SIRT2在漿液性卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)及其對(duì)增殖、遷移和侵襲的影響*

杜燕華，張海燕，孫　紅△(復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，上海市女性生殖內(nèi)分泌相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海000)

SIRT2在漿液性卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)及其對(duì)增殖、遷移和侵襲的影響*

杜燕華1，2，張海燕1，孫紅1△
(1復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，2上海市女性生殖內(nèi)分泌相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200011)

［摘要］目的:研究SIRT2在卵巢表層上皮( ovarian surface epithelium，OSE)及漿液性卵巢癌( serous ovarian carcinoma，SOC)細(xì)胞系中的表達(dá)情況并從細(xì)胞增殖、遷移和侵襲這3個(gè)方面探討SIRT2對(duì)SOC惡性生物學(xué)行為的影響。方法:運(yùn)用Western blot技術(shù)檢測(cè)OSE和SOC細(xì)胞系中SIRT2蛋白的表達(dá)水平;設(shè)計(jì)靶向SIRT2的siRNA，構(gòu)建SIRT2過表達(dá)載體，分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染OSE細(xì)胞系HOSEpiC和SOC細(xì)胞系HO8910，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和CCK-8實(shí)驗(yàn)研究SIRT2對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)考察SIRT2在SOC細(xì)胞遷移中的作用; Transwell實(shí)驗(yàn)研究SIRT2 對(duì)SOC細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果: 5株SOC細(xì)胞系中SIRT2的表達(dá)水平顯著低于OSE細(xì)胞系。在HOSEpiC細(xì)胞中沉默SIRT2，細(xì)胞克隆形成數(shù)增多，細(xì)胞活力增強(qiáng)。相反，在HO8910細(xì)胞中過表達(dá)SIRT2，細(xì)胞克隆形成數(shù)減少，細(xì)胞活力降低。沉默SIRT2促進(jìn)HOSEpiC細(xì)胞的遷移，而過表達(dá)SIRT2則抑制HO8910細(xì)胞的遷移。沉默SIRT2的HOSEpiC細(xì)胞侵襲能力明顯增加，而過表達(dá)SIRT2的HO8910細(xì)胞侵襲能力則顯著降低。結(jié)論: SIRT2在SOC細(xì)胞中表達(dá)顯著下調(diào)。SIRT2在OSE細(xì)胞中是腫瘤抑制蛋白，抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

［關(guān)鍵詞］SIRT2蛋白;漿液性卵巢癌;細(xì)胞增殖;細(xì)胞遷移;腫瘤侵襲

SIRT2是人類的III類組蛋白脫乙酰酶，在組織中存在廣泛表達(dá)，參與細(xì)胞的正常生理或病理生理過程［1-2］。既往研究表明，SIRT2表達(dá)水平與癌癥密切相關(guān)，但根據(jù)細(xì)胞來源和腫瘤類型的不同，SIRT2分別扮演著腫瘤抑制因子或腫瘤促進(jìn)因子的角色。

卵巢上皮性腫瘤來源于卵巢表面的生發(fā)上皮，而生發(fā)上皮來自原始的體腔上皮，具有分化為各種苗勒上皮的潛能，若向輸卵管上皮分化，則形成漿液性腫瘤。上皮性卵巢癌約占卵巢惡性腫瘤的98%，其中75%的上皮性卵巢癌為漿液性卵巢癌( serousovarian carcinoma，SOC)。目前關(guān)于SIRT2在SOC中的研究尚未有報(bào)道，本研究旨在明確SOC中SIRT2的表達(dá)水平并進(jìn)一步揭示SIRT2對(duì)SOC的生長(zhǎng)、遷移和侵襲等惡性生物學(xué)行為的影響。

材料和方法

1主要材料

人卵巢表層上皮( ovarian surface epithelium，OSE)細(xì)胞系HOSEpiC購自ATCC;人SOC細(xì)胞系SKOV-3、OVCAR433、HEY、CAOV3和HO8910均購自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購自Invitrogen;細(xì)胞DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25%胰酶-0.02% EDTA購自Gibco; SIRT2兔抗人I抗和β-actin鼠抗人I抗均購自Abcam; CCK-8試劑盒購自Dojindo; Matrigel購自BD; Transwell小室購自Millipore; siRNA由上海吉瑪基因技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)HOSEpiC、SKOV-3和OVCAR433細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，HEY、CAOV3和HO8910細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)于5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱。

