肺炎支原體肺炎誘導痰中肺炎支原體核酸檢測研究

彭寬志

肺炎支原體肺炎（MPP）是臨床上較為常見的兒童呼吸道感染疾病，肺炎支原體（MP）是常見病原體[1]。MPP的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，容易誤診[2]，為能夠早期確診MPP，避免貽誤病情，需要一種能夠快速、準確診斷MPP的檢查方法。MP核酸檢查在MPP的早期診斷中得到一定應(yīng)用，但關(guān)于其檢查敏感性和特異性的報道較少。本研究選擇了98例肺炎支原體肺炎（MPP）患兒，對比了MP-IgM、MP-DNA檢測結(jié)果與金標準培養(yǎng)法檢測結(jié)果的一致性，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年1月-2013年12月本院住院診斷為肺炎支原體肺炎98例患兒作為研究對象，所有患兒均符合《諸福棠實用兒科學》（第7版）關(guān)于MPP的診斷標準[3]，X線檢查提示為片狀陰影炎癥浸潤。其中男57例，女41例；年齡1~12歲，平均（6.2±1.3）歲；病程2~31 d，平均（18.4±5.9）d。98例患兒均采集痰液樣本置于-70 ℃冰箱中保存待檢。

1.2 誘導痰采集 誘導之前，為有效清潔患兒空腔、咽喉、后鼻部污染物，需進行充分漱口。以濃度為3%高滲鹽水超聲霧化吸入，若感覺有痰液隨時咳出到清潔平皿中，為避免出現(xiàn)支氣管痙攣問題，霧化時間不應(yīng)超過30 min。選取痰液標本時，取符合標準的痰液1 mL，加入等量的痰液蓄積保護液，旋渦震蕩3 min，使其均勻，并于4 ℃環(huán)境下2000 r/min離心10 min，取上清液，將采集到的痰液樣本置于-70 ℃冰箱中保存待檢。

1.3 檢測方法 肺炎支原體免疫球蛋白（MP-IgM）、肺炎支原體DNA（MP-DNA）的檢測均由廣州金域醫(yī)學檢驗中心完成。MP-IgM采用酶聯(lián)免疫吸附試驗，MP-DNA采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測。

1.4 統(tǒng)計學處理 使用PEMS 3.0軟件對統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行處理及分析，組間一致性采用Kappa檢驗，并以U檢驗排除抽樣誤差影響。以Kappa系數(shù)大小劃分6個區(qū)段的方法以表達結(jié)果一致性的強弱：（1）極差，Kappa系數(shù)<0；（2）差，Kappa系數(shù) 0~0.20；（3）弱，Kappa系數(shù) 0.21~0.40；（4）中度，Kappa系數(shù) 0.41~0.60；（5）高度，Kappa系數(shù) 0.61~0.80；（6）極強，Kappa系數(shù)0.81~1.00。

