脂多糖結(jié)合蛋白在膿毒癥患者診斷和預(yù)后預(yù)測中的作用

焦　京，蔣　宇，高　敏，王　念，楊明施，肖獻忠△(湖南師范大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，湖南長沙40006;中南大學湘雅醫(yī)學院病理生理學教研室，湘雅三醫(yī)院急危重癥醫(yī)學中心，湖南長沙400)

脂多糖結(jié)合蛋白在膿毒癥患者診斷和預(yù)后預(yù)測中的作用

焦京1，蔣宇2，高敏3，王念2，楊明施3，肖獻忠2△
(1湖南師范大學醫(yī)學院生物化學與分子生物學教研室，湖南長沙410006;
中南大學2湘雅醫(yī)學院病理生理學教研室，3湘雅三醫(yī)院急危重癥醫(yī)學中心，湖南長沙410013)

［摘要］目的:探討脂多糖結(jié)合蛋白( LBP)在膿毒癥患者診斷和預(yù)后預(yù)測中的作用。方法:挑選ICU的患者共80名，患者分為全身炎癥反應(yīng)綜合征( SIRS)組(陰性對照組)、膿毒癥存活組和膿毒癥死亡組;所有患者均于進入ICU后24 h內(nèi)采集血清樣本并進行APACHEⅡ評分分析;另挑選10名健康志愿者血清作為正常對照組; ELISA檢測各組樣本血清LBP、C反應(yīng)蛋白( CRP)和降鈣素原( PCT)濃度;并以APACHEⅡ評分、血清LBP、CRP和PCT濃度對膿毒癥診斷和預(yù)后預(yù)測做ROC曲線，評價LBP在膿毒癥患者診斷和預(yù)后預(yù)測中的作用。結(jié)果:與SIRS組相比，膿毒癥組的APACHEⅡ評分、血清LBP、CRP、PCT濃度均升高( P＜0. 05) ;與膿毒癥存活組相比，死亡組的APACHEⅡ評分和血清LBP濃度升高( P＜0. 05)，而血清CRP和PCT濃度在膿毒癥存活組與死亡組之間的差異無統(tǒng)計學意義; LBP血清濃度高于26. 84 mg/L時診斷膿毒癥的敏感性和特異性分別為97. 1%和95. 9% ; LBP血清濃度高于54. 16 mg/L時預(yù)測膿毒癥預(yù)后的敏感性和特異性分別為85. 2%和80. 0%。結(jié)論:與傳統(tǒng)的膿毒癥生物標志物CRP、PCT相比，LBP在膿毒癥的診斷和預(yù)測方面都具有更好的效果。

［關(guān)鍵詞］膿毒癥;脂多糖結(jié)合蛋白; APACHEⅡ評分; C反應(yīng)蛋白;降鈣素原

膿毒癥是指由感染因素作用于機體而引發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征( systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，是重癥監(jiān)護病房( intensive care unit，ICU)常見的死亡原因之一，常在嚴重創(chuàng)傷、燒傷、多發(fā)傷、休克及大手術(shù)后發(fā)生［1］。膿毒癥發(fā)病機制非常復(fù)雜且尚未完全闡明，病情進展兇猛迅速，給臨床診斷和治療工作帶來極大困難。尋找對膿毒癥早期診斷、預(yù)后預(yù)測有效的新方法和生物標志物對指導膿毒癥的防治、降低其死亡率至關(guān)重要［2］。脂多糖結(jié)合蛋白( lipopolysaccharide binding protein，LBP)作為一種存在于正常人和動物血清中的糖蛋白，可與脂多糖( lipopolysaccharide，LPS)的類脂A成分結(jié)合，催化LPS結(jié)合CD14，刺激單核細胞、內(nèi)皮細胞等釋放白細胞介素1( interleukin-1，IL-1)、白細胞介素6 ( interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子( tumor necrosis factor，TNF)等炎性介質(zhì)。當機體發(fā)生細菌感染時，血清LBP濃度會迅速升高，引發(fā)大量炎性介質(zhì)分泌，造成機體損害［3-5］。因此，LBP是可能用于大鼠膿毒癥診斷和預(yù)后預(yù)測的一個潛在生物標志物。本研究將挑選合適的膿毒癥病人，探討LBP在膿毒癥病人的診斷和預(yù)后預(yù)測中的意義，并將其與傳統(tǒng)的膿毒癥生物標志物C反應(yīng)蛋白( C-reactive protein，CRP)、降鈣素原( procalcitonin，PCT)相比，評估其作為膿毒癥生物標志物的臨床實用價值。