2.2Western blot實(shí)驗(yàn)提取各細(xì)胞系總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度，按每孔30 μg蛋白上樣。恒壓80 V電泳，恒壓100 V轉(zhuǎn)膜100 min，10%脫脂奶粉液封閉30 min，I抗4℃過夜，II抗室溫孵育1 h后ECL發(fā)光顯影。

2.3過表達(dá)載體的構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染HO8910細(xì)胞提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，切膠回收后，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCMV-Myc，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌，挑選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定。按照Lipofectamine 3000說明書操作，按照質(zhì)?；騭iRNA∶脂質(zhì)體比例為1∶1.5轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

2.4克隆形成實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染8 h后的各組細(xì)胞消化收集，按每孔1 000個(gè)將細(xì)胞接種于12孔板中，每2～3 d換液，7 d后取出固定并用結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

2.5CCK-8實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染24 h后的各組細(xì)胞消化收集，按照每孔5 000個(gè)將細(xì)胞接種于96孔板中，分別在不同時(shí)點(diǎn)( 0、12、24、36、48、60和72 h)加入10 μL CCK-8試劑，37℃孵育1 h，在450 nm處測(cè)定各孔的吸光度( A)值，相對(duì)細(xì)胞活力( %) = (各組不同時(shí)點(diǎn)A值－空白孔不同時(shí)點(diǎn)A值) /(各組起點(diǎn)A值－空白孔不同時(shí)點(diǎn)A值)×100%。

2.6細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)( wound-healing assay)將細(xì)胞按照每孔4×105個(gè)接種于6孔板中，轉(zhuǎn)染48 h后，細(xì)胞融合度達(dá)95%以上，用無菌Tip頭部劃線，PBS清洗去除細(xì)胞碎片，加入無血清培養(yǎng)基，5% CO2、37℃培養(yǎng)，不同時(shí)點(diǎn)( 0和48 h)顯微鏡下觀察并拍攝細(xì)胞向劃痕區(qū)的遷移情況。

2.7Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)染24 h的各組細(xì)胞消化收集，用無血清培養(yǎng)基重懸，按每孔1×105個(gè)細(xì)胞( 150 μL)加入到預(yù)鋪好Matrigel的Transwell小室內(nèi)，下室加入600 μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)36 h后棉簽擦掉上室細(xì)胞，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究中的所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( mean± SD)表示，組間差異比較采用單因素方差分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 SIRT2在漿液性卵巢癌細(xì)胞系中的表達(dá)

我們對(duì)6株卵巢(癌)上皮細(xì)胞系的SIRT2表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，這6株細(xì)胞系分別為OSE細(xì)胞系HOSEpiC細(xì)胞以及SOC細(xì)胞系HEY、HO8910、OVCAR-433、CAOV3和SKOV3細(xì)胞。Western blot結(jié)果顯示SOC細(xì)胞系中SIRT2表達(dá)水平顯著低于OSE細(xì)胞系( P＜0.01)，見圖1。

Figure 1.The protein expression of SIRT2 in OSE cell line and SOC cell lines.Mean±SD.n = 3.＊＊P＜0. 01 vs HOSEpiC.圖1　SIRT2在OSE細(xì)胞系和SOC細(xì)胞系中的表達(dá)情況

2 在HOSEpiC細(xì)胞中沉默內(nèi)源性SIRT2或在HO8910細(xì)胞中過表達(dá)SIRT2

在SIRT2高表達(dá)的HOSEpiC細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染靶向SIRT2的干擾RNA: siRNA1～3，均可顯著下調(diào)內(nèi)源性SIRT2的表達(dá)( P＜0.01) ;而SIRT2低表達(dá)的HO8910細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCMV-SIRT2-Myc載體，則可以顯著增加細(xì)胞內(nèi)的SIRT2表達(dá)水平( P＜0.01)，見圖2。

