一株豬源豕鏈球菌的分離鑒定

陳 煜，吳 達(dá)，孫 敏，王楷宬，鄧明俊，吳振興，岳志芹，鄭小龍，孫 濤，肖西志＊

（1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州350002；2.甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局，甘肅蘭州730020；3.山東出入境檢驗(yàn)檢疫局，山東青島266002；4.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島266032）

鏈球菌科包括2個(gè)屬，鏈球菌屬和乳球菌屬，鏈球菌屬包括89種鏈球菌，豕鏈球菌和豬鏈球菌同屬于鏈球菌屬。Collins于1984年將豕鏈球菌歸入蘭氏血清群E、P、V、U以及其他3個(gè)抗原群，即C1、5916T和7155A，豕鏈球菌的模式株包括NTCC10999、SS-1029和 ATCC43138［1］。而豬鏈球菌的血清群包括C、D、E和L群，在血清學(xué)上兩者可能存在交叉反應(yīng)。兩者在生長(zhǎng)表現(xiàn)及形態(tài)學(xué)上非常相似，即在血瓊脂平板上菌落都為光滑、圓潤(rùn)的呈現(xiàn)明顯的β型溶血，在普通光學(xué)顯微鏡下，經(jīng)革蘭染色后都表現(xiàn)為革蘭陽(yáng)性、長(zhǎng)短不一的球菌。

據(jù)報(bào)道，豕鏈球菌通常與豬的化膿性感染有關(guān)，如子宮頸淋巴管炎、膿腫、肺炎、敗血癥和心內(nèi)膜炎［2］。有報(bào)道稱(chēng)該菌可引起豬流產(chǎn)［3-4］。據(jù)報(bào)道從健康豬也能分離到該菌［5］。從女性的生殖系統(tǒng)可分離到該菌［6］，作為致病菌，主要感染女性的生殖系統(tǒng)［7］，可引起死胎［8］。也有該菌引起皮膚外傷感染的報(bào)道［9］。通過(guò)對(duì)25株分離自人的豕鏈球菌與17株參考菌株的比較分析，結(jié)果顯示人源豕鏈球菌與豬源有明顯的差異［10］。Bekal S等［11］利用16SrRNA 測(cè)序分析表明，人類(lèi)的豕鏈球菌在生化特點(diǎn)上與來(lái)源于豬的豕鏈球菌雖然相同，但分子生物學(xué)上存在差異，從而將人類(lèi)的豕鏈球菌命名假豕鏈球菌（Streptococcus pseudoporcinus）。Kevin A S等［12］通過(guò)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)假豕鏈球菌主要存在于黑人女性中，而且與其他生殖道疾病相關(guān)。我國(guó)關(guān)于豕鏈球菌的報(bào)道很少，僅見(jiàn)有陳明輝的牛源豕鏈球菌的生物學(xué)特性報(bào)道［13］。

山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心近期對(duì)送檢的一例病死豬進(jìn)行了針對(duì)豬鏈球菌病的檢測(cè)，綿羊血瓊脂上分離到疑似豬鏈球菌菌株，菌株呈明顯的β型溶血。為進(jìn)一步的確證該菌，我們進(jìn)行了生化、血清學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，同時(shí)我們進(jìn)行了小鼠感染試驗(yàn)以確認(rèn)其是否具有致病性。

1 材料與方法

1.1 材料

綿羊血瓊脂平板為OXOID公司產(chǎn)品；VITEK革蘭陽(yáng)性鑒定卡、鏈球菌乳膠凝集分型診斷試劑盒為法國(guó)梅里埃公司產(chǎn)品；豬鏈球菌分型血清為中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生流行病中心豬病實(shí)驗(yàn)室提供；細(xì)菌鑒定卡和藥敏鑒定卡為美國(guó)BD公司產(chǎn)品；豬鏈球菌通用型、1型、2型、7型和9型特異性引物由農(nóng)業(yè)部動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心提供；清潔級(jí)試驗(yàn)小鼠購(gòu)自青島食品藥品管理局實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 病料的分離培養(yǎng) 無(wú)菌采集死豬的桿、心、脾、肺、腎、扁桃體等組織，分別研磨，然后接種于綿羊血瓊脂平板，37℃，24h，挑取明顯β溶血、表面光滑、透明菌落，進(jìn)行革蘭染色鏡檢。對(duì)可疑菌落用綿羊血瓊脂平板進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.2.2 可疑菌的生化鑒定 取可疑菌的純培養(yǎng)物分別按照VITEK2（法國(guó)梅里埃微生物鑒定系統(tǒng)）和PHOENIX-100（美國(guó)BD公司微生物鑒定系統(tǒng)）配制菌懸液。

1.2.3 血清學(xué)鑒定 首先用鏈球菌分群血清進(jìn)行分群，然后用豬鏈球菌的分型血清（35種）進(jìn)行分型，分群血清采用的是乳膠凝集試驗(yàn)，分型則應(yīng)用玻片凝集試驗(yàn)。

1.2.4 PCR鑒定 采用豬鏈球菌通用型引物及1型、2型、7型和9型特異性引物對(duì)純培養(yǎng)物的核酸提取物進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，所用引物序列見(jiàn)表1。

1.2.5 16SrDNA的擴(kuò)增及序列測(cè)定 用豬鏈球菌16SrDNA的通用引物27F和1492R對(duì)分離的純培養(yǎng)物核酸進(jìn)行擴(kuò)增，序列見(jiàn)表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝集回收試劑盒回收后送南京金斯瑞生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI中的GenBank進(jìn)行比對(duì)。

