哈爾濱地區(qū)新城疫病毒的分離鑒定及部分生物學(xué)特性研究

梁宏志（哈爾濱市動(dòng)物衛(wèi)生防疫站，哈爾濱　150016）

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哈爾濱地區(qū)新城疫病毒的分離鑒定及部分生物學(xué)特性研究

梁宏志
（哈爾濱市動(dòng)物衛(wèi)生防疫站，哈爾濱150016）

摘要：2012年4月～2014年4月，從哈爾濱市18個(gè)地區(qū)雞場(chǎng)中疑似新城疫（ND）發(fā)病雞群體內(nèi)分離到6株具有血凝活性的病毒，經(jīng)血凝試驗(yàn)（HA）、血凝抑制試驗(yàn)（HI）和電鏡觀察證實(shí)了6株病毒為新城疫病毒（NDV）。經(jīng)蝕斑純化后進(jìn)行生物學(xué)特性的研究顯示，其雞胚平均死亡時(shí)間（MDT）和1日齡雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI）分別為37.2～60.8 h、1.71～1.80，說(shuō)明該病毒屬于NDV強(qiáng)毒株或中強(qiáng)毒株。

關(guān)鍵詞：哈爾濱；新城疫病毒；分離鑒定；生物學(xué)特性

新城疫（ND），也叫亞洲雞瘟，是一種由副黏病毒引起的高度接觸性傳染病。哈爾濱地區(qū)養(yǎng)雞生產(chǎn)每年都有該病流行，病死率較高。近年來(lái)，盡管大劑量、多次使用弱毒疫苗和滅活疫苗，新城疫仍是養(yǎng)雞業(yè)一種常見(jiàn)病和多發(fā)病，新城疫病毒（NDV）在強(qiáng)大的免疫壓力下導(dǎo)致F基因發(fā)生變異，出現(xiàn)強(qiáng)毒株，給養(yǎng)雞生產(chǎn)帶來(lái)極大的危害。

本試驗(yàn)以2012年4月～2014年4月從哈爾濱市18個(gè)地區(qū)、不同養(yǎng)殖條件下分離自雞體內(nèi)的NDV作為研究對(duì)象，采用傳統(tǒng)的生物學(xué)特性鑒定方法對(duì)不同的NDV分離株進(jìn)行致病力測(cè)定、生物學(xué)特性比較分析，旨在了解哈爾濱地區(qū)NDV的分布、毒力強(qiáng)弱及流行情況，同時(shí)也將為制定科學(xué)的ND防制措施提供參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1病料來(lái)源

2012年4月～2014年4月，哈爾濱市動(dòng)物衛(wèi)生防疫站先后從哈爾濱市18個(gè)地區(qū)的196個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)采集的216份疑似NDV病料采集見(jiàn)表1，取病死雞腦、肝和腺胃等組織共分離得到6株雞源的NDV強(qiáng)度，分別命名為HRB1、HRB2、HRB3、HRB4、HRB5、HRB6。

表1　 216份疑似新城疫病毒病料采集

1.1.2參考毒株及陽(yáng)性血清

NDV弱毒株LaSota及其陽(yáng)性血清均購(gòu)自于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.3試驗(yàn)動(dòng)物

9～12日齡無(wú)特定病原體（SPF）雞胚由中國(guó)農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)置。

1.1.4主要儀器

BECKMAN臺(tái)式離心機(jī)、超速離心機(jī)、超凈工作臺(tái)等。

1.1.5主要試劑

蝕斑純化試驗(yàn)試劑包括胰酶、Hank's營(yíng)養(yǎng)使用液、DMEM營(yíng)養(yǎng)液、營(yíng)養(yǎng)瓊脂糖、1%中性紅的配制等。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1病毒的分離與增殖