2 結(jié)果

MP-IgM、MP-DNA檢測結(jié)果的一致性較好，兩種檢測結(jié)果與金標準培養(yǎng)法檢測結(jié)果的一致性較好，見表1~3。

表1 MP-IgM、MP-DNA檢測結(jié)果的一致性 例

表2 MP-IgM與金標準培養(yǎng)法檢測結(jié)果的一致性 例

表3 MP-DNA與金標準培養(yǎng)法檢測結(jié)果的一致性 例

3 討論

肺炎支原體（MP）是兒童呼吸道感染的常見病原體，MPP是兒童呼吸道感染的常見疾病。嬰幼兒是MPP發(fā)病的高危群體[4]，但是其具體發(fā)病機制仍不十分清楚。一般認為，MP感染成為重癥肺炎的重要原因，MP會攻擊并破壞機體的免疫系統(tǒng)，導致免疫防御屏障不完整，在MP表面電子致密P1蛋白末端結(jié)構(gòu)的作用下，使其黏附于呼吸道黏膜上皮細胞上，進而破壞支氣管、細支氣管的黏膜層，破壞上皮纖毛活動，誘發(fā)陣發(fā)性咳嗽[5]。有試驗在MPP患兒的血液、腦脊液、皮膚水泡、胸水中分離出了MP，但是目前尚沒有權(quán)威資料證實MP侵入和MPP發(fā)病之間存在直接因果關(guān)系[6]。叢玲等[7]認為，細胞免疫與體液免疫在MPP的發(fā)病過程中擔任了非常重要的角色，其作用發(fā)揮方式包括激活B細胞和T細胞，激活NK細胞、細胞毒性T細胞以及巨噬細胞的溶細胞活力，激活免疫活性細胞并使其產(chǎn)生細胞白介素（如IL-2、IL-4、IL-6等）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，在炎性細胞因子的浸潤作用下，肺泡壁會逐漸增厚，導致組織損傷。有研究結(jié)果顯示，處于急性感染期的MPP患兒會出現(xiàn)明顯的細胞免疫功能抑制，表現(xiàn)為淋巴細胞對MP的反應(yīng)顯著降低，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等生物抗原的反應(yīng)性下降[8]。綜合上述分析可知，MPP患兒存在免疫系統(tǒng)平衡遭到破壞情況，T淋巴細胞遭到抑制，尤其是CD8+T細胞、B淋巴細胞被激活，導致體液免疫功能失調(diào)。盡管目前MPP的發(fā)病機制尚不明確，但有一點有非常明確的，MPP是多種因素綜合作用的結(jié)果，單一病因無法解釋肺外所有癥狀，MP對呼吸組織的直接侵犯作用不足以誘發(fā)MPP，而宿主免疫反應(yīng)改變在MPP發(fā)病過程中顯得更加重要。因此，臨床上普遍以免疫指標的變化情況作為MPP臨床診斷、輕重判定、治療和預(yù)后的重要依據(jù)。

免疫球蛋白M（IgM）分子質(zhì)量最大的免疫球蛋白，廣泛分布于體液中，占血清Ig的5%~10%，能夠有效抵御菌血癥的發(fā)生，在機體的早期免疫應(yīng)答中作用明顯[9]。IgM在胚胎發(fā)育晚期的胎兒即可以產(chǎn)生，是個體發(fā)育過程中最早合成和分泌的抗體；同時，IgM在初次體液免疫應(yīng)答中出現(xiàn)抗體的時機也最早，是機體抗感染的先鋒。如果血液檢測結(jié)果提示檢出IgM，則表明機體近期有感染，因此，IgM在臨床上通常用于感染疾病的早期診斷。IgM具有較強的溶血、溶菌功能，抗原結(jié)合能力和補體激活能力也較強。血液中的免疫復(fù)合物質(zhì)在其他器官當中也可沉積并使其受損，重癥MPP患兒多會伴發(fā)一種或多種肺外并發(fā)癥，如腦炎、心肌炎、腎小球腎炎以及溶血性貧血等。臨床經(jīng)驗顯示，抗體量和MPP的病情輕重存在高度相關(guān)性，也表明肺炎支原體肺炎患者存在著體液免疫功能紊亂情況。周岳年[10]研究認為，MPP的病程越長，MPIgM抗體的陽性率越高，患兒的感染程度、免疫功能均會影響肺炎支原體抗體的檢出率；另外，由于嬰幼兒的免疫系統(tǒng)尚未完全發(fā)揮作用，出現(xiàn)MP感染時，患兒有可能會發(fā)生不出現(xiàn)抗體的情況，對MP-IgM抗體的陽性率產(chǎn)生影響，最終影響檢查的準確性[11]。MP-IgM檢查的優(yōu)點在于操作簡單、檢測費用低，大約1 h內(nèi)便可以獲得檢測結(jié)果，有利于臨床的早期診斷；加之檢測時不需要特殊儀器，適于在基層醫(yī)院中廣泛推廣使用。在本研究中，MP-IgM抗體檢測結(jié)果與MP-DNA檢測、金標準培養(yǎng)法檢測結(jié)果均保持了較高的一致性，證實MP-IgM抗體檢測結(jié)果具有良好的準確性。

核酸是生命的最基本物質(zhì)之一，根據(jù)化學組成不同，核酸可分為核糖核酸（RNA）和脫氧核糖核酸（DNA）。相對于血清免疫學檢測方法，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法檢測MP-DNA檢出率的準確性要更高、特異性要更強、敏感性要更高。采用誘導痰檢測肺炎支原體DNA，樣本獲得簡便，且檢測時間短、特異性強、靈敏度高，抗體水平對檢測結(jié)果基本上沒有影響，只要標本中含有殘存的DNA片段，便可以檢出[12]。這在很大程度上彌補了肺炎支原體IgM高峰時間出現(xiàn)較晚，患兒免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不成熟，無法對MP做出正確免疫應(yīng)答等不足。雖然該方法的檢出準確率高，檢出結(jié)果時間較短（低于3 h），但是由于該方法需要特殊的檢測儀器，在推廣方面具有一定難度[13]。由于優(yōu)秀的第三方檢測機構(gòu)也能夠提供良好的MP-DNA檢測服務(wù)，可以在一定程度上解決上述問題。綜合來看，MP-IgM抗體檢測所需時間更短、費用更低，但是漏診率更高，適合于病程較長的患兒；MP-DNA檢測能夠了解MP在患兒體內(nèi)的感染與復(fù)制情況，對于早期診斷、疾病復(fù)發(fā)判定均有較大幫助。

