葛根素對2型糖尿病大鼠胃血管病變影響及與胃動力的關(guān)系?

李維辛，周 蕓，孫曉瑋，王 芳，嚴 祥

(1.蘭州大學第一醫(yī)院，蘭州 730000;2.蘭州大學基礎醫(yī)學院，蘭州 730000)

葛根素對2型糖尿病大鼠胃血管病變影響及與胃動力的關(guān)系?

李維辛1，周 蕓1，孫曉瑋2，王 芳1，嚴 祥1

(1.蘭州大學第一醫(yī)院，蘭州 730000;2.蘭州大學基礎醫(yī)學院，蘭州 730000)

目的:觀察葛根素對早期2型糖尿病(T2DM)大鼠胃血管病變的影響及與胃動力的關(guān)系。方法:制備T2DM大鼠模型按隨機數(shù)字表法分為正常對照組(NC組)、葛根素干預正常組(NP組)、糖尿病對照組(DC組)、葛根素干預糖尿病組(DP組)。5周后測定各組胃半排時間(TIME 1/2)、胃排空速率(RATE)、血可溶性內(nèi)皮細胞蛋白C受體(sEPCR)、胃一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)。檢測胃內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)及CD34的表達，觀察電鏡下胃微血管超微結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果:與NC組比較，DC組血sEPCR、胃MDA升高，胃SOD、NO、eNOS及CD34表達下降，TIME 1/2縮短、RATE加快，胃微血管超微結(jié)構(gòu)受損。而與DC組比較，DP組的這些指標呈相反變化，相關(guān)分析顯示與TIME 1/2最相關(guān)的是eNOS。結(jié)論:葛根素可以改善早期2型糖尿病大鼠的胃動力異常、胃微血管損傷以及胃組織氧化應激，胃血管內(nèi)皮損傷可能是胃動力障礙的始動因素。

葛根素;2型糖尿病;胃動力;胃血管病變;動物模型

研究表明，胃腸道在2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，已成為糖尿病治療的新靶標［1］。糖尿病患者中檢出胃腸動力紊亂者可達90%以上，并可累及全胃腸道，其中胃動力障礙最為常見［2］。糖尿病胃動力障礙的確切發(fā)病機制尚未闡明。血管病變是糖尿病多種并發(fā)癥的基礎，內(nèi)皮細胞損傷是糖尿病血管病變的基礎［3］。橫斷面研究顯示，在1型糖尿病病人［4］和2型糖尿病病人［5］中，冠狀動脈和外周動脈內(nèi)皮依賴性的血管舒張是下降的。而胃腸道血管內(nèi)皮是否也有此相似的改變?胃血管結(jié)構(gòu)和功能的完整性是保障胃血液正常供應的決定因素，而胃的血流又是胃動力的重要保障。因此，本研究探討中藥單體葛根素對早期2型糖尿病大鼠胃血管病變的作用機制以及與胃動力的關(guān)系，以期為中藥單體臨床治療2型糖尿病胃動力障礙提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量170～200 g，由甘肅省中醫(yī)學院實驗動物中心提供，溫度20～25℃，相對濕度40%～70%，晝夜明暗交替時間10/ 14 h(動物質(zhì)量合格證編號SCXK(甘)2011-0001-0001346，動物設施使用合格證號SYXK(甘)2011-0001)。

1.2 藥物

葛根素購自西安天本生物工程有限公司(批號TBP100430)，經(jīng)HPLC檢測純度98.5%。

1.3 試劑

鏈脲佐菌素(STZ)及多聚賴氨酸購自美國Sigma公司，99mTcDTPA購自上海欣科公司;可溶性內(nèi)皮細胞蛋白 C受體(sEPCR)試劑盒購自美國R＆D公司;CD34一抗購自美國CST公司;eNOS一抗購自美國bioworld公司;SP-9002試劑盒購自美國Zymed公司;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)及雙縮脲法總蛋白定量測試盒購自南京建成生物工程研究所。

1.4 儀器

針孔型探頭單光子發(fā)射計算機斷層照相儀(SPECT，以色列 Elscint Helix)，日本奧林巴斯BX51T-PHD-J11及 CX21光學顯微鏡，日本 JEM-1230型投射電鏡，美國 Media Cybernetics公司(Image-Pro Plus 6.0)多功能真彩色細胞圖像分析管理系統(tǒng)、美國Awareness科技有限公司STAT FAX 2100全自動酶標儀、德國萊卡RM2015切片機。