材料和方法

1病人分組

選擇2012年11月～2014年6月入住中南大學附屬湘雅三醫(yī)院ICU的患者共80名。入選的病人分為SIRS組( 20例)和膿毒癥組( 60例)，其診斷依據(jù)為2001年國際膿毒癥定義會議確定的關(guān)于膿毒癥診斷的新標準［6］。

1.1SIRS組伴有下列臨床表現(xiàn)中的2項或2項以上: ( 1)體溫＞38. 3℃或＜36℃; ( 2)白細胞計數(shù)＞1. 2×1010/L或＜4×109/L或有10%以上的未成熟細胞; ( 3)脈搏＞90 min－1; ( 4)呼吸次數(shù)＞20 min－1或PaCO2＜32 mmHg。

1.2膿毒癥組病人有已證明或疑似的感染，同時含有下列某些征象: ( 1)發(fā)熱(中心體溫＞38. 3℃) ; ( 2)低溫(中心體溫＜36℃) ; ( 3)心率＞90 min－1或大于不同年齡的正常心率的2個標準差; ( 4)氣促＞30 min－1; ( 5)意識狀態(tài)改變; ( 6)明顯水腫或液體正平衡＞20 mL/kg超過24 h; ( 7)高糖血癥(血糖＞110 mg/dL或7. 7 mmol/L)而無糖尿病史。

排除下列病人: ( 1)中性粒細胞減少(計數(shù)＜500/mm3) ; ( 2)人類免疫缺陷病毒感染(血清HIV抗體陽性) ; ( 3)口服糖皮質(zhì)激素類藥物超過1個月。

入選膿毒癥組的患者追蹤其病情轉(zhuǎn)歸，并根據(jù)其28 d結(jié)局分為存活組( 40例)和死亡組( 20例)。

1.3正常對照( control)組另取10名健康志愿者作為正常對照組。

2主要試劑

一次性真空采血管購自嘉興華越醫(yī)療器械有限公司，LBP、CRP、PCT的ELISA試劑盒均購自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司。

3主要方法

3.1臨床資料分析3組患者( SIRS組、膿毒癥存活組和膿毒癥死亡組)均常規(guī)監(jiān)測體溫、呼吸、平均動脈壓、心電圖等，并于進入ICU后24 h內(nèi)進行急性生理功能和慢性健康狀況評分( acute physiology and chronic health evaluationⅡ，APACHEⅡ)。患者的臨床基本資料見表1。

3.2血清樣本的收集3組患者均于入ICU第1天采集血標本。全血置于室溫下自然凝集20～30 min，輕輕地用木棉棒沿著試管壁分離血凝塊，然后密封試管，以2 000～3 000 r/min的速度離心10 min，用毛細移液管將血清移出至EP管中，EP管標記好日期、采集時間、病人名稱和病歷號，放于－80℃低溫冰箱保存。

3.3PBS緩沖液的配制準確稱量KCl 0. 2 g，KH2PO40. 2 g，NaCl 8. 0 g，Na2HPO4·2H2O 1. 56 g。在容量瓶中將各成分依次溶解于1 000 mL的3蒸水中(注意應(yīng)待前一種試劑完全溶解后再溶解下一種成分)，充分混勻，調(diào)節(jié)pH至7. 4。高壓鍋中121℃，消毒20 min。

3.4ELISA血清樣本按照ELISA試劑盒說明書用PBS緩沖液進行稀釋。設(shè)標準孔8孔，依次加入100 μL不同濃度的標準品。剩下的88孔加入待測樣品100 μL，酶標板加上覆膜，37℃孵育2 h后棄去液體，甩干。酶標板上每孔加入檢測溶液A工作液100 μL(按照ELISA試劑盒說明書于臨用前配制)，37℃孵育1 h后棄去孔內(nèi)液體。每孔用350 μL的洗滌液洗滌，重復(fù)洗板3次。最后一次洗板后，把孔內(nèi)洗滌液完全甩干。每孔加入檢測溶液B工作液100 μL(按照ELISA試劑盒說明書于臨用前配制)，37℃孵育30 min后棄去孔內(nèi)液體，每孔用350 μL的洗滌液重復(fù)洗板5次。每孔加入底物溶液90 μL，37℃避光顯色20 min后，每孔加入終止溶液50 μL，終止反應(yīng)。經(jīng)酶標儀在450 nm波長測定各孔的吸光度( A)值。

