建立乙醇、HBV雙因素所致肝癌癌前病變小鼠模型的探討?

唐東昕，郭 斌，羅 莉，龍奉璽，王定雪，李 軍，王鏡輝，黃 慧，楊 柱△

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院博士后科研流動(dòng)站，北京 100700;2.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025; 3.劉尚義國(guó)醫(yī)大師傳承工作室，貴陽(yáng) 550001)

建立乙醇、HBV雙因素所致肝癌癌前病變小鼠模型的探討?

唐東昕1，3，郭 斌2，3，羅 莉2，龍奉璽2，王定雪2，李 軍2，王鏡輝2，3，黃 慧2，楊 柱2，3△

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院博士后科研流動(dòng)站，北京 100700;2.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025; 3.劉尚義國(guó)醫(yī)大師傳承工作室，貴陽(yáng) 550001)

目的:建立乙醇、HBV雙因素誘導(dǎo)的肝癌癌前病變小鼠模型。方法:將32只HBV轉(zhuǎn)基因小鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為16周對(duì)照組和模型組、22周對(duì)照組和模型組四組各8只，通過(guò)比較小鼠肝重和肝臟指數(shù)變化及肝臟病理變化來(lái)評(píng)價(jià)模型的建立情況。結(jié)果:模型組肝重和肝臟指數(shù)明顯增加，肝臟形態(tài)學(xué)變化顯示22周模型組肝損傷最嚴(yán)重，肝細(xì)胞層次1～3層增加，肝索排列紊亂，肝細(xì)胞不典型增生有小細(xì)胞性改變，細(xì)胞具有異型性。結(jié)論:乙醇、HBV雙因素刺激可加重肝損傷，22周時(shí)模型組出現(xiàn)肝癌癌前病理變化，肝癌癌前病變動(dòng)物模型的建立對(duì)于進(jìn)一步探討肝癌癌前病變的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

乙醇;HBV轉(zhuǎn)基因小鼠;肝臟指數(shù);肝癌癌前病變;動(dòng)物模型

近年來(lái)，肝癌癌前病變的研究越來(lái)越受到重視，其動(dòng)物模型多采用二乙基亞硝胺(DEN)等化學(xué)致癌因素誘發(fā)所致，動(dòng)物模型的合理性決定著后續(xù)研究的科學(xué)性。根據(jù)流行病學(xué)提示，飲酒和HBV感染是中國(guó)人肝癌發(fā)生的兩大重要誘因?；诖耍菊n題組采用乙醇和HBV雙因素誘發(fā)建立肝癌癌前病變小鼠模型，使其接近于國(guó)人肝癌發(fā)病特點(diǎn)，這對(duì)于探索肝癌癌變過(guò)程和阻斷機(jī)制有著重要的意義。

1 材料

1.1 動(dòng)物

拷貝高復(fù)制HBV轉(zhuǎn)基因雄性小鼠32只，6～8周齡，體質(zhì)量(23±2)g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍第四五八醫(yī)院全軍肝病中心(動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(軍) 2012-0018)。

1.2 試劑

53%(v/v)紅星二鍋頭白酒，產(chǎn)自北京紅星股份有限公司(產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)GB/T10781.2);4%多聚甲醛，來(lái)自Biotoopped公司。

1.3 儀器

TB-215D型電子天平(美國(guó)丹佛公司)，YB-6LF型生物組織石蠟包埋機(jī)(湖南亞光公司)，RM2235型組織切片機(jī)(德國(guó)LEICA公司)，YT-7F型攤烤片機(jī)(湖南亞光公司)，BX51型顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。

2 方法

2.1 肝癌癌前病變小鼠模型的制備

32只HBV轉(zhuǎn)基因小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為16周對(duì)照組、16周模型組、22周對(duì)照組和22周模型組每組各8只。模型組給予53%(v/v)紅星二鍋頭白酒劑量為10 ml·kg-1灌胃，每天1次;對(duì)照組小鼠給予等體積蒸餾水灌胃，每天1次。小鼠自由進(jìn)食、飲水，每5 d稱(chēng)重1次，根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整灌胃劑量，小鼠分別于第16、22周末取相應(yīng)組小鼠處死，取肝組織行病理切片，觀察肝臟病理變化。