1.2.6 小鼠感染試驗(yàn) 將分離菌株接種于血清肉湯，37℃，12h后離心，沉淀用生理鹽水稀釋到1×106cfu／mL，腹腔注射小鼠4只，同時(shí)設(shè)生理鹽水作為對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 分離株的生長(zhǎng)表現(xiàn)

分離到的可疑菌株在綿羊血瓊脂平板上37℃培養(yǎng)12h后表現(xiàn)為圓形、光滑、透明的小菌落，呈β溶血；在血清肉湯中為試管底部有輕微的渾濁沉淀。

2.2 生化試驗(yàn)鑒定

經(jīng)PHOENIX-100和VITEK2微生物鑒定儀鑒定，結(jié)果均為豕鏈球菌?？尚胖捣謩e為99%和97%，結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

表1 所使用的引物及目的片段大小Table 1 Primers and size of target sequences

表2 可疑菌的PHOENIX-100生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果Table 2 Identification result of suspect bacterium by PHOENIX-100

表3 可疑菌的VITEK2生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果Table 3 Identification result of suspect bacterium by VITEK 2

2.3 血清學(xué)分型

用鏈球菌乳膠凝集法檢測(cè)試劑盒（可檢測(cè)鏈球菌A、B、C、D、F和G群）對(duì)分離到的可疑菌的分群結(jié)果顯示，6種分群血清均不能與分離到的可疑菌株凝集。同時(shí)，32種豬鏈球菌分型血清也不能與可疑菌凝集。

2.4 PCR鑒定結(jié)果

用豬鏈球菌通用引物及豬鏈球菌的1、2、7、9型特異性引物對(duì)可疑菌提取的基因組DNA的擴(kuò)增結(jié)果顯示均沒(méi)有目標(biāo)條帶出現(xiàn)，對(duì)照組試驗(yàn)結(jié)果成立，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 可疑豬鏈球菌的PCR鑒定Fig.1 PCR identification of suspect S.suis

圖2 分別用豬鏈球菌通用引物及1型、2型、7型和9型對(duì)可疑菌進(jìn)行PCR鑒定Fig.2 PCR identification of suspect bacterium amplified by general primers of S.suis，1，2，7and 9respectively

2.5 16SrDNA序列比對(duì)及與豬鏈球菌的同源性分析

細(xì)菌16SrDNA的通用引物27F和1492R對(duì)可疑菌的核酸提取物擴(kuò)增出1 500bp左右的目標(biāo)條帶，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的序列表明，與發(fā)表的豕鏈球菌具有98%的同源性，而與豬鏈球菌2型的同源性為93%。

2.6 攻毒試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組小鼠在注射可疑菌的菌懸液后沒(méi)有出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀，和對(duì)照組小鼠在表現(xiàn)上無(wú)明顯差異，經(jīng)1周后仍正常。

3 討論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，鏈球菌屬的分類(lèi)已經(jīng)從21種［14］增加到89種［1］，那些以前未被分離到或誤判為某種鏈球菌的鏈球菌屬新成員被重新命名并定位。這也意味著一些新的病原體被發(fā)現(xiàn)并逐漸受到重視。

雖然VITEK2和PHOENIX-100的鑒定結(jié)果均為Streptococcus porcinus，兩者的可信度分別達(dá)到了97%和99%，但由于生化試驗(yàn)的結(jié)果還不足以得出鑒定結(jié)論，甚至生化試驗(yàn)有時(shí)會(huì)給出錯(cuò)誤的結(jié)果［15］。因此，隨后的試驗(yàn)有兩個(gè)目的，一是排除豬鏈球菌；二是對(duì)該菌進(jìn)行鑒定及致病性的初步分析。

豕鏈球菌和豬鏈球菌在形態(tài)學(xué)及生長(zhǎng)表現(xiàn)上很相近，在血瓊脂上都呈現(xiàn)明顯的β型溶血。然而這兩種菌在致病性方面具有很大差別，豬鏈球菌是一種重要的人畜共患細(xì)菌性傳染病，不僅可給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)重大損失，而且人一旦感染也會(huì)引起發(fā)病甚至死亡。因此，當(dāng)我們分離到疑似豬鏈球菌時(shí)，所設(shè)計(jì)的試驗(yàn)都是按照豬鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

所分離的豕鏈球菌的血清學(xué)分群結(jié)果與Christian等的報(bào)道結(jié)果相同，暗示著所分離的豕鏈球菌并不是醫(yī)學(xué)中常見(jiàn)的B型，有可能是E、U、V、P中的一種，還需要進(jìn)一步確認(rèn)。用豬鏈球菌分型血清進(jìn)行的凝集試驗(yàn)和隨后的針對(duì)豬鏈球菌的PCR鑒定結(jié)果排除了豬鏈球菌的可能。

16SrDNA作為細(xì)菌分類(lèi)的活化石，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的分類(lèi)和鑒定［16-23］，并以此開(kāi)發(fā)出許多快速的鑒定方法［24-27］。根據(jù) Bosshard P P［28］的判斷標(biāo)準(zhǔn)，16SrDNA的同源性在95%～99%之間的可認(rèn)為是同屬細(xì)菌，大于99%的可認(rèn)為是同種細(xì)菌。因此，通過(guò)生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定，可確定所分離到的鏈球菌為豕鏈球菌。

本研究的結(jié)果表明，雖然所分離到的豕鏈球菌不具備致病性或具有較弱的致病性，但解剖及試驗(yàn)分析表明，該菌可存在于健康豬體內(nèi)，并可能會(huì)成為繼發(fā)感染的病原體之一，應(yīng)引起重視。

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