1.5 方法

1.5.1 模型制作與分組 將大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常飼料組(n=16)和高脂飼料組(n= 20)，分別給予普通飼料和高脂飼料(普通飼料添加10.0%豬油，20.0%蔗糖，2.5%膽固醇，1%膽酸鹽)。喂養(yǎng)8周后，給予高脂組大鼠左下腹腔分2次注射STZ，STZ按1%比例以檸檬酸緩沖液稀釋(pH4.4，冰上配制，現(xiàn)配現(xiàn)用)，第1次注射劑量為30 mg/kg，間隔3 d后第2次注射20 mg/kg;正常組大鼠注射相同體積的pH4.4、0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液。于第2次注射后72 h及1周時取尾靜脈血，用樂生eB-G型虹吸式血糖儀檢測血糖，隨機血糖≥16.7 mmol/L，且伴有明顯的多飲、多尿、多食、體質(zhì)量下降的大鼠，確定為糖尿病造模成功，共16只大鼠成模。將正常及糖尿病模型大鼠分為正常對照組(NC組)、葛根素干預正常組(NP組)、糖尿病對照組(DC組)、葛根素干預糖尿病組(DP組)，隨機給各組分配8只進行試驗。NP及DP組給予葛根素400 mg/kg，每日1次灌胃(PBS緩沖液配制)，各組灌胃劑量為10 ml/kg·d;NC及DC組每日灌胃等體積的PBS緩沖液。藥物干預共5周，每周稱體質(zhì)量1次，根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整給藥量。

1.5.2 核素胃排空檢查 藥物干預結(jié)束后，大鼠禁食不禁水16 h，應用含有同位素(99mTcDTPA)標記的半固體食物1 mL(由1 mL純牛奶與0.5 g面粉配制成糊劑)，通過灌胃器緩慢注入胃內(nèi)之后立即將大鼠仰臥綁縛于特制固定架上，在SPECT上以大鼠腹部為目標區(qū)，窗寬20%，矩陣128×128，放大倍數(shù)×3.0，以目標區(qū)作為感興趣區(qū)行放射性活性采集，前30 min每5 min采集1次，然后每15 min采集1次，連續(xù)測定60 min。通過SPECT自帶軟件，計算出胃半排時間(TIME 1/2)及排空速率(RATE)的校正值。

1.5.3 血清學指標測定 大鼠完成胃排空檢查、乙醚吸入麻醉處死后，心臟采血3～6 mL，普通管3000 r/min離心15 min，取血清-20℃保存，酶法檢測血清可溶性內(nèi)皮細胞蛋白C受體(sEPCR)水平。

1.5.4 胃組織勻漿指標測定 取全胃沿大彎剪開，用冷生理鹽水漂洗除去血液濾紙拭干。剪取約1/2的腺胃，加入冷勻漿介質(zhì)(PH7.4，0.01 mol/ LTris-HCL，0.0001 mol/L EDTA-2Na，0.01 mol/L蔗糖，0.8%的氯化鈉溶液)，用勻漿器將標本勻漿化制備成10%的懸液，再在0℃的離心機里以3000 r/ min左右離心20 min。上清液在估計蛋白含量后用來估計丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)等指標。胃組織勻漿總蛋白質(zhì)含量用雙縮脲法測定。MDA測定采用硫代巴比妥酸比色法，含量用nmol/mg/protein表示;SOD測定采用改良的黃嘌呤氧化酶法，結(jié)果以亞硝酸鹽單位U/mg/ protein表示;以硝酸還原酶法檢測NO含量，結(jié)果以umol/L表示。

1.5.5 免疫組織化學方法 檢測胃組織內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)及CD34的表達 取胃竇部組織塊(0.5 cm×0.5 cm)置于10%中性緩沖甲醛中固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋，免疫組織化學染色。包埋后切片、脫蠟，微波修復抗原，滴加兔抗鼠多克隆抗體(一抗最終濃度eNOS-1∶400、CD34-1∶300)及二抗，DAB顯色;充分水洗、蘇木素復染，用PBS緩沖液分別代替一抗作為陰性對照。高倍鏡下觀察胃黏膜eNOS及CD34表達情況，應用Image-proplus多媒體圖像分析儀測定eNOS陽性表達的平均光密度值(eNOS-OD值)，以及胃黏膜CD34免疫組化陽性染色面積百分比(CD34-%)。

