復方高滲鹽溶液對膿毒癥大鼠急性肺損傷的影響＊

董 芳， 徐 亮， 王華兵， 徐玲文， 揭鳳英

武漢市第三醫(yī)院重癥醫(yī)學科，武漢 430060

目前膿毒癥是ICU患者的主要死亡原因之一［1］，提高對該病的認識和防治水平無疑具有重要的理論價值及臨床意義。相關(guān)研究表明，高滲／高膠溶液對失血性休克有治療作用，且在臨床上已有一定 應(yīng) 用［2－6］。 本 研 究 通 過 盲 腸 結(jié) 扎 穿 孔 術(shù) （cecal ligation and puncture，CLP）建立膿毒癥大鼠模型，研究復方高滲鹽溶液對膿毒癥大鼠血漿免疫因子的調(diào)控作用，并觀察膿毒癥時急性肺損傷的相關(guān)指標，如動脈血氣、BALF中性粒細胞百分比，肺組織MPO活性，并統(tǒng)計各組大鼠生存率，探討復方高滲鹽溶液對膿毒癥大鼠急性肺損傷的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及構(gòu)建動物模型

雄性 Wistar大鼠133只，10～12周齡，體重230～280g。以3%戊巴比妥鈉（30～50mg／kg）腹腔內(nèi)注射對大鼠實施麻醉。行左側(cè)頸靜脈分離置管，經(jīng)頸靜脈置管給藥，經(jīng)頸動脈置管處采集動脈血標本用于監(jiān)測。采用CLP法制備大鼠膿毒癥模型，常規(guī)腹部消毒，皮膚正中切口，切口長約2～3cm，打開腹腔，游離腸系膜及盲腸，以3-0絲線環(huán)行結(jié)扎盲腸根部，用9號針頭于盲端部位穿刺2處，兩針孔相距約3mm，還納腸管，保證腸道通路正常，逐層縫合關(guān)腹，補充體液丟失，碘伏消毒并包扎傷口。假手術(shù)組除不結(jié)扎和穿刺盲腸外，其余手術(shù)步驟相同。

1.2 實驗動物分組

實驗動物隨機分為4組：SOP組（15只），術(shù)畢皮下注射 NS，30mL／kg；CLP組（45只），術(shù)畢皮下注射 NS，30mL／kg；CLP＋NS組（45只），術(shù)畢皮下注射NS，30mL／kg，術(shù)后3h自頸靜脈內(nèi)輸注NS，5mL／kg，輸液速度為 0.4mL／（kg·min）；CLP＋HSD組（28只），術(shù)畢皮下注射 NS，30mL／kg，術(shù)后3h自頸靜脈內(nèi)輸注 HSD，5mL／kg，輸液速度為0.4mL／（kg·min）。各組于手術(shù)0、9、18h采集血液標本，每采一次血，均立刻注射同等量的NS。手術(shù)后18hCLP組、CLP＋NS組、CLP＋HSD組分別取部分死亡動物，SOP組處死部分實驗動物，取肺組織用于檢測。

1.3 動脈血氣分析

各組大鼠分別于手術(shù)0、9、18h采集動脈血0.2 mL，用便攜式血氣分析儀（i-STAT，美國Abbott公司）檢測血pH，PaO2及PaCO2值。

1.4 各組大鼠生存率

各組大鼠分別于9h和18h統(tǒng)計生存率。

1.5 支氣管肺泡灌洗液（BALF）中性粒細胞比例

BALF的收集和細胞分類方法參照Reis等［7］及Callol等［8］研究報道。各組大鼠術(shù)后18h計算生存率后，處死部分大鼠，暴露氣管肺臟，結(jié)扎右支氣管，在環(huán)狀軟骨上用血管鉗固定氣管，其下做橫行切口，將7號塑料輸液管剪去針頭端，留出約10cm長的一段輸液軟管，將該段輸液管的一端插入氣管腔后以縫線固定，另一端固定在5mL注射器上。將37℃無菌生理鹽水2mL以注射器緩慢注入肺內(nèi)，間隔30s后回抽，重復3次，共收集支氣管肺泡灌洗液5mL。將收集到的支氣管肺泡灌洗液以3 000r／min離心10min，取沉淀的細胞進行涂片并行瑞氏染色。油鏡下計數(shù)100個細胞，按白細胞特征進行分類計數(shù)。計算公式為：中性粒細胞百分數(shù)（%）＝計數(shù)中性粒細胞個數(shù)／計數(shù)總細胞個數(shù)×100%。