2.2 小鼠一般情況觀察

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察小鼠的活動(dòng)情況、精神狀態(tài)、皮毛光澤度、食欲等。

2.3 小鼠肝重和肝臟指數(shù)的影響

于造模第16、22周末各組分別稱(chēng)重后摘除眼球取血，頸椎脫臼處死后立即取小鼠肝臟，鹽水沖洗后吸干水分稱(chēng)重，計(jì)算小鼠肝臟指數(shù)。肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量(g)×100［1］。

2.4 肝組織形態(tài)學(xué)影響

于造模第16、22周末取相應(yīng)小鼠的肝組織，鹽水沖洗吸干水分后，放入已準(zhǔn)備好的4%多聚甲醛固定液瓶中固定、脫水、包埋、切片、HE染色［2］，在400倍光鏡下觀察肝組織病理情況。

2.5 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)文獻(xiàn)制定［3-4］:①顯微鏡下可見(jiàn)肝細(xì)胞不典型增生(小細(xì)胞性改變和/或大細(xì)胞性改變);②肉眼可見(jiàn)肝組織出現(xiàn)結(jié)節(jié)性或局灶性改變。出現(xiàn)①和/或②即可判定為肝癌癌前病變。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般狀況

對(duì)照組小鼠灌胃后，精神、呼吸、運(yùn)動(dòng)均正常，毛發(fā)光澤，對(duì)刺激反應(yīng)靈敏，進(jìn)食飲水正常并隨體質(zhì)量增加略有增加。模型組小鼠灌胃初期出現(xiàn)精神萎靡、呼吸急促、活動(dòng)減少、刺激反應(yīng)減弱、嗜睡、進(jìn)食飲水減少等情況。從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始第4周起，模型組小鼠灌胃后精神萎靡、呼吸急促、嗜睡現(xiàn)象開(kāi)始減輕，小鼠體質(zhì)量略有增加，同時(shí)發(fā)現(xiàn)模型組小鼠打斗比對(duì)照組多，從第12周起開(kāi)始出現(xiàn)有胃腸脹氣死亡小鼠，同時(shí)觀察發(fā)現(xiàn)模型組小鼠毛發(fā)比空白對(duì)照組小鼠毛發(fā)稀疏。模型組小鼠從第14周出現(xiàn)眼睛異常明顯現(xiàn)象。

3.2 小鼠肝重和肝臟指數(shù)的影響

表1顯示，與16周對(duì)照組比較，16周模型組肝重和肝臟指數(shù)明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與22周對(duì)照組比較，22周模型組肝重和肝臟指數(shù)明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與16周模型組比較，22周模型組肝重和肝臟指數(shù)明顯增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示乙醇、HBV雙因素刺激可加重肝損傷，損傷程度與時(shí)間長(zhǎng)短成正比。

表1 16周與22周肝重和肝臟指數(shù)比較(±s，n=6)

表1 16周與22周肝重和肝臟指數(shù)比較(±s，n=6)

注:與對(duì)照組比較:△P＜0.05;與16周模型組比較:＊＊P＜0.05

時(shí)間/wk 組 別 肝重/g 肝重指數(shù)/% 16 對(duì)照組1.331±0.026 4.490±0.092模型組 1.457±0.038△ 5.691±0.322△22 對(duì)照組 1.370±0.043 4.419±0.140模型組 1.568±0.033△＊＊ 6.236±0.239△＊＊

3.3 肝組織形態(tài)學(xué)