1.5.6 電鏡檢測胃黏膜微血管超微結(jié)構(gòu) 取胃竇組織塊置于3%戊二醛中前固定24 h，1/15M磷酸緩沖液漂洗2次，1%四氧化鋨后固定1 h，再經(jīng)漂洗、梯度脫水。100%丙酮:環(huán)氧樹脂Epon812浸透、包埋、聚合固化后，切取60～80 nm超薄切片，再經(jīng)醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，最后觀察拍照分析。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，非正態(tài)數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)換，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法，計量數(shù)據(jù)間相關(guān)關(guān)系采用多因素逐步回歸分析，雙側(cè) P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠TIME 1/2、RATE變化比較

表1顯示，DC組大鼠與NC組比較，TIME 1/2縮短，RATE加快(P＜0.05)。DP組大鼠與DC組比較，TIME 1/2加長，RATE減慢(P＜0.05)。NP組大鼠與NC組各指標比較差異無統(tǒng)計學意義。

2.2 各組大鼠NO、sEPCR、MDA和SOD的變化比較

表2顯示，DC組與NC組比較，胃組織MDA(P＜0.01)含量升高，SOD(P＜0.05)水平下降，NO(P＜0.05)水平下降，血sEPCR濃度增加(P＜0.01)。 DP組與DC組比較，MDA(P＜0.05)濃度降低，SOD (P＜0.01)水平增加，NO(P＜0.05)水平增加，sEPCR濃度減低(P＜0.01)。NP組大鼠與NC組各指標比較差異無統(tǒng)計學意義。

表1 各組大鼠TIME 1/2、RATE變化比較(±s)

表1 各組大鼠TIME 1/2、RATE變化比較(±s)

注:與NC組比較:*P＜0.05;與DC組比較#P＜0.05

組 別 鼠數(shù) Lg［TIME 1/2］(min) Lg［RATE］(%，min) NC 8 1.66±0.07 0.04±0.07 NP 8 1.76±0.06 -0.06±0.06 DC 8 1.47±0.06* 0.23±0.06*DP 8 1.67±0.07# 0.03±0.07#

表2 各組大鼠NO、sEPCR、MDA和SOD變化比較(±s)

表2 各組大鼠NO、sEPCR、MDA和SOD變化比較(±s)

注:與NC組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與DC組比較:#P＜0.05，##P＜0.01

組 別 鼠數(shù) MDA(nmol/ml) SOD(U/mgprot) NO(umol/L) sEPCR(Ug/L) NC 8 2.41±0.10 40.16±1.18 34.66±1.42 117.31±3.12 NP 8 2.40±0.07 39.58±1.50 34.50±1.99 119.71±2.41 DC 8 2.83±0.10＊＊ 36.06±1.51* 30.50±0.77* 129.39±1.93＊＊DP 8 2.49±0.12# 43.50±1.06## 34.74±1.11# 119.74±1.50##

2.3 各組大鼠以CD34標記的胃微血管密度及胃微血管eNOS表達的變化比較

表3顯示，DC組大鼠與NC組比較，CD34-%及eNOS-OD下降(P＜0.05);DP組大鼠與DC組比較，CD34-%及 eNOS-OD增加(P＜0.01和 P＜0.05);NP組大鼠與NC組比較差異無統(tǒng)計學意義。

表3 各組大鼠CD34-%、eNOS-OD的變化比較(±s)

表3 各組大鼠CD34-%、eNOS-OD的變化比較(±s)

注:與NC組比較:*P＜0.05;與DC組比較:#P＜0.05，##P＜0.01

組 別 鼠數(shù) CD34(%)eNOS-OD NC 8 0.30±0.04 0.61±0.07 NP 8 0.37±0.09 0.53±0.04 DC 8 0.20±0.06* 0.36±0.07*DP 8 0.34±0.07## 0.54±0.05#