1.6 肺組織髓過氧化物酶（MPO）活性測定

取部分右肺組織以MPO試劑盒（美國Sigma公司）提供的勻漿介質(zhì)制成肺組織勻漿，嚴格按試劑盒說明書步驟要求，測量各管吸光度值，根據(jù)說明書提供的公式，計算出MPO活力單位。

1.7 肺組織濕干重比測定

取部分右肺組織稱濕重，80℃烘干72h后稱干重，計算肺組織濕干重比值。

1.8 肺組織病理改變

CLP組、CLP＋NS組、CLP＋HSD組于術(shù)后18h取部分死亡大鼠（SOP組處死部分大鼠）右肺葉組織標本一小塊，置于甲醛液中固定（用10%磷酸緩沖液緩沖，pH值7.4）8h以上，乙醇脫水、石蠟包埋后，切成4μm切片，蘇木精－伊紅（HE）染色，光鏡下觀察組織病理學改變。

1.9 統(tǒng)計學方法

用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間均數(shù)的比較運用單因素方差分析，運用卡方檢驗比較各組大鼠生存率的差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組動物血漿中TNF-α、IL-1β水平測定

SOP組動物血漿中 TNF－α、IL-1β水平在9、18 h均無明顯變化，這表明剖腹手術(shù)對實驗動物的TNF-α、IL-1β的表達無明顯影響。CLP組及 CLP＋NS組動物血漿TNF－α水平在9h內(nèi)出現(xiàn)明顯升高，在其后的9h內(nèi)達到高峰。整個實驗階段，CLP＋HSD組的血漿TNF－α水平均顯著低于CLP組及CLP＋NS組，差異有統(tǒng)計學意義（表1）。監(jiān)測CLP組及CLP＋NS組動物的血漿IL-1β值表達水平，9、18h時間點急劇升高達到峰值。而接受HSD治療的CLP動物組血漿IL-1β水平出現(xiàn)雙相變化，9 h和18h時間點該組動物血漿IL-1β水平均顯著低于CLP組及CLP＋NS組，差異有統(tǒng)計學意義（表1）。

表1 各組大鼠不同時間點TNF-α、IL-1β水平比較（±s）Table 1 Comparison of TNF-αand IL-1βlevels of rats in each group at different time points（±s）

表1 各組大鼠不同時間點TNF-α、IL-1β水平比較（±s）Table 1 Comparison of TNF-αand IL-1βlevels of rats in each group at different time points（±s）

與CLP＋HSD組比較，＊P＜0.05；括號內(nèi)為動物數(shù)

組別 TNF-α（ng／L）IL-1β（ng／L）18h SOP組 74.719±13.588（15）術(shù)前 術(shù)后9h 術(shù)后18h 72.331±14.583（15）術(shù)前 術(shù)后9h 術(shù)后76.610±11.314（15）56.553±12.642（15）60.123±14.174（15）76.610±11.317（15）250.103±41.574＊（16）CLP＋HSD組 75.081±15.586（28）240.681±42.543＊（14）CLP＋NS組 73.674±13.270（45）CLP組 74.812±19.127（45）335.036±54.282＊（28）356.610±56.541＊（14）329.673±45.792＊（26）60.912±10.413（45）273.660±39.621＊（28）349.680±52.401＊（16）284.190±57.184（24）58.130±12.349（45）263.468±32.362＊（26）263.457±42.575（18）59.176±11.242（28）219.281±39.214（24）195.978±39.057（18）