4統(tǒng)計學處理

用SPSS 16. 0統(tǒng)計軟件進行分析。所有實驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差( mean±SD)表示，4組間比較用單因素方差分析，2組間的比較用LSD-t檢驗。以真陽性率(敏感性)為縱坐標，假陽性率( 1－特異性)為橫坐標繪制ROC曲線。以P＜0. 05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1臨床資料分析

患者的臨床基本資料見表1。3組患者在性別、年齡方面無統(tǒng)計學差異，但是平均動脈壓、APACHEⅡ有統(tǒng)計學差異( P＜0. 05)。膿毒癥患者多為革蘭氏陰性菌感染，如鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌，僅有3名患者的血培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌)。

2患者APACHEⅡ評分分析和血清LBP、CRP和PCT濃度

如圖1所示，與SIRS組相比，膿毒癥組的APACHEⅡ評分、血清LBP、CRP和PCT濃度均升高( P＜0. 05)，而與膿毒癥存活組相比，死亡組的APACHEⅡ評分和血清LBP濃度升高( P＜0. 05)，而血清CRP和PCT濃度在膿毒癥存活組與死亡組之間的差異無統(tǒng)計學意義( P＞0. 05)。

表1　患者臨床資料統(tǒng)計Table 1.Clinical variables and demographics ( Mean±SD)

3APACHEⅡ評分和血清LBP、CRP和PCT濃度對膿毒癥診斷的ROC曲線分析

各指標的ROC曲線下面積LBP為0. 996，APACHE II為0. 772，PCT為0. 937，CRP為0. 782，見圖2、表2。LBP血清濃度診斷膿毒癥的敏感性和特異性均最高，其濃度高于26. 84 mg/L時診斷膿毒癥的敏感性和特異性分別為97. 1%和95. 9%。然后，我們用這一水平對另30位患者( SIRS組11例，膿毒癥組19例)是否發(fā)生膿毒癥進行判斷，結(jié)果顯示僅有2名患者判斷錯誤，其余28位患者全部判斷正確。LBP血清濃度高于26. 84 mg/L時診斷膿毒癥的準確度高達92. 8%，見表3。

4APACHEⅡ評分和血清LBP、CRP和PCT濃度對膿毒癥預(yù)后預(yù)測的ROC曲線分析

各指標的ROC曲線下面積LBP為0. 828，APACHE II為0. 897，PCT為0. 608，CRP為0. 682，見圖3、表4。LBP血清濃度預(yù)測膿毒癥預(yù)后的敏感性和特異性略低于APACHEⅡ評分，其濃度高于54. 16 mg/L時預(yù)測膿毒癥預(yù)后的敏感性和特異性分別為85. 2%和80. 0%。然后，我們用這一水平對另18位膿毒癥患者(存活組12例，死亡組6例)的結(jié)局進行預(yù)測，結(jié)果顯示僅有2名患者判斷錯誤，其余16位患者全部判斷正確。如表5所示，LBP血清濃度高于54. 16 mg/L時對膿毒癥患者結(jié)局預(yù)測的準確度高達87. 5%。

5APACHEⅡ評分和LBP相關(guān)性分析

APACHEⅡ評分和血清LBP濃度呈正相關(guān)( P＜0. 05)，見圖4。

Figure 1.APACHE II score and concentrations of LBP，PCT and CRP of the first day.Mean±SD.n =20～40.*P＜0. 05 vs SIRS;#P＜0. 05 vs survivors.圖1　各組APACHE II評分、血清中LBP、PCT和CRP的濃度

Figure 2.ROC analysis for serum concentrations of LBP，CRP，PCT and APACHE II score at the first day of admission for diagnosis in the patients with sepsis.圖2　APACHE II評分、LBP、PCT和CRP診斷膿毒癥的ROC曲線分析

表2　APACHE II評分、LBP、PCT和CRP診斷膿毒癥的ROC曲線下面積及95%的可信區(qū)間Table 2.The ROC curve area of LBP，CRP，PCT and APACHE II scores and the 95% confidence interval for diagnosis of sepsis

