無(wú)梗五加果中抗氧化物質(zhì)的提取

馮穎，趙琳娜

(沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)，110866)

無(wú)梗五加(Acanthopanax sessiliflorum)又名五加皮、刺拐棒等，為五加科Araliaceae五加屬多年生藥膳兩用植物［1］，通常山地野生，分布在東北、河北、朝鮮等地［2－3］。

近年來(lái)，多種研究表明，人體疑難疾病的發(fā)生機(jī)理與體內(nèi)自由基產(chǎn)生過(guò)多或機(jī)體清除自由基能力下降有著極為密切的關(guān)系［4］，因此，從植物中提取天然的抗氧化物質(zhì)和開(kāi)發(fā)具有抗氧化功能的食品越來(lái)越受到廣泛的關(guān)注和重視。

無(wú)梗五加果富含黃酮、多糖、花色苷等多種抗氧化物質(zhì)［5－6］，作為抗氧化食品開(kāi)發(fā)具有巨大的潛力。目前關(guān)于其抗氧化物質(zhì)的提取研究報(bào)道主要是針對(duì)其中的某一類(lèi)成分，對(duì)其總抗氧化物質(zhì)提取的系統(tǒng)研究報(bào)道較少［7－8］，本研究以丹東農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供的無(wú)梗五加果作為原料，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法分析，以無(wú)梗五加果提取液總抗氧化能力為響應(yīng)值，對(duì)其總抗氧化物質(zhì)的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，獲得最優(yōu)工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

無(wú)梗五加果:人工栽培品種，由遼寧省丹東農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

無(wú)水乙醇(分析純)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;T-AOC試劑盒，南京建成生物科技有限公司。

7200型可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼克(上海)有限公司;電子天平，上海精密科學(xué)儀器廠(chǎng);UV-1600型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司;超聲波反應(yīng)器(KQ-250A型)，昆山市超聲儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司;TDL-5000B型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)梗五加果中抗氧化物質(zhì)的提取工藝

無(wú)梗五加干燥果實(shí)→粉粹過(guò)40目篩→超聲提取→離心→定容至100 mL→總抗氧化能力測(cè)定

1.2.2 單因素試驗(yàn)

以無(wú)梗五加干燥果為原料，以樣品的總抗氧化能力為考察對(duì)象，分別以提取劑、料液比、提取溫度、提取時(shí)間、超聲功率5個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)提取液總抗氧化能力的影響。

1.2.2.1 提取劑的選擇

料液比1∶50(g∶mL)，提取溫度 50℃，提取時(shí)間30 min，功率為250 W條件下考察提取劑為蒸餾水以及乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為10%、30%、50%、70%時(shí)對(duì)提取液總抗氧化能力的影響。

1.2.2.2 料液比的選擇

蒸餾水為提取溶劑，提取溫度50℃，提取時(shí)間30 min，超聲功率250 W條件下考察料液比分別為1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 時(shí)對(duì)提取液總抗氧化能力的影響。

1.2.2.3 提取溫度的篩選

蒸餾水為提取溶劑，料液比為1∶60，提取時(shí)間30 min，超聲功率250 W條件下考察提取溫度分別為 30、40、50、60、70℃ 時(shí)對(duì)提取液總抗氧化能力的影響。

1.2.2.4 提取時(shí)間的篩選

蒸餾水為提取溶劑，料液比為1∶60、提取溫度60℃，超聲功率250 W條件下考察提取時(shí)間分別為15、30、45、60、75 min 時(shí)對(duì)提取液總抗氧化能力的影響。

1.2.2.5 超聲功率的篩選

蒸餾水為提取溶劑，料液比為1∶60、提取溫度60℃，提取時(shí)間為30 min條件下考察超聲功率分別為 150、175、200、225、250 W 時(shí)對(duì)提取液總抗氧化能力的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)所得的結(jié)果，以無(wú)梗五加果提取液總抗氧化能力為響應(yīng)值，對(duì)超聲波提取無(wú)梗五加果中抗氧化物質(zhì)影響較大的3個(gè)因素提取溫度、提取時(shí)間、超聲功率進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。利用Design Expert8.0軟件進(jìn)行工藝參數(shù)的優(yōu)化組合，采用Box-Behnken響應(yīng)面分析得到回歸模型和優(yōu)化的工藝參數(shù)。