Figure 2.Knockdown or overexpression of SIRT2 in the ovarian cell lines.Mean±SD.n =3.＊＊P＜0. 01 vs scramble;##P＜0. 01 vs SIRT2-Myc.圖2　在卵巢(癌)細(xì)胞系中沉默或過表達(dá)SIRT2

3 SIRT2對(duì)卵巢(癌)細(xì)胞增殖能力的影響

我們分別利用平板克隆形成和CCK-8實(shí)驗(yàn)觀察沉默SIRT2或過表達(dá)SIRT2對(duì)細(xì)胞增殖的影響。平板克隆形成結(jié)果顯示，沉默SIRT2促進(jìn)OSE細(xì)胞系HOSEpiC的惡性增殖( P＜0.05)，而過表達(dá)SIRT2則對(duì)SOC細(xì)胞系HO8910的增殖有顯著抑制作用( P＜0. 01)。CCK-8實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力的改變與平板克隆形成實(shí)驗(yàn)一致，見圖3。

Figure 3.The effect of SIRT2 knockdown or overexpression on ovarian cell proliferation.Mean±SD.n =3.*P＜0. 05 vs SIRT2 si-RNA-2;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs SIRT2-Myc.圖3　沉默或過表達(dá)SIRT2對(duì)卵巢(癌)細(xì)胞增殖的影響

4 SIRT2對(duì)卵巢(癌)細(xì)胞遷移能力的影響

為進(jìn)一步研究SIRT2對(duì)卵巢(癌)細(xì)胞遷移的作用，我們利用劃痕實(shí)驗(yàn)分別觀察沉默SIRT2或者過表達(dá)SIRT2對(duì)HOSEpiC和HO8910細(xì)胞遷移率的影響。我們發(fā)現(xiàn)，SIRT2顯著抑制細(xì)胞的遷移，而沉默SIRT2則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞遷移率顯著增加( P＜0.01)，見圖4。

Figure 4.The effect of SIRT2 knockdown or overexpression on ovarian cell migration.Mean±SD.n = 3.＊＊P＜0. 01 vs SIRT2 si-RNA-2;##P＜0. 01 vs SIRT2-myc.圖4　SIRT2對(duì)卵巢(癌)細(xì)胞遷移能力的影響

5 SIRT2對(duì)卵巢(癌)細(xì)胞侵襲能力的影響

我們發(fā)現(xiàn)，沉默SIRT2的HOSEpiC細(xì)胞侵襲能力顯著提高( P＜0.05)，而過表達(dá)SIRT2的HO8910細(xì)胞侵襲能力受到抑制( P＜0.01)，見圖5。以上結(jié)果提示，SIRT2表達(dá)的下調(diào)是造成SOC轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素之一。

討論

卵巢癌是女性生殖器官三大惡性腫瘤之一，其中上皮性卵巢癌最為常見，其發(fā)病隱匿，進(jìn)展迅速，病死率居?jì)D科惡性腫瘤之首，在女性的死因中位于第5位［3］。

SIRT2是sirtuin家族重要的成員之一，介導(dǎo)組蛋白和非組蛋白的去乙?；揎棧饕δ苁蔷S持基因組的穩(wěn)定性，修復(fù)DNA損傷，調(diào)控有絲分裂，參與抗氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，抗凋亡損傷等病理生理過程［4-7］。有研究證實(shí)，SIRT2參與癌癥的發(fā)生和進(jìn)展過程，且具有細(xì)胞來源或腫瘤類型的特異性。SIRT2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、食管腺癌、胃癌、黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌中低表達(dá)，而在急性髓性白血病、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、胰腺癌、肝細(xì)胞肝癌等腫瘤中高表達(dá)［8］。雖然SIRT2在多種腫瘤中的促癌或抑癌功能已被闡明，但SIRT2與SOC的關(guān)系尚未明確。我們的研究結(jié)果首次證實(shí)SIRT2在SOC細(xì)胞系中表達(dá)水平較OSE細(xì)胞系顯著降低。我們推測(cè)SIRT2在卵巢癌中扮演著抑癌基因的角色，SIRT2表達(dá)下調(diào)是SOC發(fā)生的重要分子事件。

