小兒肺炎的細(xì)菌學(xué)耐藥性分析與檢驗(yàn)質(zhì)量控制

趙延香

小兒肺炎是兒科常見病與多發(fā)病，嚴(yán)重影響患兒的健康[1]。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，小兒肺炎治療過程中的耐藥性問題日益突出，給臨床治療帶來了困難。解決這一問題的重要方法是進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)與藥敏試驗(yàn)，選擇有針對性的抗生素進(jìn)行治療。在小兒肺炎的診療過程中，臨床檢驗(yàn)尤其是細(xì)菌培養(yǎng)尤為重要，在細(xì)菌培養(yǎng)過程中的質(zhì)量控制顯得尤為關(guān)鍵[2]。臨床微生物室間質(zhì)量控制主要涉及到質(zhì)控管理機(jī)構(gòu)和參控實(shí)驗(yàn)室兩個(gè)方面，但歸根到底是提高參控實(shí)驗(yàn)室的理論水平和技術(shù)水平，從而提高微生物檢驗(yàn)質(zhì)量，更好地為患者服務(wù)[3]。質(zhì)量評定除了有外部機(jī)構(gòu)對常規(guī)實(shí)驗(yàn)室的工作質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)這個(gè)功能外，還可以被看成是在實(shí)驗(yàn)室外部設(shè)立的一個(gè)公眾質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)可以由一個(gè)或幾個(gè)參考實(shí)驗(yàn)室確定，也可以由眾多的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室確定，參照這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室可以進(jìn)行自我評價(jià)[4]。室間質(zhì)量評定的另一個(gè)作用就是減小或消除實(shí)驗(yàn)室間的誤差，使質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的可靠性更強(qiáng)，了解到的情況更全面[5]。本研究通過回顧性分析我院近3年以來診治的肺炎患兒的細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果與耐藥性分析，并且將檢驗(yàn)的質(zhì)量控制應(yīng)用與整個(gè)檢測過程中，獲得了滿意的結(jié)果，現(xiàn)將研究報(bào)告總結(jié)一下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究臨床資料來源于2011年1月-2014年12月濟(jì)鋼總醫(yī)院診治的小兒肺炎患兒共140例，其中有男童79例，女童61例，年齡3個(gè)月~14歲，平均（6.39±1.38）歲。所有患者都滿足典型的小兒肺炎的臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查與影像學(xué)特征，入院后對所有患兒均進(jìn)行痰培養(yǎng)加藥敏檢驗(yàn)。

1.2 方法 采用吸痰管吸痰的方法，進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)與藥敏試驗(yàn)。采用紙片擴(kuò)散法敏感試驗(yàn)，紙片擴(kuò)散法是利用瓊脂的特性來測定細(xì)菌對抗菌藥物的敏感性，操作方法簡便，易于推廣，適用于不同醫(yī)院臨床細(xì)菌室應(yīng)用，但因受紙片含藥量不均及接種菌液量等多種因素影響，其結(jié)果易出現(xiàn)偏差[6]。因此，國內(nèi)外對藥敏試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化問題進(jìn)行了多方面的研究和探討，以Kirby-Bauer紙片散法（簡稱K-B法）和對比法為主的藥敏檢測方法，把含有一定量抗菌藥物的紙片平貼在培養(yǎng)基之上，在紙片中的藥物可自然溶于培養(yǎng)基內(nèi)。并向四周呈圓形擴(kuò)散，藥物在瓊脂中的濃度距紙片越遠(yuǎn)，藥物濃度也隨之下降，用時(shí)瓊脂表面接種的細(xì)菌也開始生長，當(dāng)細(xì)菌被瓊脂內(nèi)的藥物所抑制時(shí)，也是該藥對該細(xì)菌的最低抑菌濃度，此時(shí)該細(xì)菌生長受到抑制，在含藥紙片周圍形成透明的抑菌環(huán)。敏感試驗(yàn)用培養(yǎng)基一般細(xì)菌用敏感試驗(yàn)用培養(yǎng)基或M-H瓊脂培養(yǎng)基即可，因上述兩種培養(yǎng)基絕大多數(shù)細(xì)菌均生長良好，對磺胺、甲氧芐胺嘧啶，四環(huán)素的抑制物含量低，瓊脂表面pH值變化小，按程序配方制備培養(yǎng)基，傾注平皿約4 mm厚，選擇9 cm大小的培養(yǎng)皿。干燥含藥紙片標(biāo)準(zhǔn)紙片的直徑規(guī)定為6.35 mm，標(biāo)準(zhǔn)空白濾紙一張，（30±4）mg/cm2；紙吸水性為本身重量的2.5~3.0倍，紙本身為中性，限紙中的緩沖物質(zhì)存在及二價(jià)金屬離子。標(biāo)準(zhǔn)比濁管的制備選管徑與制備菌液的相同的試管一支，管內(nèi)加生理鹽水或蒸餾水5.2 mL，取肥達(dá)氏反應(yīng)抗原一支（40億/mL）吸菌液0.2 mL，加入盛有生理鹽水的試管中，試管用膠塞塞緊，高壓消毒，取出后塞與管徑口處用石蠟封嚴(yán)，既成1.5億/mL左右的標(biāo)準(zhǔn)比濁管，此比濁管可用兩年[7]。