1.2.4 總抗氧化能力(TAC)測(cè)定

分別取等濃度和等體積的各樣品液，按TAC測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書(shū)測(cè)定各樣品液TAC。定義為在37℃時(shí)，每min每mL各樣品液使反應(yīng)體系的吸光度(OD)值增加0.01為1個(gè)TAC單位(u)，即表示為u/mL。取樣及測(cè)定均重復(fù)3次，取平均值記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取劑對(duì)提取液的總抗氧化能力的影響

提取劑對(duì)提取液總抗氧化能力的影響見(jiàn)圖1。

圖1 提取劑對(duì)提取液總抗氧化能力的影響Fig.1 Effect of extractant on total antioxidant capacity

從圖1可以看出，隨著乙醇濃度的提高，提取液總抗氧化能力逐漸下降，蒸餾水提取所得提取液抗氧化能力最強(qiáng)，說(shuō)明無(wú)梗五加果中的大部分抗氧化物質(zhì)具有水溶性，故以水作為無(wú)梗五加果中抗氧化物質(zhì)的提取劑進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 料液比對(duì)提取液的總抗氧化能力的影響

料液比對(duì)提取液總抗氧化能力的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 料液比對(duì)提取液總抗氧化能力的影響Fig.2 Effect of material/liquid ratio on total antioxidant capacity

從圖2可以看出，隨著提取劑用量的增加，所得提取液的總抗氧化能力也在逐漸增加，當(dāng)料液比為1∶60(g∶mL)時(shí)，總抗氧化能力達(dá)到最大，料液比繼續(xù)增大，提取液抗氧化能力略有下降。

2.1.3 提取溫度對(duì)提取液的總抗氧化能力的影響

提取溫度對(duì)提取液總抗氧化能力的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取溫度對(duì)提取液總抗氧化能力的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on total antioxidant capacity

從圖3可以看出，提取液總抗氧化能力隨著提取溫度的升高而逐漸增加，當(dāng)提取溫度達(dá)到60℃時(shí)，總抗氧化能力達(dá)到最高值，溫度繼續(xù)增加，總抗氧化能力變化不明顯。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)提取液總抗氧化能力的影響

提取時(shí)間對(duì)提取液總抗氧化能力的影響結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取時(shí)間對(duì)提取液總抗氧化能力的影響Fig.4 Effect of extraction time on total antioxidant capacity

從圖4可以看出，隨著提取時(shí)間的增加，提取液總抗氧化能力增加，在30 min時(shí)達(dá)到最大值，提取時(shí)間繼續(xù)增加，抗氧化物質(zhì)在超聲波的作用下被破壞分解，提取液總抗氧化能力反而逐漸下降，所以選擇提取時(shí)間30 min最佳。

2.1.5 超聲功率對(duì)提取液的總抗氧化能力的影響

提取功率對(duì)提取液總抗氧化能力的影響結(jié)果如圖5所示。

圖5 超聲功率對(duì)提取液總抗氧化能力的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on total antioxidant capacity

從圖5可以看出，隨著超聲波功率的提高，總抗氧化能力隨之逐漸增加，當(dāng)功率為225 W時(shí)提取液總抗氧化能力出現(xiàn)峰值，功率繼續(xù)提高，總抗氧化能力下降。原因可能是功率加大導(dǎo)致提取物中活性成分分解以至于抗氧化能力下降，所以提取功率選擇225 W最佳。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝參數(shù)

2.2.1 試驗(yàn)因素和水平的選擇

綜合上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，以無(wú)梗五加果提取液總抗氧化能力為響應(yīng)值，選取對(duì)超聲波提取無(wú)梗五加果中抗氧化物質(zhì)影響較大的三個(gè)因素提取溫度、提取時(shí)間、超聲功率進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

2.2.2 響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)Design Expert8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行安排，試驗(yàn)結(jié)果分析見(jiàn)表2、表3。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

表2 響應(yīng)面分析方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Program and experimental results of RSA

