

1.8 臨床樣品的檢測(cè)

用建立的RT-LAMP方法檢測(cè)103份臨床樣品，并與熒光定量RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 RT-LAMP方法優(yōu)化

經(jīng)過(guò)一系列優(yōu)化，確定了SBV RT-LAMP方法的反應(yīng)體系（25μL）為：FIP和BIP各40pmol，F(xiàn)3和B3各5pmol，LF和LP各20pmol，2×Reaction Mix 12.5μL（Tris-HCl（pH 8.8）40 mM，KCl 20mM，MgSO416mM，（NH4）2SO420mM，Tween 200.2%，Betaine 1.6 M，dNTPs 2.8mM each），Enzyme Mix 1.0μL，核酸RNA 5μL，另外，反應(yīng)液中還加入1μL熒光試劑FDR（Eiken Chemical Co.，Ltd，Tokyo，Japan）來(lái)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。反應(yīng)程序?yàn)椋?3℃恒溫下擴(kuò)增50min；80℃酶滅活5min，該程序既可在恒溫水浴鍋中進(jìn)行，也可在金屬浴及各種核酸擴(kuò)增儀等儀器中進(jìn)行。反應(yīng)后，通過(guò)肉眼觀察顏色變化即可判定反應(yīng)陰陽(yáng)性。

2.2 RT-LAMP方法的敏感性和特異性

用建立的RT-LAMP方法對(duì)10倍系列稀釋的SBV陽(yáng)性RNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖所示（圖1A，1B），本方法可成功檢測(cè)到2×100TCID50/μL的陽(yáng)性RNA，染料法與瓊脂糖凝膠電泳法的結(jié)果一致，結(jié)合加入反應(yīng)體系的RNA體積，靈敏度可達(dá)10TCID50。特異性試驗(yàn)顯示（圖1D），僅SBV及SHAV發(fā)生擴(kuò)增，反應(yīng)管顏色由原來(lái)的橙色轉(zhuǎn)變?yōu)榱辆G色，與電泳結(jié)果一致（圖1E），說(shuō)明該方法與SHAV存在交叉反應(yīng)。熒光定量RTPCR方法的靈敏度同為10TCID50（圖1C），特異性試驗(yàn)顯示其可與SHAV、DOUV Australia株和DOUV Texas株發(fā)生交叉反應(yīng)（圖1F）。相比之下，本研究建立的RT-LAMP方法兼具了良好的敏感性和特異性。

圖1 靈敏度與特異性試驗(yàn)

2.3 SBV與SHAV的鑒別診斷

圖2 酶切鑒定試驗(yàn)

25μL酶切反應(yīng)體系中包含5μL RT-LAMP產(chǎn)物，2.5μL cutsmart buffer，8U Af l II酶（New England Biolabs，USA）。37℃孵育過(guò)夜后，取10μL酶切產(chǎn)物于2.5%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，在紫外顯像儀中觀察酶切后條帶的變化。結(jié)果與預(yù)期結(jié)果相符，SBV與SHAV呈現(xiàn)出不同的酶切結(jié)果，如圖2所示，SBV LAMP產(chǎn)物經(jīng)酶切后，與SBV LAMP產(chǎn)物的電泳條帶一致，未發(fā)生變化，說(shuō)明未發(fā)生酶切反應(yīng)；而SHAV則在227bp位置有一明顯新增條帶產(chǎn)生，借此即可實(shí)現(xiàn)SBV與SHAV的鑒別性診斷。

2.4 臨床樣品檢測(cè)

為評(píng)估本研究建立的RT-LAMP方法的臨床適用性，本課題組采集了內(nèi)蒙、天津等地的103份牛、羊全血樣品，分別用本研究建立的RTLAMP方法及熒光定量RT-PCR方法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，兩種方法檢測(cè)的陽(yáng)性率均為0%。說(shuō)明所采集的103份樣品均為SBV陰性。

