1株分離于鈾礦的可利用玉米秸稈高效產(chǎn)氫的芽孢桿菌*

張曉，何曉銳，龐園濤，朱艷杰，黃建新

(西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安，710069)

氫能是一種可再生的潔凈能源，具有重量輕、無污染、熱值高等特性，成為21世紀(jì)的理想能源［1－3］。目前制氫的方法有物理化學(xué)法和生物法。物理化學(xué)制氫方法是以礦物資源為原料，需要消耗大量的能源，制氫成本較高;生物制氫是利用可再生能源通過生物的轉(zhuǎn)化制取氫氣，這一過程既緩解了能源危機(jī)，又消除了環(huán)境污染，是一種理想的產(chǎn)能方式［4］。其中，厭氧發(fā)酵微生物制氫因其產(chǎn)氫效率高，對環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)，反應(yīng)器設(shè)計簡單，能夠利用有機(jī)廢水、固體廢物進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)氫等特點(diǎn)越來越受到青睞［5］。已報道的厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌包括梭菌(Clostridium)［6］、腸桿菌(Enterobacter)［7］、芽孢桿菌(Bacillus)［8］、埃希氏菌(Escherichia)［9］等幾大類，雖然有關(guān)梭菌類和腸桿菌類菌株的發(fā)酵制氫研究報道較多，但高效產(chǎn)氫菌種的獲得、降低制氫成本以及工業(yè)化生產(chǎn)仍是生物制氫技術(shù)中的難點(diǎn)。此外現(xiàn)有的生物制氫技術(shù)利用的基質(zhì)主要集中在一些簡單碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、淀粉以及由這些簡單化合物構(gòu)成的廢水等，對于纖維素類等難以降解物質(zhì)的發(fā)酵產(chǎn)氫研究很少［10－15］。本文從鈾礦極端環(huán)境中分離獲得1株利用玉米秸稈酵解物發(fā)酵產(chǎn)氫的丁酸梭菌(Clostridium butyricum)w-14，該菌株具有兼性厭氧特點(diǎn)，可以葡萄糖(10 g/L)為發(fā)酵底物，累積產(chǎn)氫量達(dá)1 071.4 mL/L培養(yǎng)基;以玉米秸稈酵解物為發(fā)酵基質(zhì)，累積產(chǎn)氫量可達(dá)140.24 mL/g-cs，比已有文獻(xiàn)報道發(fā)酵秸稈的產(chǎn)氫效率高［16－17］，該研究對開發(fā)利用可再生生物質(zhì)轉(zhuǎn)化生產(chǎn)潔凈氫能源具有理論和實(shí)際應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

產(chǎn)氫菌:從十紅灘砂巖型鈾礦巖芯中富集分離獲得。

秸稈降解用麩曲:本實(shí)驗(yàn)室用康氏木霉(K-3)、黑曲霉(Q-2)固態(tài)發(fā)酵制備、保藏(以下簡稱KQ-麩曲)，使用前測定纖維素酶活為0.80～0.93 U/g(干曲)(酶活為單位為:1 h從底物溶液中分解產(chǎn)生1 mg葡萄糖的酶量)。

1.1.2 培養(yǎng)基

產(chǎn)氫菌富集培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨8，牛肉膏3，酵母膏 1，NaCl 3，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 0.05，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，葡萄糖10，L-半胱氨酸0.3，1 000 mL，pH 7.0，115 ℃滅菌30 min。

產(chǎn)氫菌的分離培養(yǎng)基:產(chǎn)氫菌富集培養(yǎng)基中加入瓊脂1.4%，用于二重疊皿法分離菌種。

玉米秸稈產(chǎn)氫發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨5，酵母膏0.5，L-半胱氨酸0.3，玉米秸稈酵解物200 mL，無機(jī)鹽營養(yǎng)液20 mL，蒸餾水780 mL，pH 7.0，115℃滅菌，30 min。

無機(jī)鹽營養(yǎng)液(g/L):NH4HCO32，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.1，NaCl 0.01，Na2MoO4· 2H2O 0.01，CaCl2·2H2O 0.01，MnSO4·7H2O 0.015，F(xiàn)eCl20.002 5，起始 pH 5.0。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高效產(chǎn)氫菌的分離篩選