HE染色400倍光鏡下觀察對(duì)照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)存在，肝細(xì)胞索排列基本整齊，肝細(xì)胞水腫明顯，細(xì)胞大小一致，有輕微的脂肪變性和匯管區(qū)，但管周可見(jiàn)少量的炎細(xì)胞(見(jiàn)圖2A、2C)。16周模型組小鼠部分區(qū)域肝細(xì)胞層次1～2層增加，肝索排列紊亂，肝細(xì)胞水腫明顯，肝細(xì)胞不典型增生有大細(xì)胞性改變，細(xì)胞具有異型性，肝細(xì)胞核和細(xì)胞都增大，核/漿比一般保持正常，核多異型性，常見(jiàn)核深染和多核，可見(jiàn)肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，并有部分區(qū)域炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖2B)。22周模型組部分區(qū)域肝細(xì)胞層次1～3層增加，肝索排列紊亂，肝細(xì)胞不典型增生有小細(xì)胞性改變，細(xì)胞具有異型性，肝細(xì)胞的細(xì)胞體積減小，核/漿比增大，輕度核多形性和核深染，并可見(jiàn)小片狀壞死及大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖2D)。

圖2 肝組織病理切片HE染色結(jié)果(400×)

3 討論

大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，癌前病變的過(guò)程是可逆的，而早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是肝癌防治的關(guān)鍵，也是中醫(yī)“治未病”思想的體現(xiàn)。肝癌癌前病變動(dòng)物模型的建立，是開(kāi)展肝癌癌前病變基礎(chǔ)研究的重要手段，對(duì)于進(jìn)一步探討肝癌癌前病變的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。目前，采用化學(xué)致癌因素誘發(fā)肝癌癌前病變模型的建立最常見(jiàn)的是二乙基亞硝胺(DEN)、黃曲霉毒素B1(AFB1)、四氯化碳(CCL4)等。以上方法誘導(dǎo)的肝癌癌前病變模型用肉眼即可觀察到肝組織上明顯的結(jié)節(jié)性變化，筆者認(rèn)為這種變化更接近癌變而非癌前病變。如何選擇誘發(fā)因素建立更為理想的肝癌癌前病變模型是后期實(shí)驗(yàn)研究的關(guān)鍵所在。

全球大約有3.5億人是乙肝病毒(HBV)的慢性攜帶者，中國(guó)更是HBV感染高發(fā)區(qū)，約7億人感染過(guò)HBV［5］。流行病學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)，HBV感染與肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)展之間存在著密切相關(guān)性［6］。世界衛(wèi)生組織(WHO)指出:“酒精毒性對(duì)肝臟的影響最大，對(duì)病毒性肝炎、肝癌等的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后都有重要影響。”如果酗酒的同時(shí)又并發(fā)肝炎病毒感染，其肝癌發(fā)生率可高達(dá)50%以上。我們應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，至少25%的乙醇性肝病患者同時(shí)并發(fā)HBV感染及演變?yōu)楦伟┑母呶Ｐ裕?］。

中醫(yī)學(xué)無(wú)病毒性肝炎及酒精性肝病之類(lèi)的名稱(chēng)，但中醫(yī)古代文獻(xiàn)對(duì)慢性乙型肝炎的臨床表現(xiàn)以及長(zhǎng)期大量飲酒造成的危害均有所論述，其內(nèi)容散見(jiàn)于黃疸、脅痛、積聚、鼓脹以及酒風(fēng)、酒癖、酒勞、酒傷［8］等疾病的論述中。國(guó)醫(yī)大師劉尚義指出:病毒性肝炎和酒精性肝病的病變機(jī)理各有特點(diǎn)，但2種病邪皆俱濕熱毒性，酒毒傷脾及肝，疫毒損肝犯脾致肝脾同病，氣滯、瘀血、痰濕、水飲等病邪裹結(jié)形成癌毒，癌毒聚集于肝日久生變，虛實(shí)錯(cuò)雜，疾病難愈。2種致病因素相互作用，必然加快疾病的進(jìn)程，可能導(dǎo)致肝癌的發(fā)生。因此，課題組在劉尚義對(duì)“治未病”思想的指導(dǎo)下，專(zhuān)門(mén)針對(duì)HBV感染同時(shí)飲酒的肝癌高危人群，建立乙醇性HBV轉(zhuǎn)基因小鼠肝癌癌前病變模型，為肝癌前病變動(dòng)物模型的建立探索新的方法，為深入研究肝癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