3 討論

本研究建立了一種快速檢測(cè)SBV的RT-LAMP方法，并利用酶切可鑒別診斷SBV及SHAV。環(huán)引物的應(yīng)用大大加速了反應(yīng)速率[14]，可在50分鐘內(nèi)完成擴(kuò)增。同時(shí)，本方法具有高度的敏感性，可達(dá)10TCID50，與熒光定量RTPCR方法的敏感性相同。而特異性試驗(yàn)顯示，本研究建立的RT-LAMP方法與德國(guó)FLI實(shí)驗(yàn)室所建立的qRT-PCR檢測(cè)方法[6]相同。本法可與SHAV發(fā)生交叉反應(yīng)，因?yàn)镾BV和的SHAV兩者S節(jié)段核酸序列同源性高達(dá)97%[15]?；赟節(jié)段的常規(guī)核酸檢測(cè)方法極不易對(duì)兩者進(jìn)行區(qū)分，本類方法更適用于田間、養(yǎng)殖場(chǎng)及口岸等大量樣品的初檢。另外，本研究建立了基于Af l II酶切位點(diǎn)的酶切鑒定方法，可實(shí)現(xiàn)兩者的鑒別診斷，增加本方法的特異性，為實(shí)驗(yàn)室確診提供了可信的鑒別診斷方法。本方法的另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)還在于，相比于熒光RT-PCR要借助昂貴精密的儀器而言，RT-LAMP可利用簡(jiǎn)單的恒溫裝置進(jìn)行擴(kuò)增，并可通過(guò)多種方法進(jìn)行結(jié)果的判定，如通過(guò)肉眼判定、染料法以及傳統(tǒng)的電泳法。研究顯示，本方法采用的染料法完全可以滿足常規(guī)檢測(cè)的需要[16]，特別適用于大規(guī)模、野外或口岸的臨床樣品檢測(cè)。相比之下，RT-LAMP方法兼具了良好的敏感性、特異性、快捷性及便利性，更適于口岸、養(yǎng)殖場(chǎng)等的現(xiàn)場(chǎng)檢疫，為SBV的防控提供技術(shù)儲(chǔ)備。

采集內(nèi)蒙古、天津等地的牛、羊全血樣品103份，統(tǒng)一處理后進(jìn)行RT-LAMP檢測(cè)。其結(jié)果與熒光定量RT-PCR方法的結(jié)果完全符合，樣品檢測(cè)結(jié)果均為SBV陰性，與中國(guó)境內(nèi)目前無(wú)SBV存在的相關(guān)報(bào)道相符[17，18]。但考慮到SBV傳播速度快、涉及范圍廣，該結(jié)果同時(shí)提示我國(guó)繼續(xù)加強(qiáng)對(duì)SBV的口岸防控，同時(shí)制定相關(guān)防控政策，防止SBV跨境傳入中國(guó)。

然而，LAMP技術(shù)也存在不足之處，這些不足也是限制LAMP技術(shù)發(fā)展的主要障礙。LAMP方法具有高效的反應(yīng)速率，單個(gè)目的基因可于短時(shí)間內(nèi)迅速擴(kuò)增至109拷貝數(shù)，此時(shí)極易產(chǎn)生氣溶膠，導(dǎo)致環(huán)境污染以及假陽(yáng)性的出現(xiàn)，為控制該污染，實(shí)驗(yàn)人員在操作過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格注意空間、儀器耗材等的分隔使用，同時(shí)反應(yīng)后盡量利用染料法、比濁法等閉管方法進(jìn)行判定[8，19-20]，防止反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)散。另外，有研究者通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LAMP反應(yīng)對(duì)培養(yǎng)基及生物物質(zhì)干擾具有較強(qiáng)抗性，因此對(duì)病毒核酸的提取質(zhì)量要求較低[21]；且目前對(duì)于核酸提取技術(shù)的研究也有了很大的進(jìn)展[22-25]，國(guó)內(nèi)外已有公司 推出了一管式核酸提取試劑，在核酸提取時(shí)間及操作上提供了很大便利，然而探索一種可與LAMP技術(shù)配套的經(jīng)濟(jì)、快速、便捷、成熟的核酸提取技術(shù)，仍是LAMP技術(shù)發(fā)展及應(yīng)用的迫切需要。

[1]Hoffmann B，Scheuch M，Hoper D，et al.Novel orthobunyavirus in Cattle，Europe，2011[J].Emerg Infect Dis，2012，18（3）：469-472.

[2]Hoffmann B，Schulz C，Beer M.First detection of Schmallenberg virus RNA in bovine semen，Germany，2012[J].Vet Microbiol，2013，167（3）：289-295.

[3]van der Heijden H M，Boustra R J，Mars M H，et al.Development and validation of an indirect enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibodies against Schmallenberg virus in blood samples from ruminants[J].Res Vet Sci，2013，95（2）：731-735.