鈾礦巖心樣在超凈工作臺中紫外照射20～30 min，去除四周表層約1.0～1.5 cm，取巖芯內(nèi)部分于無菌研缽內(nèi)磨成細(xì)粉，以5 g/100 mL的量，加入產(chǎn)氫菌富集培養(yǎng)基，無菌液體石蠟封液面，37℃深層富集培養(yǎng)。待培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液渾濁并有大量氣體產(chǎn)生后，用100 μL氣密性進(jìn)樣器抽取氣體于GC-SP 6890型氣相色譜儀檢測氣體組分，選取有氫氣產(chǎn)生的培養(yǎng)液，采用二重疊皿隔絕空氣培養(yǎng)法進(jìn)行產(chǎn)氫菌分離、純化。分離獲得的可產(chǎn)氫菌株，接種于產(chǎn)氫菌富集培養(yǎng)基中，連接氣體收集裝置(圖1)，于37℃水浴進(jìn)行深層發(fā)酵培養(yǎng)，根據(jù)單位培養(yǎng)基產(chǎn)氫量來比較菌株的產(chǎn)氫能力，篩選產(chǎn)氫能力高的菌株。重復(fù)進(jìn)行3次。

圖1 氣體體積分析裝置示意圖Fig 1 A static equipment to measure the volume of hydrogen produced

1.2.2 產(chǎn)氫菌株的鑒定

依據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》(第八版)［18］、《常用細(xì)菌鑒定手冊》［19］及16S rRNA基因序列分析對菌種進(jìn)行鑒定;擴(kuò)增菌株的16S rRNA基因序列所用的引物為:27F:5-GAGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'1495R:5'-CTACGGCTA CCTTGTTACGA-3'(上海sangon公司)。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，30個循環(huán)(94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min)72℃延伸 10 min，0.7%的瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR產(chǎn)物測序，測序工作委托上海Sangon公司完成;測序后將測序結(jié)果用BLAST軟件與GenBank中16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比較。從GenBank中調(diào)取不同菌株的16S rRNA基因序列用于系統(tǒng)發(fā)育分析，16S rRNA基因序列用MEGA 5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 產(chǎn)氫菌生長曲線測定

采用間歇試驗(yàn)測定菌株的生長曲線，將培養(yǎng)24 h的產(chǎn)氫細(xì)菌按5%的接種量接種于裝有800 mL液體產(chǎn)氫培養(yǎng)基的1 000 mL錐形瓶中，37℃恒溫水浴下培養(yǎng)，定時測其累積產(chǎn)氫量和活菌數(shù)的變化，繪制產(chǎn)氫菌的生長曲線。

1.2.4 秸稈的預(yù)處理

玉米秸稈水洗烘干，用微型粉碎機(jī)粉碎過80目的篩子，過篩的玉米秸稈粉用0.75%的氨水50℃浸泡預(yù)處理16 h，水洗至中性，烘干備用。

1.2.5 玉米秸稈酵解物的制備

取預(yù)處理后秸稈粉100 g，麩皮10 g，無機(jī)鹽營養(yǎng)液15 mL，蒸餾水 200 mL于 1 000 mL燒杯中，121℃，處理20 min，冷卻至45℃，再加入不同量(5，10，15，20，25 g/L)的 KQ-麩曲，加水補(bǔ)足至 500 mL，攪拌混勻，在45℃，pH為5.0條件下酵解84 h，酵解后100℃煮沸10 min，加水混勻，取1 mL浸提過濾測定還原糖含量，以酵解物還原糖濃度及產(chǎn)氫菌株利用不同KQ-麩曲濃度下的酵解物進(jìn)行發(fā)酵作用的累積產(chǎn)氫量來確定玉米秸稈酵解最適KQ-麩曲用量，在此基礎(chǔ)上再確定出溫度(35，40，45，50 ℃)，時間(60，72，84，96 h)，pH(4.0，4.5，5.0，5.5)不同酵解條件的酵解物對產(chǎn)氫菌株發(fā)酵產(chǎn)氫的影響，依據(jù)產(chǎn)氫細(xì)菌利用不同酵解條件的酵解物累積產(chǎn)氫量確定出秸稈酵解最適條件。酵解物于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 秸稈酵解物產(chǎn)氫發(fā)酵