在本研究中，MP-DNA檢測結(jié)果與金標準培養(yǎng)法檢測結(jié)果均保持了很好的一致性，表明MP-DNA檢測結(jié)果準確性很好，能夠為MPP的臨床診斷提供有益參考。另外，根據(jù)臨床經(jīng)驗，肺炎支原體IgM陽性的患兒的平均病程約為1周，所以，對于臨床上高度懷疑MPP患兒，可以在患兒1周病程內(nèi)采集誘導痰樣本進行肺炎支原體DNA檢測，而待患兒病程超過1周后再進行肺炎支原體IgM檢測，以提高診斷的可靠性，也能夠提高病情和預(yù)后判斷的科學性。對于免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善的年齡低于2周歲的患兒，可以采用同樣方法進行肺炎支原體DNA檢測，并對肺炎支原體IgM進行動態(tài)觀察，將兩種檢測方法進行有效結(jié)合，大幅度提高MP的檢出率，利于MPP的早期診斷和早期治療。綜上所述，筆者認為肺炎支原體核酸的檢測結(jié)果準確性較好，能夠為肺炎支原體肺炎的早期診斷提供一定參考，如兩種方法在臨床上相互結(jié)合使用能夠發(fā)揮最佳效果。

[1]羅劍紅.小兒支原體肺炎190例肺炎支原體DNA與超敏C反應(yīng)蛋白檢測及其應(yīng)用價值[J].陜西醫(yī)學雜志，2012，41（5）：613-615.

[2]吳宏圖，單春明，周楊楊.MP-DNA熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測在兒童肺炎支原體肺炎中的診斷價值[J].陜西醫(yī)學雜志，2011，40（1）：50-52.

[3]胡亞美，江裁芳.諸福棠實用兒科學[M].第7版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：1204-1205.

[4]陳恩利，孔路科.肺炎支原體檢測方法的臨床應(yīng)用[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2010，31（3）：267-268.

[5] Dorigo-Zetsma J W， Wilbrink B， Van der Nat H， et al. Results of molecular detection of Mycoplasma pneumoniae among patients with acute respiratory infection and in their household contacts reveals children as human reservoirs[J]. J Infect Dis，2001，183（4）：675-678.

[6]許愛玲，曲人亮，艾穎娟，等.濃縮一步法新型肺炎支原體核酸檢測試劑盒的臨床應(yīng)用初步評價[J].標記免疫分析與臨床，2014，21（3）：328-332.

[7]叢玲，劉月秋，唱麗敏，等.肺炎支原體IgM、肺炎支原體DNA檢測在支原體肺炎診斷中的應(yīng)用[J].中國誤診學雜志，2010，10（36）：8844.

[8]諸興桂，冉華樹.肺炎支原體DNA與血清炎性因子檢測在支原體肺炎患兒中的應(yīng)用[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2014，35（12）：1638-1640.

[9]王金俠，安寶清，唱麗敏，等.肺炎支原體PCR定量檢測在肺炎支原體肺炎中的應(yīng)用[J].中國誤診學雜志，2011，11（27）：6650-6651.

[10]周岳年.肺炎支原體肺炎患兒血清細胞因子及高敏C反應(yīng)蛋白、免疫球蛋白的檢測及其臨床意義[J].中國醫(yī)師進修雜志，2010，33（4）：40-41.

[11] Bhattacharjee R， Kheirandish-Gozal L，Pillar G， et al.Cardiovascular complications of obstructive sleep apnea syndrome：evidence from children[J]. Prog Cardiovasc Dis，2009，51（5）：416-433.

[12]郭曉輝，孫艷峰，郭山春，等.肺炎支原體肺炎患兒血清細胞因子、高敏C反應(yīng)蛋白、總免疫球蛋白及補體C的檢測及其臨床意義[J].中國醫(yī)師進修雜志，2011，34（10）：28-30.

[13]鐘禮立，彭力，黃寒，等.支氣管肺泡灌洗液熒光定量PCR對兒童肺炎支原體肺炎診斷研究[J].中國當代兒科雜志，2011，13（3）：191-194.