2.2 血氣分析

動脈血pH值：各組大鼠術(shù)后9h動脈血pH值均有輕度下降；術(shù)后18hCLP組及CLP＋NS組大鼠動脈血pH值持續(xù)下降，CLP＋HSD組動脈血pH值比CLP組及CLP＋NS組有所改善（P＜0.05）（表2）。動脈血PaO2：SOP組動脈血PaO2實驗期間無明顯變化；但CLP組及CLP＋NS組大鼠動脈血PaO2在前9h發(fā)生了急劇下降，后9h下降速度才逐漸變緩；CLP＋HSD組動脈血PaO2下降水平比CLP組及CLP＋NS組有明顯改善（P＜0.05）（表2）。動脈血PaCO2：術(shù)后18h內(nèi)SOP組動脈血PaCO2無顯著變化；術(shù)后9hCLP組、CLP＋NS組及CLP＋HSD組各組動脈血PaCO2均輕度上升，但各組之間無明顯差異。但術(shù)后18hCLP組及CLP＋NS組動脈血PaCO2進一步急劇升高，CLP＋HSD組動脈血PaCO2升高水平較CLP組及CLP＋NS組有明顯好轉(zhuǎn)（P＜0.05）（表2）。

表2 各組大鼠不同時間點ΔpH、ΔPaO2、ΔPaCO2水平比較（±s）Table 2 Comparison ofΔpH，ΔPaO2andΔPaCO2levels of rats in each group at different time points（±s）

表2 各組大鼠不同時間點ΔpH、ΔPaO2、ΔPaCO2水平比較（±s）Table 2 Comparison ofΔpH，ΔPaO2andΔPaCO2levels of rats in each group at different time points（±s）

與CLP＋HSD組比較，＊P＜0.05；括號內(nèi)為動物數(shù)

組別 ΔpH ΔPaO2（mmHg） ΔPaCO2（mmHg）18h SOP組 0.021±0.002（15）術(shù)后9h 術(shù)后18h 術(shù)后9h 術(shù)后18h 0.014±0.006（15）術(shù)后9h 術(shù)后2.006±1.013（15）2.013±1.010（15）0.323±0.015（15）1.140±0.002（15）12.634±2.138＊（16）CLP＋HSD組 0.031±0.006（24）11.472±6.115＊（14）CLP＋NS組 0.037±0.005（26）CLP組 0.042±0.007（28）0.181±0.009＊（14）33.014±5.012＊（28 0.179±0.005＊（16）40.003±6.007＊（14）1.651±0.048（28）31.045±4.113＊（26）0.030±0.003（18）39.014±7.421＊（16）2.782±0.193（26）18.018±2.509（24）19.926±3.320（18）2.145±0.172（24）6.785±1.194（18）

2.3 各組大鼠生存率

SOP組大鼠術(shù)后18h內(nèi)沒有發(fā)生死亡。CLP組9、18h生存率分別為62.2%、31.1%，比SOP組有顯著降低（P＜0.05）；接受生理鹽水治療的CLP大鼠9、18h生存率也較低，分別為57.8%、35.6%（P＜0.05）；CLP術(shù)后注射 HSD組大鼠9h、18h生存率分別為85.7%、64.3%，比CLP組及CLP＋NS組有明顯改善（均P＜0.05）（表3）。

表3 各組大鼠生存率比較（%）Table 3 Comparison of survival rate of rats in each group（%）

2.4 支氣管肺泡灌洗液中性粒細胞比例

CLP組及CLP＋NS組大鼠BALF中性粒細胞百分比較SOP組顯著升高，接受HSD治療的大鼠中性粒細胞百分比較CLP組及CLP＋NS顯著降低（均P＜0.05）（圖1）。

圖1 各組大鼠BALF中性粒細胞百分比Fig.1 Neutrophil counts in BALF of rats in each group

2.5 肺組織髓過氧化物酶活性

CLP組及CLP＋NS組大鼠肺組織MPO活性比SOP組明顯升高，CLP＋HSD組肺組織MPO活性比CLP組及CLP＋NS組顯著減低（均P＜0.05）（圖2）。

圖2 各組大鼠肺組織MPO活性Fig.2 Lung MPO activity of rats in each group

2.6 肺組織濕干重比值

CLP組及CLP＋NS組大鼠肺組織濕干重比值較SOP組明顯升高，而CLP＋HSD組肺組織濕干重比值則與SOP組接近，較CLP組及CLP＋NS組有明顯改善，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖3）。