[4]Leoffen W，Quak S，de Boer-Luijtze E，et al.Development of a virus neutralisation test to detect antibodies against Schmallenberg virus and serological results in suspect and infected herds[J].Acta Vet Scand，2012，54（1）：44.

[5]Breard E，Lara E，Comtet L，et al.Validation of a commercially available indirect ELISA using a nucleocapside recombinant protein for detection of Schmallenberg virus antibodies[J].PLoS One，2013，8（1）：e53446.

[6]Bilk S，Schulze C，F(xiàn)ischer M，Beer M，et al.Organ distribution of Schmallenberg virus RNA in malformed newborns[J].Vet Microbiol，2012，159（1/2）：236-238.

[7]鑫 婷，侯紹華，賈 紅，等.豬呼吸與繁殖綜合癥病毒RT-LAMP 檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43（1）：185-191.

[8]Tomita N，Mori Y，Kanda H，et al.Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）of gene sequences and simple visual detection of products[J].Nature Protocols，2008，3（5）：877-882.

[9]Yin S，Shang Y，Zhou G，et al.Development and evaluation of rapid detection of classical swine fever virus by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification（RT-LAMP）[J].Journal of Biotechnology，2010，146（4）：147-150.

[10]Reddy V，Ravi V，Desai A，et al.Utility of IgM ELISA，TaqMan real-time PCR，reverse transcription PCR，and RT-LAMP assay for the diagnosis of Chikungunya fever[J].Journal of Medical Virology，2012，84（11）：1771-1778.

[11]Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loopmediated-isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Research，2000，28：E63.

[12]羅力涵，張波.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及其在傳染性疾病檢測(cè)中的應(yīng)用[J].中國(guó)國(guó)境衛(wèi)生檢疫雜志，2014，37（1）：68-71.

[13]Goller K V，Hoper D，Schirrmeier H，et al.Schmallenberg virus as possible ancestor of Shamonda virus[J].Emerge Infect Dis.2012，18（10）：1644-1646.

[14]Nagamine K，Hse T，Notomi T.Accelerated reaction by loop-mediated isotherml amplification using loop primers[J].Mol Cell Probes， 2002， 16（3）：223-9.

[15]Yanase T，Kato T，Aizawa M，et al.Genetic reassortment between Sathuperi and Shamonda viruses of the genus Orthobunyavirus in nature：Implications for their genetic relationship to Schmallenberg virus[J].ArchVirol，2012，157（8）：1611-1616.

[16]Higashimoto Y，Ihira M，Ohta A，et al.Discriminating between Varicella-Zoster virus vaccine and wild-type strains by loop-mediated isothermal amplif i cation[J].J Clin Microbiol 2008，46：2665-2670.

[17]張永寧，吳紹強(qiáng)，劉 建，等.歐洲暴發(fā)施馬倫貝格病疫情及我國(guó)應(yīng)采取的對(duì)策[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2012，48（4）：92-95.

[18]張永寧，吳紹強(qiáng)，呂繼洲，等.施馬倫貝格病毒核衣殼蛋白的原核表達(dá)、純化及多克隆抗體的制備[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，44（10）：1629-1236.

[19]Mori Y，Kitao M，Tomita N，et al.Real-time turbidimetry of LAMP reaction for quantifying template DNA[J].J Biochem Bioph Meth，2004，59：145-157.

[20]Mori Y，Nagamine K，Tomita N，et al.Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation[J].Biochem Bioph Res Co，2001，289：150-154.

[21]Kaneko H，Kawana T，F(xiàn)ukushima E，et al.Tolerance of loop-mediated isothermal amplif i cation to a culture medium and biological substances[J].J Biochem Bioph Meth，2007，70：499-501.

[22]Kiefer E，Heller W，Ernst D.A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites[J].Plant Molecular Biology Reporter，2000，18（1）：33-39.

[23]Cho Y K，Lee J G，Park J M，et al.One-step pathogen specific DNA extraction from whole blood on a centrifugal microf l uidic device[J].Lab Chip，2007，7（5）：565-573.

[24]Rohland N，Hofreiter M.Comparison and optimization of ancient DNA extraction[J].Biotechniques，2007，42（3）：343-52.

[25]Chomczynski P，Sacchi N.The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenolchloroform extraction：twenty-something years on[J].Nat Protoc.2006，1（2）：581-585.