惡性增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等是腫瘤難以治愈的重要因素。有研究表明，SIRT2的表達(dá)水平與腫瘤的上述惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，如SIRT2基因沉默后顯著抑制了肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力［9-11］;在肺癌細(xì)胞系中過表達(dá)SIRT2則可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期［12-13］;同樣，過表達(dá)SIRT2能顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖以及克隆形成［14-15］。我們的研究結(jié)果顯示，在高表達(dá)SIRT2的OSE細(xì)胞系HOSEpiC細(xì)胞中沉默SIRT2可以導(dǎo)致細(xì)胞克隆形成增多，增殖加快，同時(shí)細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng);相反，在低表達(dá)SIRT2的SOC細(xì)胞系HO8910細(xì)胞中過表達(dá)SIRT2可以抑制細(xì)胞克隆形成和增殖速率，對(duì)細(xì)胞的遷移和侵襲也有顯著的抑制作用。以上研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，SIRT2在OSE中作為腫瘤抑制蛋白發(fā)揮抑癌作用，SIRT2表達(dá)水平降低是SOC惡性增殖、遷移和侵襲能力增加的關(guān)鍵因素之一。

近些年來，分子靶向藥物在臨床實(shí)踐中取得顯著療效，將癌癥治療推向了一個(gè)前所未有的新階段，然而SOC沒有特異的生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。我們的研究結(jié)果將對(duì)卵巢癌的個(gè)體化靶向治療提供新的分子生物學(xué)依據(jù)。

Figure 5.The effect of SIRT2 knockdown or overexpression on ovarian cell invasion.Mean±SD.n =3.*P＜0. 05 vs SIRT2 siRNA-2;##P＜0. 01 vs SIRT2-Myc.圖5　SIRT2對(duì)卵巢(癌)細(xì)胞侵襲能力的影響

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Reduced expression of SIRT2 in serous ovarian carcinoma promotes cell proliferation，migration and invasion

DU Yan-hua1，2，ZHANG Hai-yan1，SUN Hong1
(1Obstetrics＆Gynecology Hospital of Fudan University，2Shanghai Key Laboratory of Female Reproductive Endocrine Related Diseases，Shanghai 200011，China.E-mail: hongsun57@ hotmail.com)

［ABSTRACT］AIM: To compare the expression of SIRT2 in ovarian surface epithelial ( OSE) cell line and serous ovarian carcinoma ( SOC) cell lines，and to investigate the effects of SIRT2 on the cell proliferation，migration and invasion.METHODS: The expression levels of SIRT2 in the OSE cell line and the SOC cell lines were determined by Western blot.The SIRT2 siRNAs and overexpression construct were designed and verified.Transient transfection of SIRT2 siRNAs or overexpression construct was performed，and the effect of SIRT2 on the cell proliferation，migration and invasion was evaluated.RESULTS: SIRT2 levels in the 5 strains of SOC cell lines were significantly lower than that in the OSE cell line.SIRT2 knockdown in HOSEpiC cells significantly enhanced the ability of cell colony formation and accelerated the cell growth rate.On the contrary，overexpression of SIRT2 in HO8910 cells dramatically repressed the number of cell colonies and cell activity.SIRT2 significantly changed the ability of ovarian cell migration.Knockdown of SIRT2 facilitated the cell invasion.CONCLUSION: The expression of SIRT2 in the SOC cells is significantly down-regulated.In the OSE cells，SIRT2 acts as a tumor suppressor and mediates the inhibition of cell proliferation，migration and invasion.

［KEY WORDS］SIRT2 protein; Serous ovarian carcinoma; Cell proliferation; Cell migration; Neoplasm invasion

通訊作者△Tel: 021-33189900; E-mail: hongsun57@ hotmail.com

*［基金項(xiàng)目］上海市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)科研計(jì)劃( No.14ZR1404100)

［收稿日期］2015-05-04［修回日期］2015-05-26

［文章編號(hào)］1000-4718( 2015)07-1209-05

［中圖分類號(hào)］R730. 23; R737. 31

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.010