2.4 各組大鼠胃微血管超微結(jié)構(gòu)的變化

NC組大鼠微血管管腔規(guī)則，內(nèi)皮細胞無腫脹，基底膜為連續(xù)完整的電子密度均勻的膜性結(jié)構(gòu)，基底膜結(jié)構(gòu)清楚，環(huán)繞內(nèi)皮細胞。內(nèi)皮細胞內(nèi)的異染色質(zhì)分布均勻，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體等細胞器形態(tài)正常。DC組大鼠的微血管管腔變性、狹窄，內(nèi)皮細胞腫脹，基底膜電子密度不均，連續(xù)性及完整性破壞且結(jié)構(gòu)模糊。內(nèi)皮細胞內(nèi)異染色質(zhì)聚集、靠邊，線粒體腫脹、嵴變短、消失，部分發(fā)生髓鞘樣變，甚至結(jié)構(gòu)模糊不清。DP組大鼠的大多數(shù)微血管基底膜結(jié)構(gòu)明顯，較DC組的清晰并呈連續(xù)完整的膜性結(jié)構(gòu)，線粒體無腫脹、擴張，嵴正常，存在雙層膜結(jié)構(gòu)，未見異染色質(zhì)聚集現(xiàn)象。NP組大鼠的微血管電鏡下結(jié)構(gòu)正常，同NC組表現(xiàn)(如圖1)。

2.5 相關(guān)分析

以TIME 1/2為因變量(Y)，以NO(X1)、sEPCR (X2)、MDA(X3)、SOD(X4)、CD34(X5)和eNOS-OD (X6)為自變量進行多因素逐步回歸分析，結(jié)果顯示相關(guān)因素為eNOS-OD(F=8.372，P=0.01)，回歸方程:Y=0.694 X6+1.268。

圖1 各組大鼠胃黏膜層內(nèi)皮細胞電鏡下結(jié)構(gòu)

3 討論

目前的研究認為，糖尿病多臟器損害的病理基礎是大血管和微血管病變，內(nèi)皮功能障礙被認為是糖尿病血管疾病發(fā)病的一個重要因素［3］。NO是主要的內(nèi)皮源性舒張血管物質(zhì)，內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)是其合成的關(guān)鍵酶。內(nèi)皮細胞蛋白C受體(EPCR)特異性表達于血管內(nèi)皮細胞的管腔面，參與蛋白 C的抗凝抗炎等途徑［6］。病理狀態(tài)下，EPCR可從血管內(nèi)皮細胞脫落形成 sEPCR［7］。Brownlee曾指出，高血糖引發(fā)的氧化應激對血管內(nèi)皮細胞損傷是糖尿病并發(fā)癥發(fā)生機制中關(guān)鍵性的第一步［8］。脂類［9］和葡萄糖［10］負荷均與活性氧(ROS)的增加有關(guān)。ROS能增加脂質(zhì)過氧化反應終產(chǎn)物丙二醛(MDA)產(chǎn)生，干擾eNOS的活化，使NO失活，降低血管的舒張反應性［11］，導致血管功能障礙及細胞蛋白、膜脂質(zhì)和核酸破壞。SOD是一種重要的氧自由基清除劑，能使 O2-還原成無毒的H2O2。

葛根素(puerarin，Pue)是從野葛 Puerarin Lobata(Willd)Ohwi或甘葛藤P.thomsonii Benth的根中提取的主要有效成分之一，屬于異黃酮類化合物，化學名為4，7-二羥基-8-D-葡萄糖基異黃酮。葛根素的藥理作用較多，臨床應用也非常廣泛，它在心血管疾病中有保護血管等作用［12］。本實驗觀察到，糖尿病對照組大鼠的胃組織SOD水平下降，MDA含量增高;胃組織eNOS表達以及NO濃度較正常鼠降低，血sEPCR濃度高于正常鼠;胃組織微血管超微結(jié)構(gòu)有損傷，CD34標記的胃微血管面積百分比也較正常鼠明顯下降。而葛根素治療的DP組糖尿病鼠與未治療的DC組比較，這些改變得到了逆轉(zhuǎn)或改善。說明給早期2型糖尿病大鼠進行葛根素治療，可以改善大鼠胃組織的氧化應激反應，保護胃血管內(nèi)皮NO的能力以及減少內(nèi)皮細胞的破壞脫落，可以預防和改善胃組織微血管超微結(jié)構(gòu)的損傷。其研究也證實，葛根素可提高2型糖尿病大鼠血清抗氧化酶活性，降低脂質(zhì)過氧化程度［13］。