250 mL錐形瓶中加入180 mL玉米秸稈產(chǎn)氫發(fā)酵培養(yǎng)基，接種經(jīng)16 h培養(yǎng)活化的產(chǎn)氫菌(w-14)種子液，接種量為10%，于37℃下，深層靜置培養(yǎng)，定時檢測產(chǎn)氣量，分析氣相產(chǎn)物中氫氣濃度，平均產(chǎn)氫速率，做3個平行。

1.2.7 w-14菌株利用秸稈酵解物產(chǎn)氫條件的優(yōu)化

采用L9(34)正交試驗(yàn)對w-14菌株利用玉米秸稈酵解物發(fā)酵產(chǎn)氫條件即溫度、接種量、初始pH值和菌齡進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.8 玉米秸稈酵解物發(fā)酵產(chǎn)氫5L放大實(shí)驗(yàn)

玉米秸稈產(chǎn)氫發(fā)酵培養(yǎng)基3.5 L置于5 L間歇攪拌(90 r/min)深層發(fā)酵產(chǎn)氫反應(yīng)器(圖2)，初始pH為7.0，接種經(jīng)16 h培養(yǎng)活化w-14的種子液，密封發(fā)酵罐，連接濕式氣體流量計，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度為(37±1)℃，用濕氏氣體流量計測量產(chǎn)氣量，定時取樣檢測生物氣中氫氣含量，計算出累積產(chǎn)氫量。

圖2 厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫反應(yīng)器及流程圖Fig 2 The general layout of batch stirring submerged fermentation to produce hydrogen bioreactor

1.2.9 分析測定

pH值用DELAT 320型酸度計測量。稀釋二重疊皿平板法測定活菌數(shù)。水解液中還原糖含量用3，5-二硝基水楊酸法(DNS)測定。氣體的收集采用排水法。定期從發(fā)酵產(chǎn)生的氣體中取100 μL注入氣相色譜儀(型號GC-SP 6890)測定發(fā)酵氣體中氫氣的含量。氬氣為載氣，流速為40 mL/min，色譜柱為3 mm內(nèi)徑不銹鋼柱(TDX分子篩填充柱)柱溫、汽化室和檢測室分別為90、130、130 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)氫菌的分離與篩選

經(jīng)初篩和復(fù)篩，從鈾礦床中分離得到5株產(chǎn)氫能力較好的菌株，結(jié)果見表1，其利用產(chǎn)氫菌富集培養(yǎng)基單位體積產(chǎn)氫量為(928.3±90.24)mL/L，與相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)相比［20－22］，這些源于鈾礦極端環(huán)境的野生菌株具有較高的產(chǎn)氫量，其中菌株w-14的產(chǎn)氫量最高。靜態(tài)產(chǎn)氫試驗(yàn)時，接種4 h后w-14菌株開始有氣泡產(chǎn)生。24 h后用氣相色譜對w-14菌株的氣相產(chǎn)物進(jìn)行分析(產(chǎn)氫色譜圖見圖3)，氫氣含量達(dá)到86.72%。間歇產(chǎn)氫試驗(yàn)中，w-14的產(chǎn)氫累積量達(dá)到1 071.4 mL/L，比李珊珊等［20］利用陰溝腸桿菌FMLC以葡萄糖為底物產(chǎn)氫的累積產(chǎn)氫量(1 032 mL/L)略高，故源于鈾礦極端環(huán)境的產(chǎn)氫菌株具有很好的應(yīng)用潛力。

表1 篩選后的產(chǎn)氫菌株的產(chǎn)氫能力對比Table 1 The hydrogen production ability of hydrogen production bacteria after screening

圖3 純氫(左)，w-14菌株(右)的產(chǎn)氫色譜峰值Fig 3 The chromatogram curve of standard hydrogen(left)and the strain w-14(right)

