不同劑量右美托咪定預(yù)處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷以及炎癥反應(yīng)的影響＊

吳志林， 褚淑娟， 姚尚龍， 伍 靜

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院麻醉科，武漢 430022

急性缺血性心臟病是目前危害人類健康和導(dǎo)致死亡的最常見的疾病之一。為挽救瀕死心肌需要及時(shí)恢復(fù)血供，然而缺血區(qū)的再灌注有時(shí)會加速心肌死亡，導(dǎo)致梗死范圍擴(kuò)大，這就是心肌缺血再灌注損傷。尋找新的策略減輕這種損傷是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［1］。右美托咪定是一種常用于麻醉的輔助鎮(zhèn)靜的高選擇性α2腎上腺素能受體激動(dòng)劑。研究表明右美托咪定可以減輕冠狀動(dòng)脈旁路移植手術(shù)應(yīng)激反應(yīng)，維持血流動(dòng)力學(xué)的穩(wěn)定［2］，還能減輕心臟病患者非心臟手術(shù)時(shí)的心肌損傷，降低炎癥因子的水平［3］。本研究擬觀察不同劑量右美托咪定對大鼠心肌缺血再灌注的保護(hù)作用，并對可能機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性SD大鼠40只，體重300～350g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，隨機(jī)（隨機(jī)數(shù)字表法）分為假手術(shù)組（Sham組），心肌缺血再灌注組（I／R組），常規(guī)劑量右美托咪定預(yù)處理組（Dex1組），大劑量右美托咪定預(yù)處理組（Dex2組），每組10只。

1.2 動(dòng)物模型制備及各組實(shí)驗(yàn)方法

大鼠經(jīng)腹腔注射50mg／kg戊巴比妥鈉，麻醉后固定于操作臺，分離股靜脈置管，Dex1組給予右美托咪定5μg／kg負(fù)荷劑量，然后以5μg／（kg·h）持續(xù)輸注1h，Dex2組給予右美托咪定10μg／kg負(fù)荷劑量，然后以10μg／（kg·h）持續(xù)輸注1h，I／R組給予等量生理鹽水輸注1h，連接powerlab心電采集系統(tǒng)，記錄心電圖，輸注完畢后分離暴露并切開氣管，插入氣管導(dǎo)管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，潮氣量10 mL／kg，頻率80～100次／min，剪開左側(cè)胸壁，暴露胸腔，剪開心包膜，暴露心臟，結(jié)扎冠脈左前降支30 min，再灌注120min，以心電圖出現(xiàn)ST段抬高或與高聳T波融合為結(jié)扎成功的標(biāo)志，建立心肌缺血再灌注模型。而Sham組僅穿線不結(jié)扎，Sham組手術(shù)前后心電圖ST段無明顯變化，作為陰性對照組，在此僅為了證明模型是否成功，Sham組不參與統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 標(biāo)本采集和測定

I／R組、Dex1組和Dex2組在再灌注結(jié)束后抽血2mL，靜置30min后4℃，3 000r／min離心20 min，分離血清凍存?zhèn)溆茫捎肊LISE檢測血清腫瘤壞死因子α（TNF-α），白細(xì)胞介素6（IL-6）的含量。抽血后迅速取下心臟，摘除部分結(jié)扎線以下左心室心肌，冰浴中制備成10%的組織勻漿，按試劑盒說明書，測定各組心肌丙二醛（MDA），超氧化物歧化酶（SOD）的含量，經(jīng)預(yù)冷的0.01mmol／L PBS漂洗，－20℃冷凍20min后，從心尖沿心臟長軸連續(xù)切片，以2%氯化三苯基四唑（TTC）染色，染色完畢4%多聚甲醛固定，以Image J圖像分析軟件計(jì)算心肌梗死面積。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有計(jì)量資料采用±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 炎癥因子TNF-α、IL-6的變化

Dex1組和 Dex2組與I／R 組相比 TNF-α、IL-6均有所降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；Dex1組和Dex2組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 各組炎癥因子TNF-α、IL-6的比較（±s，n＝10）Table 1 Comparison of the changes of inflammatory factor TNF-αand IL-6（±s，n＝10）

表1 各組炎癥因子TNF-α、IL-6的比較（±s，n＝10）Table 1 Comparison of the changes of inflammatory factor TNF-αand IL-6（±s，n＝10）

與I／R組比較，＊P＜0.05

組別 TNF-α（pg／mL） IL-6（pg／mL）R 26.5±5.8 41.2±6.5 Dex1 18.5±5.4＊ 32.1±4.9＊Dex2 19.4±5.2＊ 31.1±5.4 I／＊

2.2 心肌組織MDA和SOD的變化

Dex1組和Dex2組與I／R組相比SOD升高，MDA降低（均P＜0.05），而Dex1組和Dex2組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 心肌組織MDA和SOD的比較（±s，n＝10）Table 2 Comparison of MDA and SOD in myocardial tissue（±s，n＝10）

表2 心肌組織MDA和SOD的比較（±s，n＝10）Table 2 Comparison of MDA and SOD in myocardial tissue（±s，n＝10）

與I／R組比較，＊P＜0.05

組別 SOD（U／mg） MDA（nmol／mg）R 39.0±5.2 15.3±3.5 Dex1 67.0±4.8＊ 13.5±5.2＊Dex2 70.0±6.3＊ 12.3±4.2 I／＊