肝臟的質(zhì)量變化可以客觀地反映肝臟病變的情況，在酒精性肝損傷時(shí)肝細(xì)胞會(huì)發(fā)生腫大，胞質(zhì)變性，肝細(xì)胞微管受損傷，從而導(dǎo)致分泌功能障礙，分泌性蛋白潴留，肝細(xì)胞呈氣球樣變，嚴(yán)重時(shí)肝脂質(zhì)代謝紊亂，肝細(xì)胞內(nèi)脂肪堆積，肝細(xì)胞呈脂肪變性，均可致肝臟腫大、體積增大和質(zhì)量增加。通過(guò)對(duì)肝組織病理結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組HBV轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)具有明顯的脂肪變性及炎細(xì)胞浸潤(rùn)。國(guó)內(nèi)學(xué)者通過(guò)酒精對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行16周造模同樣觀察到肝損傷的情況，但是肝癌癌前病變情況不明顯［9］。

本實(shí)驗(yàn)用乙醇、HBV雙因素加大誘導(dǎo)力度，并在16周的基礎(chǔ)上增加22周這個(gè)時(shí)間點(diǎn)來(lái)觀察小鼠肝臟損傷的病理改變。通過(guò)病理結(jié)果可以看出，16周模型組已出現(xiàn)肝細(xì)胞層次增加，肝索排列紊亂，偶見(jiàn)有大細(xì)胞出現(xiàn)，細(xì)胞具有異型性，肝細(xì)胞核和細(xì)胞增大，核/漿比一般保持正常，核多異型性，常見(jiàn)核深染和多核，可見(jiàn)肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，并有部分區(qū)域見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);22周模型組部分區(qū)域肝細(xì)胞層次具有1～3層增加，肝細(xì)胞不典型增生并有小細(xì)胞出現(xiàn)，肝細(xì)胞體積減小，核/漿比增大，輕度核多形性和核深染，并可見(jiàn)小片狀壞死及大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。值得注意的是，22周模型組已出現(xiàn)小細(xì)胞性改變。

目前對(duì)于肝癌癌前病變的界定尚有爭(zhēng)議，沒(méi)有公認(rèn)指標(biāo)。有研究表明［4，10］，在慢性乙型肝炎中大細(xì)胞變顯示為一個(gè)腫瘤相關(guān)的病變，認(rèn)為大細(xì)胞變至少提示發(fā)生了傾向于肝癌發(fā)病的慢性損傷，而小細(xì)胞不典型增生比大細(xì)胞不典型增生更可能是一種癌前病變。小細(xì)胞變的生長(zhǎng)速度快于正常肝細(xì)胞，與肝癌的發(fā)生關(guān)系密切，屬于癌前病變，而病灶內(nèi)小細(xì)胞性改變主要存在于HBV、HCV慢性感染或酗酒所致的HCC高危慢性肝病中［11-13］。本實(shí)驗(yàn)22周乙醇誘導(dǎo)的HBV轉(zhuǎn)基因型小鼠模型組可于鏡下見(jiàn)到肝細(xì)胞不典型增生，有大細(xì)胞性和小細(xì)胞性改變，基本符合肝癌前病變模型的判斷標(biāo)準(zhǔn)，由此可以推斷造模成功。

綜上，筆者認(rèn)為顯微鏡下肝細(xì)胞不典型增生(小細(xì)胞性改變和/或大細(xì)胞性改變)更符合癌前病變的前瞻性，更有利于肝癌的防治。本實(shí)驗(yàn)肉眼未觀察到明顯的結(jié)節(jié)及局灶性改變，可能與造模周期、灌酒次數(shù)、給酒方式等因素相關(guān)，需要進(jìn)一步證實(shí)。

［1］王麗，呂紀(jì)華，饒偉源，等.保肝片對(duì)大鼠肝纖維化模型的影響［J］．中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013(7):234-236.

［2］俞琦，田維毅，楊柱.葛根散等3首解酒方對(duì)急性酒精中毒小鼠細(xì)胞因子水平的影響［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011(5):1171-1173.

［3］楊擁軍.肝細(xì)胞性肝癌癌前病變形態(tài)學(xué)特點(diǎn)及分子生物學(xué)研究進(jìn)展［J］．中國(guó)腫瘤，2008(1):41-44.

