奈達(dá)鉑提高鼻咽癌CNE－2 細(xì)胞放射敏感性的體外實(shí)驗(yàn)研究

王鎮(zhèn)南，唐 志，喻嫦娥，李淑慧，楊東紅 (廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤中心，廣東 湛江 524001)

鼻咽癌是嚴(yán)重威脅全球健康的常見的惡性腫瘤，許多國(guó)家在過(guò)去20 年內(nèi)發(fā)病率持續(xù)增長(zhǎng)，由于鼻咽的解剖部位深在，解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，病理主要為非角化型未分化癌以及易出現(xiàn)頸部淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，在初診的患者中，Ⅲ、Ⅳ期鼻咽癌約占總病例的60%左右［1－2］。目前，放射治療是無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移鼻咽癌首選和主要的治療方法，但晚期鼻咽癌(Ⅲ、Ⅳ期) 因易局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，5 年生存率約40%～70%［3］。因此，尋求高效、低毒的放療增敏劑成為研究的熱點(diǎn)。

鉑類藥物在細(xì)胞內(nèi)形成DNA 蛋白質(zhì)交聯(lián)，在DNA 中形成鏈間和鏈內(nèi)交聯(lián)，細(xì)胞通過(guò)修復(fù)這些交聯(lián)使DNA 鏈斷裂［4］。奈達(dá)鉑是第二代鉑類抗腫瘤藥物，胃腸道反應(yīng)和腎毒性均明顯低于順鉑，本實(shí)驗(yàn)將奈達(dá)鉑應(yīng)用于鼻咽癌細(xì)胞上，通過(guò)觀測(cè)鼻咽癌細(xì)胞增殖、凋亡和周期的改變，探索奈達(dá)鉑對(duì)鼻咽癌細(xì)胞是否有放療增敏作用及其增敏的相關(guān)機(jī)制，為探索鼻咽癌治療的新策略提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 材料:人鼻咽癌CNE－2 細(xì)胞株由廣東醫(yī)學(xué)院病理教研室贈(zèng)送，用含10%胎牛血清(Gibco 公司)的RMPI－1640 培養(yǎng)液(Gibco 公司)，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 試劑:NDP 購(gòu)自南京先聲東元制藥有限公司，批號(hào):11－120301，新生胎牛血清，RPMI－1640 細(xì)胞培養(yǎng)基及胰蛋白酶購(gòu)自Gibco 公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物科技有限公司，CCK－8 試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所。

1.1.3 主要儀器:CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)，倒置顯微鏡(Olympus)，低速離心機(jī)(中佳光電)，酶標(biāo)儀，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Coulter 公司)。

1.2 方法

1.2.1 CCK－8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖影響:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CNE－2 細(xì)胞以每孔1.0×105個(gè)細(xì)胞接種至96 孔板，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至60%～70%細(xì)胞融合后，加入含不同濃度的NDP(4 mg/L、8 mg/L、16 mg/L、32 mg/L、64mg/L)新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)，每個(gè)濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組(沒(méi)有NDP處理)和空白組(沒(méi)有細(xì)胞);共同培養(yǎng)48h，棄去培養(yǎng)基，每孔加入含CCK－8 10 μl 的100 μl 培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)孵育至培養(yǎng)液呈黃色;在酶標(biāo)儀上測(cè)定每孔450 nm 吸光值(A)，計(jì)算不同濃度藥物的生長(zhǎng)抑制率;計(jì)算公式:腫瘤細(xì)胞抑制率=(未處理組吸光值－藥物組吸光值)/未處理組吸光值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值分析各組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。并計(jì)算IC50。

1.2.2 克隆形成試驗(yàn)分析放射增敏作用:將細(xì)胞分組進(jìn)行不同處理:對(duì)照組，NDP 組，單純放療組，NDP +放射組;其中對(duì)照組和NDP 組接種細(xì)胞數(shù)100 個(gè)，單純放療組和NDP+放射組則根據(jù)照射劑量的不同將不同數(shù)量(100，200，500，3 000，5 000，10 000)的細(xì)胞接種于不同的6 孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后依次進(jìn)行不同劑量的照射(0、2、4、6、8、10 Gy)。照射源為(6 Mv X 線)直線加速器，距靶源100 cm，照射野大小為20×20 cm2，照射角度為180 度，把培養(yǎng)皿置于照射野中心照射，培養(yǎng)皿內(nèi)液體高度3 mm，培養(yǎng)皿底部加1 cm 厚補(bǔ)償膜;照射后在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 天，以無(wú)水乙醇固定，結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)≥50 個(gè)細(xì)胞的克隆。根據(jù)各照射劑量點(diǎn)的存活分?jǐn)?shù)作圖，利用單擊多靶模型方程擬合細(xì)胞存活曲線，求出D0，并計(jì)算放療增敏比(SER)。SER=D0 值(單純照射組)/D0值(照射加藥組)。