2.2 w-14菌株鑒定

w-14菌株在肉汁胨培養(yǎng)基深層培養(yǎng)20h，菌體桿狀，大小(0.6～1)μm×(3.0～5.6)μm，革蘭氏染色陽性(圖4)，培養(yǎng)28～30 h產(chǎn)生芽孢，芽孢中生;專性或兼性厭氧，具運(yùn)動性。生理生化反應(yīng)結(jié)果見表2;16S rRNA序列用MEGA 5.1構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5。

16S rRNA基因序列同源性比較可見，w-14和Clostridium butyricum strain W4同源性達(dá)到100%。根據(jù)菌株形態(tài)特征，生理生化及16S rRNA基因序列分析結(jié)果，w-14菌株鑒定為 Clostridium butyricum。GenBank登錄號為KM528123。

圖4 w-14革蘭氏染色(左)和掃描電鏡(右)照片F(xiàn)ig 4 Gram＇s staining(left)and scanning electron microscope image(right)of the strain w-14

圖5 菌株w-14的16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖Fig.5 Neighbor-joining tree showing the phylogenetic position of the isolated strain w-14，based on the 16S rRNA gene sequences of the strain w-14

表2 菌株w-14的生理生化鑒定結(jié)果(一)Table 2 Physiological characteristics of the strain w-14

2.3 w-14菌株以玉米秸稈酵解物為基質(zhì)的發(fā)酵產(chǎn)氫

2.3.1 w-14菌株生長與產(chǎn)氫規(guī)律

菌株w-14在產(chǎn)氫菌富集培養(yǎng)基的生長與產(chǎn)氫曲線如圖6所示

圖6 菌株w-14的生長與產(chǎn)氫曲線Fig.6 The curve of w-14 ’s growth and hydrogen production

由圖6可見，0～4 h菌數(shù)增加緩慢為延遲期。4～16 h為對數(shù)生長期，細(xì)菌數(shù)量從5.64×104CFU/mL增加到4.7×106CFU/mL，菌數(shù)呈指數(shù)遞增，16 ～20 h為穩(wěn)定期，活菌數(shù)基本上沒有變化始終在5.6×106個上下，21 h之后為衰亡期，菌數(shù)有所下降。w-14菌株產(chǎn)氫從6 h開始，持續(xù)到24 h。并在6～18 h期間產(chǎn)氫量迅速增加。

2.3.2 不同KQ-麩曲濃度的秸稈酵解對w-14菌株產(chǎn)氫的影響

秸稈酵解加入KQ-麩曲的量對其酵解物中還原糖和w-14菌株生長及產(chǎn)氫影響結(jié)果見圖7。由圖7可見，隨著麩曲質(zhì)量濃度的增加，還原糖含量逐漸增加，活菌數(shù)和菌株產(chǎn)氫量也隨著糖濃度的增加而增加，當(dāng)麩曲質(zhì)量濃度為20 g/L，還原糖含量、菌數(shù)和菌株的產(chǎn)氫量分別為403 mg/g-cs、6.03×106CFU/mL和99.7 g/g-cs，當(dāng)麩曲濃度為30 g/L時，還原糖含量、菌數(shù)和菌株的產(chǎn)氫量變化不大，故確定的麩曲最適用量為20 g/L。

圖7 不同麩曲濃度下還原糖含量和菌株w-14生長、產(chǎn)氫量的變化曲線Fig.7 The curve of w-14 ’s growth，cumulative H2yield and reducing sugar content at different concentrations of bran koji