表3　LBP濃度診斷膿毒癥的可靠性分析Table 3.Reliability of LBP in diagnosis of sepsis in patients

討論

膿毒癥病情進展兇猛迅速，極易演變?yōu)槟摱拘孕菘撕投嗥鞴俟δ懿蝗C合征，是重癥監(jiān)護病房主要的死亡原因之一［7］。治療和預(yù)防膿毒癥最有效的方法應(yīng)是以膿毒癥的發(fā)病機制為基礎(chǔ)，但膿毒癥涉及機體多個系統(tǒng)的廣泛激活［8］，發(fā)病機制十分復(fù)雜，至今仍未完全闡明，這直接導致了對其診斷、預(yù)測和治療上的不確定性。目前，重癥監(jiān)護醫(yī)生常使用白細胞計數(shù)、CRP、紅細胞沉降率和PCT來幫助診斷膿毒癥并預(yù)測其預(yù)后［9］，然而它們卻因敏感度和特異性不高而備受質(zhì)疑。如果能找到一些敏感性和特異性更高的生物標志物，幫助醫(yī)生診斷膿毒癥、預(yù)測其發(fā)生、發(fā)展及結(jié)局，對于及時采取針對性措施以減輕病情、降低病死率無疑具有重要意義。

LBP是由肝臟合成的一種糖蛋白，與LPS中的類脂A具有高度親和性［10］。作為LPS載體蛋白，LBP能介導LPS與CD14的結(jié)合，刺激單核細胞、內(nèi)皮細胞等釋放炎性介質(zhì)，引起全身炎性反應(yīng)綜合征、膿毒性休克、急性肺損傷甚至多器官功能障礙綜合征［11］。Opal等［12］發(fā)現(xiàn)重癥膿毒癥和膿毒癥休克患者血漿LBP濃度顯著升高。Zeng等［13］也發(fā)現(xiàn)LBP能提示機體急性炎癥反應(yīng)。LBP在正常人血中水平較低(＜2 mg/L)，當有微生物感染、炎癥發(fā)生時LBP被迅速誘導產(chǎn)生并大幅度( 200～800 mg/L)增加。因此，LBP水平可作為某些疾病早期診斷和預(yù)后預(yù)測的重要標志。不過，也有研究發(fā)現(xiàn)LBP僅能反映機體急性炎癥反應(yīng)，而不能作為判斷疾病嚴重程度及預(yù)后的指標［14］。LBP在膿毒癥中的意義報道不一可能與病人背景、入ICU前所做的治療等不一有關(guān)。

Figure 3.ROC analysis for serum concentrations of LBP，CRP，PCT and APACHE II score at the first day of admission for prognosis prediction of the patients with sepsis.圖3　APACHE II評分、LBP、PCT和CRP預(yù)測膿毒癥患者預(yù)后的ROC曲線分析

表4　APACHE II評分、LBP、PCT和CRP預(yù)測膿毒癥預(yù)后的ROC曲線下面積及95%的可信區(qū)間Table 4.The ROC curve area of LBP，CRP，PCT and APACHE II score and the 95% confidence interval for the prognosis prediction of sepsis.

表5　LBP濃度預(yù)測膿毒癥預(yù)后的可靠性分析Table 5.Reliability of LBP in prognosis prediction of sepsis

Figure 4.The correlations between APACHEⅡscore and LBP.圖4　APACHEⅡ評分和LBP的相關(guān)性分析

我們的研究顯示，正常人血清中存在一定水平的LBP，但在患者血清中，LBP濃度顯著升高。與SIRS組相比，膿毒癥組的血清LBP水平升高;與膿毒癥存活組相比，死亡組血清LBP水平進一步升高，提示LBP水平升高不僅可以反映感染的發(fā)生，而且其與膿毒癥患者的預(yù)后相關(guān)。雖然LBP血清濃度預(yù)測膿毒癥預(yù)后的ROC曲線下面積比APACHEⅡ評分略低，但其敏感性和特異性均超過了80. 0%。進一步分析血清LBP濃度與APACHEⅡ評分的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，兩者呈正相關(guān)，提示LBP可作為反映疾病嚴重程度和預(yù)后預(yù)測的指標。當血清中LBP的濃度高于26. 84 mg/L時診斷膿毒癥的敏感性和特異性均超過95. 0%，而血清LBP濃度高于54. 16 mg/L時預(yù)測膿毒癥預(yù)后的敏感性和特異性均超過80.0%。為進一步驗證實驗的可靠性，我們另外隨機挑選了一批患者，取其血清作為驗證樣本數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，LBP血清濃度高于26. 84 mg/L時診斷膿毒癥的準確度高達92. 8%，而其濃度高于54. 16 mg/L時對膿毒癥患者結(jié)局預(yù)測的準確度高達87. 5%。