采集病死雞的腦、肝、脾、肺和腺胃等組織，剪碎、研磨后加入滅菌生理鹽水配成1?4組織懸液，反復(fù)凍融3次，3 000 rpm離心20 min后，取上清液加雙抗保持濃度為1 000 U·mL-1，37℃作用2 h，然后進(jìn)行溶液的細(xì)菌檢驗(yàn)。細(xì)菌檢驗(yàn)合格的樣品溶液取0.2 mL于10日齡的SPF雞胚的尿囊腔接種，去除接種后24 h內(nèi)死亡雞胚，將48～96 h死亡的雞胚置4℃保鮮過(guò)夜后無(wú)菌采集雞胚尿囊液，然后觀察接種雞胚的病理變化情況，將該尿囊液稀釋1 000倍再進(jìn)行1次雞胚接種，重復(fù)2次后收集尿囊液，進(jìn)行血凝實(shí)驗(yàn)（HA）和血凝抑制實(shí)驗(yàn)（HI）實(shí)驗(yàn)。

1.2.2血凝實(shí)驗(yàn)和血凝抑制實(shí)驗(yàn)

1%雞紅細(xì)胞懸液配制：用枸櫞酸鈉3.8%抗凝成年非免疫公雞血液，將采集的雞血按1?50加入生理鹽水，2 000 rpm，離心3～4 min，用吸管吸出上清液和沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，棄去。在沉淀的紅細(xì)胞上滴加稀釋液，充分混合，反復(fù)洗滌3次后加入生理鹽水配成1%濃度，4℃可保存7～ 10 d。

四單位抗原的配制：以能引起紅細(xì)胞100%凝集的病毒最高稀釋度作為終點(diǎn)，即1個(gè)HA單位，終點(diǎn)滴度除以4即為含4HA單位的抗原。例如：如果血凝的終點(diǎn)滴度為1?256，則4個(gè)血凝單位的應(yīng)是1?64，此例中將1 mL抗原加入63 mL生理鹽水，即為4HA單位抗原。

HA實(shí)驗(yàn)和HI實(shí)驗(yàn)：按常規(guī)微量法（25 μL）（GB/ T 18936-2003）進(jìn)行。

1.2.3電鏡觀察

取雞胚接種后采集的病毒尿囊液1 000 g，4℃離心10 min，取上清，磷鎢酸2%負(fù)染，透射電鏡下觀察拍照，電鏡由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

1.2.4毒株的統(tǒng)一命名規(guī)則

按照分離地區(qū)、毒株號(hào)、分離年代以及分離來(lái)源的動(dòng)物種類(lèi)命名見(jiàn)表2。

表2　各分離株的宿主和來(lái)源

1.2.5病毒的蝕斑純化

雞胚成纖維原代細(xì)胞的制備：取10日齡SPF雞胚無(wú)菌取出胚胎置于無(wú)菌平皿，用剪子將其剪碎，再用D-Hank'S液反復(fù)沖洗，后于組織沉淀物中加入胰酶0.25%，37℃溫度下消化，后棄去上層液體，再用D-Hank'S液反復(fù)洗滌，對(duì)其營(yíng)養(yǎng)后用吸管充分吹打分散細(xì)胞，然后過(guò)濾除掉殘?jiān)?，按每個(gè)雞胚60 mL的量補(bǔ)加Hank's營(yíng)養(yǎng)使用液，再充分吹打混勻，分置細(xì)胞培養(yǎng)瓶中37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

雞胚成纖維繼代細(xì)胞的制備：將長(zhǎng)成單層的原代成纖維細(xì)胞用0.25%胰酶消化，用DMEM配至6孔板中，37℃培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞長(zhǎng)成致密單層后備用。

單層蝕斑技術(shù)：反復(fù)洗滌細(xì)胞板，洗去死亡脫落細(xì)胞和殘余血清。以無(wú)血清的DMEM將待純化病毒的尿囊液做稀釋后取病毒懸液接種于單層細(xì)胞上，輕晃，使病毒與細(xì)胞充分接觸，吸附完畢后吸去病毒液，沖洗并除去未吸附病毒。之后鋪第一層不含中性紅的營(yíng)養(yǎng)瓊脂糖，待瓊脂凝固后倒置培養(yǎng)于37℃CO2培養(yǎng)箱中。48 h后細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)鋪第二層含中性紅的營(yíng)養(yǎng)瓊脂糖培養(yǎng)基，凝固后，倒置于37℃培養(yǎng)箱中4～12h，待出現(xiàn)蝕斑后即可挑斑。