2.3 各組心肌梗死面積的比較

采用TTC染色，經(jīng)Image J圖像分析軟件計(jì)算I／R組梗死面積為（59.23±4.35）%，Dex1 組和Dex2組 分 別 為 （47.22±3.98）% 和 （48.56±4.59）%，兩組與I／R組相比均顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而Dex1組和Dex2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

圖1 I／R組、Dex1組和Dex2組心肌組織TTC染色Fig.1 TTC staining of myocardial tissue in group Dex1，Dex2and I／R

3 討論

心肌缺血再灌注后的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是造成心肌損傷的機(jī)制之一，缺血再灌注后抗氧化物質(zhì)的消耗，氧化后毒性產(chǎn)物的增加，激活體內(nèi)的炎癥反應(yīng)進(jìn)一步損害心肌，導(dǎo)致梗死后范圍的擴(kuò)大，因此通過各種方法減弱氧化應(yīng)激，降低炎癥反應(yīng)是減輕心肌缺血再灌注損傷的治療策略之一［4］。對臟器預(yù)先進(jìn)行短暫的缺血再灌注處理后，通過調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)，激活神經(jīng)傳導(dǎo)通路，可以提高組織器官抗缺血再灌注損傷的能力，這就是缺血預(yù)處理（ischemic preconditioning，IPC）。目前認(rèn)為IPC是一種最為有效的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制。但是由于人為的缺血預(yù)處理的個(gè)體差異，安全時(shí)限等存在爭議，其臨床應(yīng)用受到限制。因此人們嘗試使用藥物進(jìn)行預(yù)處理，希望達(dá)到缺血預(yù)處理類似的保護(hù)作用，許多實(shí)驗(yàn)表明阿片類藥物、揮發(fā)性麻醉藥預(yù)處理都能產(chǎn)生一定程度的保護(hù)作用［5－6］。

右美托咪定是一種高選擇性的α2腎上腺能受體激動(dòng)劑，可通過降低TNF－α的表達(dá)，減輕大鼠腸道缺血再灌注損傷［7］；抑制中樞的交感活性，調(diào)節(jié)腦血流和腦氧供，改善缺血區(qū)域的血流灌注，減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，具有神經(jīng)保護(hù)作用［8］，在本研究中我們嘗試使用2種不同劑量的右美托咪定對心肌缺血再灌注損傷大鼠模型進(jìn)行預(yù)處理，一種是常規(guī)劑量，以5μg／kg作負(fù)荷劑量，然后以5μg／（kg·h）持續(xù)輸注，另一種為大劑量（Dex2組），劑量加倍，以10μg／kg為負(fù)荷劑量，然后以10μg／（kg·h）持續(xù)輸注，建立大鼠體內(nèi)心臟缺血再灌注模型，觀察這2種劑量預(yù)處理后的效果。

多種炎癥因子參與心肌缺血再灌注的損傷，包括 TNF－α、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12等，這些炎癥因子與缺血再灌注后無復(fù)流現(xiàn)象的發(fā)生及心肌梗死面積擴(kuò)大密切相關(guān)，其中TNF－α由心肌缺血再灌注早期的心肌細(xì)胞和單核／巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。在TNF－α和氧自由基的共同作用下，可激活對缺血再灌注損傷起到關(guān)鍵作用的炎癥反應(yīng)上游的核因子－κB，導(dǎo)致炎癥放大，IL-6可直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞，促進(jìn)急性期蛋白合成，誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)，催化和放大炎癥反應(yīng)［9］。多項(xiàng)研究表明 TNF－α、IL-6和氧化應(yīng)激與缺血再灌注心肌細(xì)胞損傷呈正相關(guān)［10－11］。我們發(fā)現(xiàn)右美托咪定預(yù)處理的Dex1組和Dex2組血清炎癥因子 TNF-α，IL-6與I／R組相比有明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明右美托咪定具有明顯的抗炎癥反應(yīng)的作用。

缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激相互作用，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的釋放，共同加重心肌細(xì)胞的損傷，SOD是一種重要的抗氧化劑之一，SOD是氧自由基的自然天敵，MDA是脂質(zhì)過氧化的最重要的產(chǎn)物之一，與缺血再灌注誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化密切相關(guān)。通過測定SOD和MDA可以反映機(jī)體抗氧化能力和膜脂質(zhì)過氧化的程度［12］。在本實(shí)驗(yàn)中對缺血再灌注心肌SOD和MDA的檢測發(fā)現(xiàn)，Dex1組和Dex2組與I／R組相比SOD活性增高，氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA下降（P＜0.05），通過對缺血再灌注心肌TTC染色后梗死面積測定發(fā)現(xiàn)Dex1組和Dex2組大鼠心肌梗死面積較I／R組有所縮?。ň鵓＜0.05）。

在常規(guī)劑量組（Dex1組）和大劑量組（Dex2組）兩組之間對比，這兩組大鼠缺血再灌注模型盡管采用了不同劑量的右美托咪定預(yù)處理，但是炎癥反應(yīng)指標(biāo)，氧化應(yīng)激和心肌梗死面積的差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示右美托咪定在心肌保護(hù)作用似乎存在藥物“封頂效應(yīng)”。

綜上所述，我們認(rèn)為右美托咪定預(yù)處理可以通過減輕氧化應(yīng)激，降低炎癥反應(yīng)對缺血再灌注心肌產(chǎn)生保護(hù)作用，但加大劑量后保護(hù)作用有限，是否因?yàn)榇髣┝康挠颐劳羞涠▽?dǎo)致血壓下降部分抵消了其抗炎癥和抗氧化作用，其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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