1.2.3 AnnexinV－FITC/PI 雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況:將CNE－2 細(xì)胞種于6 cm 培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)至60%～70%細(xì)胞融合后，將細(xì)胞分成四個(gè)處理組:對(duì)照組，NDP 組，單純放療組，，NDP+放射組(單純放療組為單次射線照射4 Gy，NDP 組為其作用48 h，NDP 聯(lián)合放療組為單次射線照射4 Gy 后，NDP 繼續(xù)培養(yǎng)至48 h)。處理48 h 后，收集細(xì)胞，加入AnnexinV－FITC、PI 后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值分析各組細(xì)胞的凋亡率。

1.2.4 PI 法檢測(cè)細(xì)胞周期變化:將CNE－2 細(xì)胞種于6 cm 培養(yǎng)皿中，待培養(yǎng)至60%～70%細(xì)胞融合后，將細(xì)胞分成四個(gè)處理組:對(duì)照組，NDP 組，單純放療組，，NDP+放射組(單純放療組單次射線照射4 Gy，hTRR 組為其作用48 h，hTRR 聯(lián)合放療組為hTRR 培養(yǎng)48 h，4 Gy 射線照射)。處理48 h，收集細(xì)胞，70%冷乙醇500 微升固定，4 攝氏度保存過(guò)夜;重新收集細(xì)胞，加100 微升RNA 酶，37 攝氏度水浴反應(yīng)30 分鐘;加入400 微升PI，避光反應(yīng)30 分鐘;流式細(xì)胞儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值分析細(xì)胞周期。

2 結(jié)果

2.1 NDP 對(duì)CNE－2 細(xì)胞增殖的影響及IC50值:不同濃度NDP 作用CNE－2 細(xì)胞48 h 后，酶標(biāo)檢測(cè)儀測(cè)定各孔的光吸度并計(jì)算其抑制率。藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用如圖1、圖2 所示:NDP 呈劑量依賴性抑制鼻咽癌CNE－2 細(xì)胞的生長(zhǎng)。且NDP 作用48 h 的50%抑制濃度IC50為32.576 mg/L。為減小NDP 本身對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，以下試驗(yàn)中選取1/5 的IC50(6.515 mg/L)濃度，觀察NDP 對(duì)CNE－2 細(xì)胞放射增敏作用、凋亡和周期分布改變的影響。

圖1 NDP 對(duì)鼻咽癌CNE－2 細(xì)胞的增殖抑制作用

圖2 NDP 抑制鼻咽癌CNE－2 細(xì)胞的增殖

2.2 NDP 聯(lián)合放療增強(qiáng)CNE－2 細(xì)胞的放射敏感性:按分組要求處理細(xì)胞，培養(yǎng)12 d 后，計(jì)算各處理組細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)，見表1。采用Sigmaplot 10.0 軟件按單擊多靶模型SF=1－(1－e－D/D0)N擬合各組劑量存活曲線，見圖3，可得出各組N、Do、SF2 值，見表2，計(jì)算放射增敏比(SER)為:SER=Do(單純放射組)/Do(加藥后照射組)=1.542。

表1 NDP 聯(lián)合不豈劑量對(duì)CNE－2 細(xì)胞克隆形成的影響

表2 單純放射組和NDP 加放射組D0、N、SF2 值

圖4 單純放射組和NDP 加放射組D0、N、SF2 值

如圖3 所示，這種經(jīng)擬合得出的Do、N 和SF2 值，可從不同方面反應(yīng)細(xì)胞的放射敏感性:Do 為平均致死劑量，為照射殺滅63%細(xì)胞所需的劑量，Do 越大，表示細(xì)胞放射抗拒性越強(qiáng);N 值為外推值，反映細(xì)胞對(duì)放射引起損傷的修復(fù)能力，N 值越大表示細(xì)胞修復(fù)能力越強(qiáng)，殺死細(xì)胞所需射線劑量越大，放射抗拒性增強(qiáng);2Gy 時(shí)存活分?jǐn)?shù)SF2 是代表細(xì)胞放射敏感性的重要指標(biāo)，其中SF2 越大，表示放射抗拒性越強(qiáng)。從存活曲線可以看出，NDP 能明顯增加CNE－2 細(xì)胞對(duì)放射的敏感性，放射增敏比(SER)為1.542。