圖3 各組大鼠肺組織濕干重比Fig.3 Lung wet／dry weight of rats in each group

2.7 肺組織病理改變

SOP組大鼠肺組織未見明顯異常病理改變。CLP組及CLP＋NS組肺組織明顯水腫、淤血，表現(xiàn)為浸潤性炎癥改變，肺泡腔滲液；肺間質(zhì)水腫、增生和變厚，伴大量炎性細胞浸潤。與CLP組及CLP＋NS組比較，CLP＋HSD組大鼠肺組織病理變化減輕，僅可見部分肺泡腔和間質(zhì)內(nèi)輕度炎性細胞浸潤（圖4）。

圖4 各組大鼠肺組織病理改變（蘇木精－伊紅染色，×200）Fig.4 Histopathological changes of lung tissues of rats in each group（hematoxylin-eosin staining，×200）

3 討論

膿毒癥發(fā)生時，機體釋放大量促炎介質(zhì)和抗炎介質(zhì)，多種炎性介質(zhì)之間相互作用，形成瀑式連鎖反應(yīng)［9］，過量炎性介質(zhì)作用常導致遠隔器官功能發(fā)生障礙［10］。急性肺損傷（ALI）是膿毒癥常見并發(fā)癥，在大量TNF－α、IL-1β等的刺激下，中性粒細胞聚集于肺內(nèi)微血管并持續(xù)活化，并釋放一系列損傷介質(zhì)，引起彌漫性肺泡損害，最終導致急性肺損傷［11－13］。同時，促炎因子TNF－α是炎癥介質(zhì)瀑式網(wǎng)絡(luò)級聯(lián)反應(yīng)的觸發(fā)因子，IL-1β位于網(wǎng)絡(luò)的中心［14］，兩者在炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）中具有重要地位。另外，膿毒癥時常伴隨微循環(huán)障礙，內(nèi)皮屏障功能喪失［15］。

急性肺損傷本質(zhì)是因肺泡毛細血管膜彌漫性損傷導致肺水腫和肺微不張，臨床表現(xiàn)為呼吸窘迫和頑固性低氧血癥的綜合征［16］。膿毒癥目前標準的液體復蘇均選擇等滲溶液，如0.9%氯化鈉溶液、乳酸林格氏液等，使用等滲液體復蘇需要較大劑量才能維持循環(huán)，其后果是使得大量液體滲漏入肺組織間隙造成組織水腫，加重微循環(huán)障礙所致的肺水腫和肺微不張。本研究發(fā)現(xiàn)，CLP術(shù)后注射HSD的實驗動物肺組織濕干重比有顯著改善，且光鏡下觀察，使用HSD治療的大鼠肺組織，炎性改變較對照組輕微，僅可見部分肺泡腔和間質(zhì)內(nèi)輕度炎性細胞浸潤，這可能與HSD滲透壓較高，經(jīng)血管輸入HSD后，短時間內(nèi)使得血管滲透壓升高，血管內(nèi)外產(chǎn)生的滲透壓梯度使組織間液、細胞內(nèi)液向肺微血管內(nèi)轉(zhuǎn)移，減輕了循環(huán)障礙所致的肺水腫和肺微不張。另外，使用高滲透壓的HSD只需要較小劑量就可達到上述效果，因此也避免輸注大量液體對機體產(chǎn)生不良影響［17］。

本研究顯示，使用HSD治療后的CLP實驗動物 TNF－α、IL-1β水平較 CLP組及 CLP＋NS組有明顯下降，但仍比SOP組高，可見HSD對TNF－α、IL-1β等促炎介質(zhì)并不是完全抑制，而是在一定程度上減低它們的表達水平，有助于保持全身炎癥反應(yīng)綜合征／代償性抗炎反應(yīng)（CARS）平衡，這可能是HSD調(diào)節(jié)膿毒癥時免疫紊亂的機制之一。另外，HSD使得TNF－α、IL-1β等促炎介質(zhì)過度釋放得到控制，可能在一定程度上抑制了中性粒細胞在肺內(nèi)微血管的過度活化，對急性肺損傷起到了一定的治療作用。最終的BALF中性粒細胞百分比、肺組織MPO、血氣結(jié)果也證實了使用HSD的大鼠臨床指標有一定改善。