目前臨床上常用的膿毒癥生物標志物有CRP和PCT。CRP在臨床上已經(jīng)用了很多年了，但其特異性不高［15］。雖然PCT比CRP的特異性更好，但它仍不能較好地判斷膿毒癥的預(yù)后，因此其臨床實用價值也一直受到質(zhì)疑［16］。本研究也顯示傳統(tǒng)的膿毒癥生物標志物PCT和CRP的血清水平在輔助診斷膿毒癥中具有一定的作用，但是它們在預(yù)測膿毒癥患者的預(yù)后方面則效果較差。雖然研究結(jié)果顯示APACHEⅡ評分也有助于膿毒癥的預(yù)后預(yù)測，但其診斷膿毒癥的敏感性和特異性均遠遜于LBP。

與傳統(tǒng)的膿毒癥生物標志物PCT和CRP相比，LBP在膿毒癥的診斷和預(yù)測方面都具有更好的效果，其敏感性和特異性均更高。上述結(jié)果提示，LBP是膿毒癥診斷和預(yù)后預(yù)測的一個新的、潛在的生物標志物，其臨床應(yīng)用價值有待進一步評估。

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·短篇論著·

Measurement of serum lipopolysaccharide binding protein for diagnosis and prognosis prediction in septic patients

JIAO Jing1，JIANG Yu2，GAO Min3，WANG Nian2，YANG Ming-shi3，XIAO Xianzhong2
(1Department of Biochemistry and Molecular Biology，Medical College，Hunan Normal University，Changsha 410006，China;2Department of Pathophysiology，Xiangya School of Medicine，3Department of Emergency and Critical Care Medicine，The Third Xiangya Hospital，Central South University，Changsha 410013，China.E-mail: xiaoxianzhong11@ sina.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the role of lipopolysaccharide binding protein ( LBP) for diagnosis and prognosis prediction in the septic patients.METHODS: A total number of 80 ICU patients were enrolled.The patients were divided into systemic inflammatory response syndrome ( SIRS) group and sepsis group，the patients in sepsis group were divided into non-survivor sub-group and survivor sub-group.We collected the serum samples and analyzed acute physiology and chronic health evaluation ( APACHE) II score on the first day of the patients hospitalized in ICU.In addition，we also selected 10 healthy volunteers and collected their serum samples.The serum concentrations of LBP，C-reactive protein ( CRP) and procalcitonin ( PCT) were measured by ELISA.ROC analysis of LBP，CRP，PCT and APACHE II score was conducted to discriminate among critically ill patients with sepsis and predict the prognosis of the patients with sepsis.RESULTS: The levels of the 4 indicators in the septic patients were higher than those in the patients of SIRS ( P＜0. 05).In addition，serum LBP and APACHE II score in the non-survivor sub-group were higher than those in the survivor sub-group ( P＜0. 05)，whereas no difference of the PCT and CRP levels between survivors and non-survivors with sepsis was observed.LBP levels greater than 26. 84 mg/L had 97. 1% sensitivity and 95. 9% specificity to discriminate between SIRS and sepsis.LBP levels greater than 54. 16 mg/L had 85. 2% sensitivity and 80. 0% specificity for prognosis of unfavorable outcome.CONCLUSION: LBP level was more accurately correlated with diagnosis or prognosis prediction than CRP or PCT in patients with sepsis.

［KEY WORDS］Sepsis; Lipopolysaccharide binding protein; APACHE II score; C-reactive protein; Procalcitonin

通訊作者△Tel: 0731-82355022; E-mail: xiaoxianzhong11@ sina.com

［收稿日期］2015-01-28［修回日期］2015-04-15

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1294-06

［中圖分類號］R446. 1; R631+. 1

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.025