2.3 NDP 聯(lián)合放療誘導(dǎo)CNE－2 細(xì)胞的凋亡:經(jīng)AnnexinVFITC 和PI 雙染后，正常的活細(xì)胞不被AnnexinV－FITC 和PI染色(左下象限)，凋亡早期的細(xì)胞僅被AnnexinV－FITC 染色，PI 染色呈陰性(右下象限)，壞死細(xì)胞和凋亡晚期的細(xì)胞可同時(shí)被AnnexinV－FITC 和PI 染色(右上象限)，左上象限出現(xiàn)的是許可范圍內(nèi)的誤差。處理48 h 后，計(jì)算早期和晚期凋亡率，結(jié)果如圖4、5 所示:與對(duì)照組相比，NDP 組、單放組及NDP 聯(lián)合放療組的細(xì)胞凋亡率皆增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=277.76，P ＜0.01)，其中NDP+放療組誘導(dǎo)凋亡作用最明顯，凋亡率達(dá)(44.3±1.85)%，顯著高于NDP 組或單放組(P ＜0.01)，表明NDP 可顯著誘導(dǎo)CNE－2 細(xì)胞的凋亡，且NDP 聯(lián)合放療可增強(qiáng)誘導(dǎo)CNE－2 細(xì)胞凋亡。

圖5 CNE－2 細(xì)胞凋亡率

2.4 NDP 聯(lián)合放療對(duì)CNE－2 細(xì)胞周期的作用:細(xì)胞在兩次有絲分裂之間的時(shí)間被稱為細(xì)胞周期，處在增殖分裂過(guò)程的細(xì)胞首先經(jīng)歷G1期(DNA 合成前期)，RNA 迅速合成，并指導(dǎo)大量多種新蛋白質(zhì)和其他分子的合成。隨后進(jìn)入S 期(DNA 合成期)，進(jìn)行DNA 的復(fù)制。再之后是G2期(DNA 合成后期)，這是有絲分裂的準(zhǔn)備期。然后是M 期(有絲分裂期)。細(xì)胞分裂周期不同時(shí)相是影響細(xì)胞放射敏感性的重要因素，處于分裂周期不同時(shí)相的細(xì)胞放射敏感性有很大的差異。有研究證實(shí)，鼻咽癌CNE2 細(xì)胞S 期細(xì)胞對(duì)放射抗拒，M 期和G2期的細(xì)胞放射敏感性高，細(xì)胞G1/G0期較長(zhǎng)，G1早期放射抗拒，G1晚期放射敏感。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3 和圖6 所示，對(duì)照組細(xì)胞大部分處在G1/G0期，其次是S 期，G2/M 期細(xì)胞只占少量。單純照射組產(chǎn)生明顯的G2期阻滯，G2/M、S 期細(xì)胞比例增加，G1/G0期比例降低。單純放射組S 比例增大可能是細(xì)胞受放射損傷后，對(duì)放射線不敏感的S 期細(xì)胞存活，S 期細(xì)胞比例相對(duì)增加。單純NDP組G2/M、S 期細(xì)胞比例與對(duì)照組無(wú)明顯差異，NDP 聯(lián)合放療與單純放療相比，G2/M、S 期細(xì)胞也無(wú)明顯差異。因此，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，NDP 對(duì)CNE－2 細(xì)胞周期分布的改變無(wú)明顯影響。

表3 NDP、放療對(duì)CNE－2 細(xì)胞周期分布的影響(%)

圖6 PI 單染檢測(cè)細(xì)胞周期

3 討論

奈達(dá)鉑化學(xué)名為順－甘醇酸二氨合鉑，由日本鹽野義制藥公司研發(fā)，1995 年6 月在日本上市，是順鉑的類似物，但胃腸道和腎毒性均明顯低于順鉑，且部分對(duì)順鉑耐藥的患者，改用奈達(dá)鉑后仍可取得一定的療效［5］。臨床上主要用于食管癌、肺癌、頭頸部腫瘤、膀胱癌、宮頸癌等實(shí)體腫瘤的治療［6－10］。

腫瘤細(xì)胞的增殖周期是指一個(gè)細(xì)胞株倍增時(shí)間，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度與細(xì)胞增殖周期時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。來(lái)源相同的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞相比較，周期經(jīng)歷的時(shí)間大致上是一樣的，但腫瘤細(xì)胞以不受機(jī)體控制的方式增殖，細(xì)胞數(shù)量也不斷地?zé)o限制地增加［11］。因此，抗腫藥物瘤抑制腫瘤細(xì)胞的增殖對(duì)腫瘤治療起著非常重要的作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NDP 呈劑量依賴性抑制鼻咽癌CNE－2 細(xì)胞的生長(zhǎng)，在NDP 濃度64 mg/L 時(shí)，抑制率達(dá)(91±1.68)%，且NDP 作用48h 的50%抑制濃度IC50 為32.576 mg/L。為了減小NDP 本身對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，選取1/5的IC50(6.515 mg/L)濃度進(jìn)行凋亡、周期和克隆形成的實(shí)驗(yàn)研究。