2.3.3 玉米秸稈酵解溫度、時間、pH對w-14菌株產(chǎn)氫的影響

預(yù)處理的秸稈粉經(jīng)KQ-麩曲酵解，其酵解溫度、時間及pH對w-14菌株產(chǎn)氫的影響見圖8。

由圖8可見，w-14菌株以不同酵解作用條件下的玉米秸稈酵解物為基質(zhì)累積產(chǎn)氫量隨時間的變化趨勢有相似性，均經(jīng)過5～6 h的延遲期后開始產(chǎn)生氫氣，隨后累積產(chǎn)氫量隨酵解溫度、時間、pH的增加而迅速增加，結(jié)果表明w-14菌株利用在45℃，pH 5.0酵解84 h的秸稈酵解物的累積產(chǎn)氫量達(dá)99.7 mL/g-cs，其后隨著酵解溫度、pH、時間繼續(xù)增加，w-14菌的累積產(chǎn)氫量不再增加并呈下降趨勢，其原因是溫度、pH升高，影響了麩曲酶活性導(dǎo)致纖維素的降解率下降，還原糖減少，產(chǎn)氫量下降;以上結(jié)果與文獻(xiàn)［17］纖維素酶對玉米秸稈進(jìn)行糖化酵解發(fā)酵產(chǎn)氫的研究相比，具有成本低，氫氣轉(zhuǎn)化率高，易于工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)勢。

2.3.4 w-14菌株以秸稈酵解物為基質(zhì)產(chǎn)氫發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3可知，w-14菌株以秸稈酵解物為基質(zhì)最佳產(chǎn)氫發(fā)酵條件為:接種量為10%，溫度為37℃，初始 pH值為7.0，菌齡16 h，在此條件下菌株的產(chǎn)氫量和平均產(chǎn)氫速率最大，分別為140.24 mL/g-cs和12.19 mL/(g-cs·h)。分別以產(chǎn)氫量和平均產(chǎn)氫速率為指標(biāo)，其影響因素的均表現(xiàn)為:D(溫度)＞C(接種量)＞B(初始pH)＞A(菌齡)。優(yōu)化后w-14菌株利用秸稈酵解物的產(chǎn)氫量比優(yōu)化前提高40.66%。

2.3.5 w-14菌株利用玉米秸稈酵解物發(fā)酵產(chǎn)氫放大實(shí)驗(yàn)

由圖9可見，5 L厭氧反應(yīng)器中菌株w-14利用秸稈酵解物產(chǎn)氫的累積產(chǎn)氫量與氫氣濃度(累積產(chǎn)氫量占總氣體的百分含量)隨時間的變化，在0～36 h累積產(chǎn)氫隨著發(fā)酵時間增加迅速增加，累積氫產(chǎn)量達(dá)到142.65 mL/g-cs，其后產(chǎn)氫量增加的速度有所減緩，并逐漸趨于穩(wěn)定;發(fā)酵培養(yǎng)至56 h時產(chǎn)氫基本結(jié)束，累積氫產(chǎn)量為149.09 mL/g-cs，與正交試驗(yàn)結(jié)果140.24 mL/g-cs一致。其氫氣濃度也呈現(xiàn)是先增加后減少趨勢，24 h時氫氣濃度達(dá)到最高54.62%。隨著w-14菌進(jìn)入穩(wěn)定生長期，底物逐漸消耗，氫氣濃度開始緩慢下降，至56 h時發(fā)酵結(jié)束，氫氣濃度降到30.23%。

圖9 累積產(chǎn)氫量與氫氣濃度隨時間的變化曲線Fig.9 The curve of cumulative H2yield and H2 percentage of mix gas vs.time

3 小結(jié)

從鈾礦中分離獲得1株可利用玉米秸稈的高效產(chǎn)氫菌w-14，經(jīng)生理生化及16S rRNA基因序列分析鑒定w-14為丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，與已有研究的丁酸梭菌相比，該菌株非嚴(yán)格厭氧菌，深層培養(yǎng)即可，更利于工業(yè)化生物氫能源生產(chǎn)。w-14菌株以經(jīng)KQ-麩曲發(fā)酵后的玉米秸稈酵解物為基質(zhì)，進(jìn)行5L深層厭氧發(fā)酵，在種齡16 h，接種量10%，pH值7.0，產(chǎn)氫發(fā)酵溫度37℃條件下累積產(chǎn)氫量達(dá)149.09 mL/g-cs。本研究獲得的利用秸稈酵解物發(fā)酵產(chǎn)氫的菌株w-14以及對玉米秸稈的酵解處理工藝對開發(fā)利用可再生生物質(zhì)，轉(zhuǎn)化生產(chǎn)潔凈氫能源具有一定的理論研究意義和的應(yīng)用價值。

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