糖尿病不同病期可出現(xiàn)胃排空加快或減慢，已有的研究結(jié)果報道不一。本實驗顯示，STZ加高糖高脂飼料誘導的糖尿病大鼠，在5周時胃排空速率比較同期的正常鼠是增加的;而同期經(jīng)葛根素干預的糖尿病大鼠，胃排空速率較糖尿病對照組延遲。研究數(shù)據(jù)顯示，葛根素對正常鼠也有延遲胃排空速率的趨勢，但無統(tǒng)計學意義。韓艷梅等研究顯示［14］，經(jīng)單次腹腔大劑量注射STZ聯(lián)合肌注氫化可的松和利血平制備的糖尿病胃腸病大鼠，每日500 mg/kg葛根素灌胃1次共12周，可明顯降低大鼠胃殘留率，降低血漿內(nèi)皮素水平，增加胃竇組織NO含量，認為葛根素具有調(diào)整血管內(nèi)皮細胞分泌功能，預防糖尿病胃腸病變發(fā)生的作用。但本實驗中葛根素減慢了糖尿病大鼠的胃動力，提示葛根素可能具有雙向調(diào)節(jié)胃運動的功能。

進一步多元逐步回歸分析顯示，與胃排空最相關(guān)的因素是eNOS-OD。前已述及，eNOS是NO合成的關(guān)鍵酶，其活性變化能直接調(diào)節(jié)NO的生成及其生物學效應。這個結(jié)果提示胃血管內(nèi)皮細胞損傷可能是2型糖尿病大鼠早期胃動力異常的始動因素，改善胃血管結(jié)構(gòu)及功能損害有望糾正糖尿病胃動力異常，進而有助于糖尿病的防治。

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Effect of puerarin on the gastric vessel disease in type 2 diabetic rats and its relationship with gastric motility

LI Wei-xin1，ZHOU Yun1，SUN Xiao-wei2，WANG Fang1，YAN Xiang1(1．First Hospital of Lanzhou University，Lanzhou 730000，China; 2．Basic Medical College of Lanzhou University，Lanzhou 730000，China)

Objective:To investigate the effects of Puerarin on early period gastric vasculopathy in type 2 diabetic (T2DM)rats，and the relationship with gastric motility.Methods:Rat model of T2DM were randomly divided into normal control group(NC)，normal+Puerarin group(NP)，diabetes control group(DC)and diabetes+Puerarin group(DP). Half time of gastric emptying(TIME 1/2)，emptying rate(RATE)，soluble endothelial cell protein C receptor(sEPCR) of serum，Nitric oxide(NO)，malonyldialdehyde(MDA)，superoxide dismutase(SOD)，endothelial nitric oxide synthase (eNOS)and CD34 in gastric tissue were measured.Electron microscope stomach microvascular ultrastructure were observed.Results:Compared with NC group，DC rats has higher sEPCR，MDA，and RATE，but SOD，NO，eNOS，CD34 and TIME 1/2 decreased.Stomach microvascular ultrastructure has damaged.Compared with DC group，these substances have opposite appearance.The results of Multivariate stepwise regression analysis showed that eNOS related to TIME 1/2. Conclusion:Puerarin can improve gastric motility disorders，gastric microvascular endothelial injury，and gastric tissue oxidative stress.Gastric vascular endothelial cell injury may be the initiating factor for the gastric motility disorder.

Puerarin;Type 2 diabetes mellitus;Gastric motility;Gastric vasculopathy;Animal models

R587.1

:B

:1006-3250(2015)11-1392-04

2015-03-25

甘肅省自然科學研究基金計劃項目(1208RJZA229);甘肅省衛(wèi)生行業(yè)科研計劃項目(GSWST09-04)

李維辛(1973-)，甘肅蘭州人，副教授，醫(yī)學博士，碩士研究生導師，從事糖尿病等疾病的臨床與實驗研究。