表3 總抗氧化能力回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression equation for the yield of total antioxidant capacity

對(duì)響應(yīng)值以及各因素進(jìn)行擬合，得到關(guān)于總抗氧化能力的回歸方程如下:

變量模型P＜0.01，達(dá)到極顯著水平，回歸方程失擬檢驗(yàn)P＞0.05，差異不顯著，說(shuō)明所得的回歸方程擬合程度良好。表3方差分析結(jié)果表明方程的一次項(xiàng)提取時(shí)間(X2)對(duì)響應(yīng)值總抗氧化能力的影響極顯著，超聲功率(X3)對(duì)響應(yīng)值的影響顯著;交互項(xiàng)X2X3對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著，X1X2對(duì)響應(yīng)值的影響顯著;二次項(xiàng)X12、X22、X32對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著，由此可知，各具體試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響并非是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系。

2.2.3 響應(yīng)面曲面直觀(guān)分析

圖6 提取溫度和提取時(shí)間交互作用對(duì)總抗氧化能力的影響Fig.6 Response surface and contour plots showing the interactive effects of temperature and time on total antioxidant capacity

圖7 提取時(shí)間和超聲功率交互作用對(duì)總抗氧化能力的影響Fig.7 Response surface and contour plots showing the interactive effects of time and power on total antioxidant capacity

從圖6可以看出，提取溫度對(duì)提取液總抗氧化能力的影響變化趨勢(shì)受提取時(shí)間的交互作用的影響。當(dāng)提取時(shí)間較大時(shí)，提取液總抗氧化能力偏低且隨著提取溫度的升高先增加后下降的趨勢(shì)更加明顯。

從圖7可以看出，提取時(shí)間對(duì)提取液總抗氧化能力的影響變化趨勢(shì)受超聲功率的交互作用的影響。在所考察的功率范圍內(nèi)，當(dāng)超聲功率較大時(shí)，總抗氧化能力隨提取時(shí)間的增加先逐漸增大后減小，當(dāng)超聲功率較小時(shí)，總抗氧化能力隨提取時(shí)間的增加而逐漸下降。

從圖8可以看出，提取溫度對(duì)提取液總抗氧化能力的影響變化趨勢(shì)不受超聲功率的交互作用的影響。在所考察功率范圍內(nèi)，提取液總抗氧化能力均呈現(xiàn)先增加后下降的相同趨勢(shì)。

2.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷尿?yàn)證

通過(guò)回歸方程可以得到最優(yōu)的預(yù)測(cè)值，即提取溫度60.84℃，提取時(shí)間27.65 min，超聲功率226.88 W，此時(shí)總抗氧化能力的理論值可達(dá)88.440 9 u/mL。結(jié)合實(shí)際操作，優(yōu)化工藝參數(shù)，即提取溫度61℃，提取時(shí)間28 min，超聲功率227 W。并對(duì)最佳條件做了3次重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，平均總抗氧化能力為(88.257 2±0.342 3)u/mL，所得參數(shù)較為可靠。

圖8 提取溫度和超聲功率交互作用對(duì)總抗氧化能力的影響Fig.8 Response surface and contour plots showing the interactive effects of temperature and power on total antioxidant capacity

3 結(jié)論

(1)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了各參數(shù)，并結(jié)合實(shí)際操作選擇了無(wú)梗五加果抗氧化活性物質(zhì)提取的最優(yōu)工藝條件:提取溫度61℃，提取時(shí)間28 min，超聲功率227 W。并對(duì)最佳條件做了3次重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，平均總抗氧化能力為(88.257 2±0.342 3)u/mL，說(shuō)明響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析能較準(zhǔn)確地對(duì)提取抗氧化物質(zhì)的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

(2)由試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，對(duì)總抗氧化能力影響最大的因素是提取時(shí)間，其次是超聲功率，影響最小的是提取溫度。提取時(shí)間和超聲功率交互作用對(duì)總抗氧化物質(zhì)的提取效果影響極顯著，提取溫度和提取時(shí)間交互作用對(duì)總抗氧化物質(zhì)的提取效果影響顯著。

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