2 結(jié)果

2.1 患兒的細(xì)菌學(xué)構(gòu)成統(tǒng)計(jì) 在140例肺炎患兒中，總共檢測出了78株的致病菌，陽性率是55.7%，大部分是革蘭陰性菌，54株（69.2%），包括肺炎克雷伯菌15株（19.2%），大腸埃希菌12株（15.4%），嗜血桿菌10株（12.8%），銅綠假單胞菌8株（10.3%），陰溝腸桿菌5株（6.4%），鮑氏不動(dòng)桿菌3株（3.8%），產(chǎn)氣腸桿菌1株（1.3%）。革蘭陽性菌22株（28.2%），包括肺炎鏈球菌12株（15.4%），金黃色葡萄球菌6株（6.4%），表皮葡萄球菌4株（3.8%）。其他2株（2.6%）。

2.2 患兒的病原菌耐藥性統(tǒng)計(jì) 革蘭陰性菌大部分是對氨芐西林耐藥，主要的4種病原菌的耐藥率在80%以上，然后是對頭孢菌素類耐藥，在50%以上，而對亞胺培南與美洛培南敏感。革蘭陽性菌對青霉素及紅霉素耐藥，耐藥率在70%以上，對萬古霉素敏感，見表1~2。

2.3 質(zhì)量控制效果 在細(xì)菌培養(yǎng)與藥敏試驗(yàn)過程中，采用質(zhì)量控制，未出現(xiàn)嚴(yán)重不良事件，有效保障了臨床檢驗(yàn)的質(zhì)量。

3 討論

在小兒就診的疾病中，小兒肺炎的發(fā)病率較高，是小兒常見病與多發(fā)病，如不及時(shí)救治，死亡率較高[8]。小兒肺炎的病因較多，一般為微生物感染，微生物包括細(xì)菌、病毒、支原體、衣原體等[9]。隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，雖然小兒肺炎的臨床治療效果得到了很大提高，但同時(shí)也產(chǎn)生了很多問題，其中耐藥病原體的產(chǎn)生是難以回避的嚴(yán)重問題[10]。耐藥性的產(chǎn)生除了與細(xì)菌變異有關(guān)之外，抗生素的濫用同樣是重要原因，為了避免抗生素濫用，必須對患者進(jìn)行痰細(xì)菌培養(yǎng)與藥敏實(shí)驗(yàn)，選擇有針對性的抗生素，進(jìn)行“靶向治療”，既能夠起到良好的治療效果，同時(shí)又能盡可能的減少耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生[11]。在本次臨床研究中筆者發(fā)現(xiàn)了有24株的銅綠假單胞菌感染，此細(xì)菌是院內(nèi)感染的主要病原體，給臨床治療帶來了極大的困難[12]。