大鼠生存率是臨床治療膿毒癥的重要目標。CLP＋HSD組大鼠在術(shù)后9h生存率為85.7%，比CLP及CLP＋NS組有明顯提高，雖然在術(shù)后18h生存率有所下降（64.3%），這可能意味著使用HSD為膿毒癥提供了更多的治療時間，如果在膿毒癥早期使用HSD的同時，配合其他綜合治療，后期生存率應(yīng)該會有進一步提高。

綜上所述，HSD可以調(diào)節(jié)膿毒癥造成的免疫紊亂，對膿毒癥大鼠出現(xiàn)的循環(huán)衰竭有明顯改善，能夠減輕膿毒癥急性肺損傷，對膿毒癥治療有多方面的作用，最終提高了膿毒癥大鼠生存率。但由于HSD滲透壓較高，輸注濃度、輸液量、輸注時機等有待于進一步臨床探討，且由于高滲透壓有可能導致的并發(fā)癥尚亦需進一步觀察。

［1］ 林瑾，劉培，莊海舟，等.重癥監(jiān)護病房419例重度膿毒癥患者的臨床分析［J］.中國危重病急救醫(yī)學，2014，26（3）：171-174.

［2］ 周其全，劉福玉，高鈺琪.不同滲透壓不同氧濃度液體對高原失血性休克大鼠復蘇效果的對比觀察［J］.中國危重病急救醫(yī)學，2008，20（7）：393-396.

［3］ 張漢生，袁世熒，姚尚龍.乳酸林格氏液、高滲鹽水和全血對失血性休克犬血液動力學的影響［J］.華中科技大學學報：醫(yī)學版，2002，31（1）：96-98.

［4］ 鄭國壽，白祥軍，占成業(yè)，等.高滲鹽水對創(chuàng)傷失血性休克兔促炎與抗炎細胞因子和黏附分子表達的影響及其意義［J］.中國急救醫(yī)學，2005，25（7）：498-500.

［5］ 花向揚，李和柏，陳瑞榮.高滲鹽水抗休克臨床觀察［J］.臨床薈萃，1999，14（1）：7-8.

［6］ 王宏梗，張良成，林財珠.高張鹽水羥乙基淀粉對創(chuàng)傷失血性休克大鼠早期肺損傷和中性粒細胞表達的影響［J］.中華麻醉學，2002，22（8）：503-504.

［7］ Reis A，Totsch M，Shennib H，et al.Bronchoalveolar lavage：results of sequential，selective techniques in viable murines［J］.Am J Respir Crit Care Med，1994，150（2）：547-550.

［8］ Callol L，Barbero E A，Blasco R，et al.New method of collection of bronchioloalveolar lavage in rat［J］.Respir Med，1994，88（5）：399.

［9］ Payen D，Monneret G，Hotchkiss R.Immunotherapy－apotential new way forward in the treatment of sepsis［J］.Crit Care，2013，17（1）：118.

［10］ 趙克森，金麗娟.休克的細胞和分子基礎(chǔ)［M］.北京：科學出版社，2002：315-316.

［11］ 李志軍.菌毒炎并治與多器官功能障礙綜合征［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2004，11（6）：381-383.

［12］ Downey G P，Dong Q，Kruger J，et al.Regulation of neutrophil activation in acute lung injury［J］.Chest，1999，116（Suppl.1）：46s-54s.

［13］ Doerschuk C M，Mizgerd J P，Kubo H，et al.Adhension molecules and cellular biomechanical changes in acute lung injury［J］.Chest，1999，166（Suppl.1）：37s-43s.

［14］ 欒櫻譯，姚詠明.膿毒癥中免疫負調(diào)控的研究進展［J］.中國病理生理雜志，2011，27（3）：616-619，624.

［15］ 馬曉春.應(yīng)加深對膿毒癥微循環(huán)功能障礙的認識［J］.中國危重病急救醫(yī)學，2011，23（2）：66-67.

［16］ Lee W L，Downey G P.Neutrophil activation and acute lung injury［J］.Curr Opin Crit Care，2001，7（1）：1-7.

［17］ Meybohm P，Cavus E，Bein B，et a1.Small volume resuscitation：a randomized controlled trial with either norepinephrine or vasopressin during severe hemorrhage［J］.J Trauma，2007，62（3）：640-646.