輻射能(mdiant eneFgy)是射線本身具有的能量，是放療發(fā)揮抗癌作用的關(guān)鍵，即當(dāng)細(xì)胞吸收任何形式的輻射能量后，射線與細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)發(fā)生作用而間接或者直接地?fù)p傷細(xì)胞DNA，引起細(xì)胞死亡［12］。直接損傷表現(xiàn)在射線直接作用于DNA，引起DNA 分子出現(xiàn)交聯(lián)、斷裂［13］。間接損傷表現(xiàn)在射線對(duì)人體組織間液發(fā)生電離，產(chǎn)生自由基，產(chǎn)生的自由基再和生物大分子發(fā)生作用，形成不可逆損傷，引起細(xì)胞死亡［14］。因而，影響放射效應(yīng)的因素都是和這2 種效應(yīng)有關(guān)系的因素。主要有放射損傷修復(fù)能力、氧效應(yīng)(oxygen effect)以及存在輻射耐受細(xì)胞等因素［15］。放療后引起的細(xì)胞損傷修復(fù)能力的大小可以經(jīng)N 值來(lái)判斷，N 增大表示細(xì)胞修復(fù)能力增強(qiáng)，殺死細(xì)胞所需劑量增大，放射抗拒性增強(qiáng)［16］;本試驗(yàn)經(jīng)細(xì)胞存活曲線證實(shí)了NDP 對(duì)CNE－2 細(xì)胞的放射增敏作用，從細(xì)胞存活曲線的參數(shù)來(lái)看，NDP+放射組的N 值明顯小于單純放療組，D0 和SF2 值也小于單純放療組，放射增敏比為1.542。說(shuō)明NDP+放療能降低細(xì)胞的損傷修復(fù)，從而使細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)降低。是奈達(dá)鉑放療增敏的一種機(jī)制。

隨著腫瘤形成機(jī)制以及放射和藥物作用機(jī)制的闡明，放療增敏的概念已包括細(xì)胞微環(huán)境，血管形成，放射所致細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，DNA 損傷和細(xì)胞周期紊亂、凋亡、分化等多個(gè)非常復(fù)雜的領(lǐng)域［17］。目前，放射增敏主要集中在基因水平和放射增敏劑兩個(gè)方面［18］。放射增敏劑有鉑類藥物、抗代謝藥物、紫杉烷類和微管穩(wěn)定藥物、靶向藥物等［19］。奈達(dá)鉑是新一代鉑類抗腫瘤藥物，其進(jìn)入細(xì)胞后，甘醇酸酯配基上的醇性氧與鉑之間的鍵斷裂，鉑與水結(jié)合形成多種離子型物質(zhì)，以與順鉑相同的方式和DNA 結(jié)合，抑制DNA 的復(fù)制或通過(guò)自由基形成而產(chǎn)生毒性中間產(chǎn)物發(fā)揮抗腫瘤作用［20］。本研究得出，與對(duì)照組相比，奈達(dá)鉑組、單放組及奈達(dá)鉑聯(lián)合放療組的細(xì)胞凋亡率皆增多，其中NDP 組、單純放療組凋亡率為(30.4+2.17)%、(22.7+2.24)%(P ＜0.05)，NDP 加放療組凋亡率最高，顯著高于NDP組或單放組，為(44.3+1.85)%(P ＜0.01)。表明NDP 可顯著誘導(dǎo)CNE－2 細(xì)胞的凋亡，且NDP 聯(lián)合放療可增強(qiáng)誘導(dǎo)CNE－2 細(xì)胞凋亡。凋亡被認(rèn)為是一種重要的放射敏感性指標(biāo)，有文獻(xiàn)報(bào)道，放療是通過(guò)誘導(dǎo)凋亡發(fā)生來(lái)達(dá)到治療目的的［21－22］。如上所述，NDP 可顯著誘導(dǎo)CNE－2 細(xì)胞的凋亡，說(shuō)明通過(guò)誘導(dǎo)凋亡增加而增加細(xì)胞對(duì)放射線的敏感性是奈達(dá)鉑對(duì)鼻咽癌放射增敏的一種機(jī)制。

根據(jù)奈達(dá)鉑抗腫瘤作用機(jī)制是引起雙鏈DNA 破裂，對(duì)放射線最不敏感的S 期細(xì)胞應(yīng)該明顯減少，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單純NDP 組G2/M、S 期細(xì)胞比例與對(duì)照組無(wú)明顯差異，NDP 聯(lián)合放療與單純放療相比，G2/M、S 期細(xì)胞也無(wú)明顯差異。因此，本研究表明NDP 對(duì)CNE－2 細(xì)胞周期分布的改變無(wú)明顯影響。奈達(dá)鉑是否會(huì)通過(guò)改變周期分布起放射增敏有待進(jìn)一步的研究。

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