表1 革蘭陰性菌的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 革蘭陽性菌藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

所謂細(xì)菌培養(yǎng)是指自感染部位培養(yǎng)出致病菌是感染的直接證據(jù)，而且作細(xì)菌的藥物敏感性試驗(yàn)可指導(dǎo)臨床合理用藥。因此，細(xì)菌培養(yǎng)對細(xì)菌感染性疾病的診斷和治療是非常必要的[13]。細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)標(biāo)本的留取是第一步，也是關(guān)鍵的一步，如果標(biāo)本被污染，細(xì)菌的分離、鑒定則無法進(jìn)行，因此在留取標(biāo)本時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：（1）留取標(biāo)本一定要使用無菌容器；（2）正常無菌部位的標(biāo)本（如血液、腦脊液、胸水、腹水等）在留取時(shí)嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作技術(shù)；（3）有正常菌群生長的部位（如痰、糞便、眼結(jié)膜等部位）在取標(biāo)本時(shí)注意不要再被其他部位的細(xì)菌污染。留取尿液時(shí)要先清洗外陰，留取痰液時(shí)要先用生理鹽水漱口。

細(xì)菌對抗藥物的敏感試驗(yàn)，可進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查及對醫(yī)院內(nèi)感染調(diào)查提供依據(jù)，同時(shí)為臨床醫(yī)師的治療提供參考，為用藥提供依據(jù)。而指導(dǎo)臨床醫(yī)生和流行病醫(yī)生在某一時(shí)期應(yīng)使用何種抗菌藥物，并可減少院內(nèi)感染的發(fā)生。為了確保臨床細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)更好地發(fā)揮其在臨床診斷和治療中的重要作用，必須認(rèn)真搞好質(zhì)量控制工作[14]。然而，臨床細(xì)菌檢驗(yàn)工作本身是一門定性科學(xué)，其研究的主要對象是從各種臨床標(biāo)本中所分離培養(yǎng)出來的活的細(xì)菌。

每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都必須有一本指導(dǎo)日常工作、簡明扼要的操作規(guī)程。由衛(wèi)生部醫(yī)政司頒布的《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》是一本較適合各級醫(yī)院細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)資料，實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)自己的實(shí)際情況對該操作規(guī)程做適當(dāng)修訂，進(jìn)一步達(dá)到更高的技術(shù)水準(zhǔn)。修改操作規(guī)程的工作須由技術(shù)主管人員完成。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該保存參考菌株，有兩種簡便的保存方法。一種是高層瓊脂保存法，取長試管，最好是螺口試管，用營養(yǎng)瓊脂或MH瓊脂制成高層瓊脂，將細(xì)菌穿刺接種在培養(yǎng)基中，擰緊管帽或用膠塞塞緊，使不透氣，置避光處室溫或4 ℃冰箱保存[15]。用時(shí)開啟，移種到相應(yīng)的培養(yǎng)基，得到新鮮菌種，這種保存細(xì)菌方法，較長時(shí)間內(nèi)不會(huì)死亡。另一種是低溫保存法。將細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上增菌，用小牛血清或全羊血將菌落洗下，置三角瓶或其他容器中，再放入無菌玻璃珠，置-30 ℃以下低溫冰箱內(nèi)保存，需要時(shí)用無菌鑷子取出一粒玻璃珠置增菌培養(yǎng)基中，可獲得新鮮菌種。這種方法能長期保存細(xì)菌。