1.2.6蝕斑克隆化

根據(jù)病毒蝕斑的形態(tài)、大小選擇具有代表性的3個(gè)中等大小蝕斑作好標(biāo)記，然后吸取蝕斑，放入無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液中，反復(fù)凍融3次，使病毒充分釋放，以此病毒懸液經(jīng)適當(dāng)稀釋后接種單層雞胚成纖維細(xì)胞，進(jìn)行下一輪蝕斑。如此重復(fù)3次，一般即可達(dá)到純化目的。將最后一次純化的蝕斑毒反復(fù)凍融3次后接種于9～10日齡SPF雞胚，死后收獲尿素液經(jīng)HA、HI實(shí)驗(yàn)證實(shí)為NDV后，再進(jìn)行后述試驗(yàn)。

1.2.7最小致死量致死雞胚的平均死亡時(shí)間測(cè)定

將病毒尿囊液用無(wú)菌生理鹽水作連續(xù)的稀釋?zhuān)總€(gè)稀釋度接種5枚SPF雞胚，每胚0.2 mL，同時(shí)設(shè)置5枚接種生理鹽水的雞胚做對(duì)照。37℃孵育，棄去24 h內(nèi)死亡之雞胚，之后每隔2 h觀察1次，直至120 h。能夠使所有雞胚致死的病毒的最大稀釋倍數(shù)即為病毒的最小致死量（MLD），根據(jù)MLD各雞胚的平均死亡時(shí)間（MDT），MDT計(jì)算公式見(jiàn)式1。

1.2.8 1日齡雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)的測(cè)定

取HA滴度>24的病毒尿囊液經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)后以滅菌生理鹽水做稀釋?zhuān)總€(gè)毒株接種10只1日齡的SPF雛雞，腦內(nèi)接種0.05 mL·只-1，同時(shí)設(shè)置10只注射生理鹽水對(duì)照組。所有雞均分組隔離飼養(yǎng)于負(fù)壓隔離器中，每日觀察1次，連續(xù)觀察8 d。每日觀察發(fā)病和死亡情況，死亡計(jì)2分，發(fā)病計(jì)1分，正常0分，腦內(nèi)致病指數(shù)（ICPI）計(jì)算公式見(jiàn)式2。

2　結(jié)果與分析

2.1流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果

2.1.1免疫情況

采集病料雞群中進(jìn)行免疫所選擇ND疫苗的種類(lèi)為：Ⅰ系、Lasota、C30-86、V4和B1，多數(shù)雞群采用點(diǎn)眼、滴鼻、飲水和注射等免疫途徑。

2.1.2臨床癥狀

產(chǎn)蛋雞發(fā)病的主要癥狀為食欲減退，排黃綠色稀便，不同程度的呼吸道癥狀，產(chǎn)蛋率下降10%～ 40%，出現(xiàn)白、軟皮蛋，病死率一般為5%～10%。有的雞群發(fā)病不表現(xiàn)明顯的臨床癥狀，只表現(xiàn)為過(guò)性的產(chǎn)蛋下降；有些育成雞發(fā)生癱瘓、斜頸、頭頸扭轉(zhuǎn)等神經(jīng)癥狀，零星死亡，僅有個(gè)別發(fā)病雞群有較高死亡率。但部分病例，尤其是秋冬季和春季的商品肉雞或育雛雞的典型病例呈上升趨勢(shì)，其主要特點(diǎn)是死亡率較高（10%～30%），最高可達(dá)50%，需要與高致病性禽流感進(jìn)行鑒別診斷。

2.1.3病理變化

臨床采集的病料病理剖檢變化均表現(xiàn)為眼結(jié)膜細(xì)沙樣出血，上呼吸道呈卡他性或出血性卡他性炎癥，喉頭和氣管黏膜充出血，胸腺腫大出血，腺胃乳頭出血（約占總病料數(shù)的30%），肌胃角質(zhì)層下出血（約占總病料數(shù)的45%）；小腸黏膜呈“棗核樣潰瘍”變化（約占總病料數(shù)的18%），盲腸扁桃體新鮮出血，直腸末端及泄殖腔周邊新鮮出血；產(chǎn)蛋雞生殖系統(tǒng)一般表現(xiàn)卵泡充血、出血、液化、破裂。