［4］Bosman F T.消化系統(tǒng)腫瘤WHO分類(lèi)［M］.4版.崔全才，譯.北京:診斷病理學(xué)雜社，2012:434-435.

［5］Chinese Society Of Hepatology，Chinese Medical Association Chinese Society of Infectious Diseases.［The guideline of prevention and treatment for chronic hepatitis B(2010 version)［J］．Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi，2011，32(4):405-415.

［6］Tarocchi M S.Polvani，G.Marroncini，A.Galli.Molecular mechanism of hepatitisB virus-induced hepatocarcinogenesis［J］．World J Gastroenterol，2014，20(33):11630-11640.

［7］江正輝，黃志強(qiáng)，董家鴻.亞臨床肝癌［M］.北京:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2003:47-50.

［8］楊柱.酒傷病因病機(jī)探討——酒傷專(zhuān)題之二［J］.江蘇中醫(yī)藥，2002，23(6):32-33.

［9］蘇俊.小鼠酒精性肝纖維化模型的建立及酒精性肝病的臨床分析［D］．第一軍醫(yī)大學(xué)，2007.

［10］Aaltonen，Stanley R.Hamilton，Lauri A.消化系統(tǒng)腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)［M］.虞積耀，崔全才，譯.北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:204.

［11］楊先照.肝癌前病變中醫(yī)證候特點(diǎn)及抗纖抑癌方對(duì)其HGF和C-Met mRNA調(diào)控作用研究［D］.北京:北京中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

［12］何秀蘭，肖俐，劉傳波，等.鱉甲煎化裁與局部微創(chuàng)相結(jié)合治療原發(fā)性肝癌38例臨床觀察［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2013，19(4):470.

［13］方肇勤，梁超，任紅艷.肝癌常用治法復(fù)方抑制肝癌細(xì)胞惡性增殖的機(jī)制研究［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2013，19(1): 34.

A study on the mouse model of precancerous lesion of liver cancer caused by the Ethanol and HBV factors based on the idea of the prevention disease

TANG Dong-xin1，3，GUO Bin2，3，LUO Li2，LONG Feng-xi2，WANG Ding-xue2，LI Jun2，WANG Jing-hui2，3，HUANG Hui2，YANG Zhu2，3△
(1．China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China;2．Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，China;3．National Medical Master Liu Shangyi’s Inheritance studio，Guiyang 550001，China)

Objective:Established mouse model of hepatocellular carcinoma precancerous lesions with ethanol and HBV-induced two-factor，provide a better model for liver cancer and precancerous lesions of basic research and experimental treatment.Methods:32 HBV transgenic mice were randomly divided into 16 weeks control group，16 weeks model group，22 weeks control group and 22 weeks model group(n=8)，by comparing the liver weight and liver index changes and pathological changes in the liver to evaluate the model established case.Results:Compared with the control group，model group liver weight and liver index increased significantly;compared with 16 weeks model group，the 22 weeks model group liver weight and liver index increased significantly.Morphological changes in liver Display:22 weeks in the model group is the most serious of liver injury，liver cells increased levels 1～3，hepatic cord disorder，liver cell dysplasia small cell changes，cells atypia.Conclusion:Ethanol，HBV two-factor stimulation can aggravate liver injury，22 weeks HBV transgenic mice model group has liver performance of precancerous lesions.

Ethanol;HBV transgenic mice;Liver index;Hepatocellular carcinoma precancerous;Animal model

R285.5

:B

:1006-3250(2015)11-1374-03

2015-02-16

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81160417，81460697);貴州省研究生工作站計(jì)劃(黔教研合JYSZ字［2014］018);貴州省科學(xué)技術(shù)廳-貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院科學(xué)技術(shù)聯(lián)合基金項(xiàng)目(黔科合LH字［2014］7336號(hào))

唐東昕(1977-)，男(土家族)，湖南黔陽(yáng)人，教授，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)藥防治腫瘤的基礎(chǔ)與臨床研究。

△通訊作者:楊 柱(1964-)，男，教授，醫(yī)學(xué)博士，從事腫瘤病因病機(jī)的基礎(chǔ)與臨床研究，Tel:0851-85652079，E-mail: yangzhu20150426@163.com。