藥敏試驗(yàn)有紙片擴(kuò)散法和稀釋法兩種，質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)不一樣。紙片擴(kuò)散法為藥敏試驗(yàn)直接測定抑菌環(huán)直徑。因?yàn)槠鋵儆诙繙y定，以數(shù)理統(tǒng)計(jì)的方法確定其質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。參考菌株的抑菌環(huán)質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)是，藥物對該菌株的抑菌環(huán)直徑平均值±2標(biāo)準(zhǔn)差。為了簡明起見，將這個(gè)指標(biāo)換算成抑菌環(huán)直徑質(zhì)量控制允許范圍。實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量監(jiān)測，連續(xù)30次監(jiān)測的結(jié)果只允許最多3次超過質(zhì)量控制范圍，并且這3次失控不應(yīng)該連續(xù)出現(xiàn)。

現(xiàn)行的質(zhì)量控制方法是在試驗(yàn)達(dá)到穩(wěn)定的狀態(tài)后，每周做1~2次監(jiān)測，并繪制質(zhì)控圖，在連續(xù)的監(jiān)測中，每30次中只允許有3次超過質(zhì)量控制的允許范圍，而且這3次不得連續(xù)出現(xiàn)。如果連續(xù)2次出現(xiàn)超過允許范圍，必須改為每日監(jiān)測，并尋找失控的原因，進(jìn)行必要的糾正。質(zhì)量監(jiān)測的情況應(yīng)完整地記錄下來，以便進(jìn)行分析。對于計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)，用點(diǎn)圖的方法記錄比較直觀，如溫度、濃度、藥敏試驗(yàn)的抑菌環(huán)直徑或MIc值。這種記錄方法也稱質(zhì)量控制圖。藥敏試驗(yàn)的質(zhì)控圖最好將每個(gè)參考菌株監(jiān)測各種藥物的結(jié)果記錄在同一張圖上，這樣，可以方便地比較各個(gè)藥物抑菌環(huán)的變化情況，利于辨別真失控或假失控[16]。

國內(nèi)于20世紀(jì)80年代初開展了細(xì)菌檢驗(yàn)的質(zhì)量評價(jià)工作。就目前國內(nèi)的現(xiàn)狀而言，應(yīng)認(rèn)為有兩種層次的質(zhì)量評價(jià)活動(dòng)，分別為初級活動(dòng)和正常活動(dòng)。初級活動(dòng)有兩個(gè)特點(diǎn)：模擬標(biāo)本為純菌種，活動(dòng)頻率較低。正常的質(zhì)量評價(jià)活動(dòng)應(yīng)針對現(xiàn)代醫(yī)院細(xì)菌感染的實(shí)際情況進(jìn)行，質(zhì)量評價(jià)工作的重點(diǎn)應(yīng)該是考察實(shí)驗(yàn)室是否漏檢。目前，由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心組織的全國性質(zhì)量評價(jià)活動(dòng)已經(jīng)朝此方向發(fā)展，使用混合菌模擬標(biāo)本做質(zhì)量評價(jià)。正常的質(zhì)量評價(jià)活動(dòng)的另一特點(diǎn)是增加活動(dòng)的頻率。高頻率的活動(dòng)迫使實(shí)驗(yàn)室不得不以常規(guī)的技術(shù)力量和按日常工作條件對待質(zhì)量評價(jià)的標(biāo)本，真實(shí)地反映出實(shí)驗(yàn)室的日常工作水平，并且可以通過質(zhì)量評價(jià)活動(dòng)開展技術(shù)培訓(xùn)。為了擴(kuò)大工作人員的眼界，可提供少見的細(xì)菌或新發(fā)現(xiàn)的病原菌，并備有必要的說明。

本次研究結(jié)果顯示，對于小兒肺炎的臨床診療，及時(shí)對患兒進(jìn)行痰培養(yǎng)及藥敏實(shí)驗(yàn)是十分必要的，臨床應(yīng)盡早采用敏感性抗生素，提高臨床治療效果。對于檢驗(yàn)科人員，在細(xì)菌培養(yǎng)與藥敏試驗(yàn)過程中，采用質(zhì)量控制，未出現(xiàn)嚴(yán)重不良事件，有效保障了臨床檢驗(yàn)的質(zhì)量。

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