2.2毒株的分離、血清學(xué)鑒定

將處理的病料接種雞胚后一般在28～60 h死亡，死胚全身出血，頭部、頸部、腹部和肢端出血嚴(yán)重，尿囊液清亮，不渾濁，HA滴度為16～ 128。初代培養(yǎng)物盲傳2代后死亡時(shí)間逐漸表現(xiàn)規(guī)律，血凝價(jià)可上升1～2個(gè)滴度。所有代次的NDV分離株尿囊液均可凝集1%的SPF雞紅細(xì)胞，HA為1?16～1?216；均可被NDV弱毒株（LaSota）陽(yáng)性血清所抑制，HI分別為1?16～1?526，不被禽流感病毒（AIV）陽(yáng)性血清所抑制。

2.3蝕斑純化結(jié)果

不同的NDV毒株在無(wú)胰酶的細(xì)胞培養(yǎng)物上形成蝕斑的能力、出斑時(shí)間、蝕斑的大小及形態(tài)均存在不同程度的差異。有的毒株在覆蓋第二層含中性紅的瓊脂糖后3～4 h就隱約可見(jiàn)蝕斑的出現(xiàn)，一般在感染后72～96 h各類(lèi)蝕斑均明顯可見(jiàn)。試驗(yàn)檢測(cè)的6個(gè)NDV分離毒株均能在單層雞胚成纖維細(xì)胞上形成無(wú)色透明的清亮型蝕斑。顯微鏡下觀察清亮蝕斑的中心有一些不著色的死細(xì)胞。蝕斑的形態(tài)多為圓形，也有一些呈不規(guī)則形，但均與正常細(xì)胞之間界限清楚，容易辯認(rèn)。顯微鏡下NDV蝕斑形態(tài)見(jiàn)附圖。

附圖　顯微鏡下新城疫病毒蝕斑形態(tài)

2.4平均死亡時(shí)間測(cè)定結(jié)果

將6個(gè)NDV分離株以各自的最小致死量接種雞胚后，除接種生理鹽水對(duì)照組全部存活外，多數(shù)接種雞胚均在37～61 h內(nèi)死亡，死亡時(shí)間較短，個(gè)別雞胚死亡時(shí)間為36 h。所有的死亡雞胚均可見(jiàn)到NDV典型的出血性病變，以頭、頸、肢體和翅端出血最嚴(yán)重，死亡雞胚均有血凝活性。不同毒株的MLD及MDT測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　新城疫病毒分離株平均死亡時(shí)間測(cè)定結(jié)果

由表3可知，6株NDV分離株全為強(qiáng)毒株，依據(jù)MDT指數(shù)進(jìn)一步分為速發(fā)型毒株（HRB2～6，MDT< 60 h）和中發(fā)型毒株（HRB1，MDT在60～90 h）。

2.5腦內(nèi)致病指數(shù)測(cè)定結(jié)果

所有腦內(nèi)接種NDV毒株的1日齡雛雞大多在3 d內(nèi)死亡，而生理鹽水對(duì)照組在觀察8 d內(nèi)全部正常。接毒雛雞主要癥狀表現(xiàn)為精神不振、呼吸困難、流黏涎、閉眼臥地不起、排黃綠色稀糞，個(gè)別表現(xiàn)典型神經(jīng)癥狀，最后癱瘓死亡。個(gè)別發(fā)病死雞表現(xiàn)為喙發(fā)紺、眼部有分泌物、眼瞼黏連、嗉囊脹氣。NDV分離株ICPI測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　新城疫病毒分離株腦內(nèi)致病指數(shù)的結(jié)果

由表4可知，NDV分離株ICPI指數(shù)測(cè)定結(jié)果判定，6個(gè)NDV分離株中均為速發(fā)型毒株（ICPI值為1.6～2.0）。

3討論

3.1新城疫病毒生物學(xué)特性調(diào)查

NDV的HN蛋白與特定動(dòng)物紅細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，可使雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集，據(jù)此特性，再結(jié)合抗血清的特異性抑制作用所建立的HA和HI實(shí)驗(yàn)已成為新城疫診斷的常規(guī)血清學(xué)方法。本研究在哈爾濱地區(qū)雞ND流行病學(xué)調(diào)查的基礎(chǔ)上，結(jié)合臨床癥狀、剖檢變化、HA和HI實(shí)驗(yàn)，初步分離和鑒定了6株新城疫病毒。由于基層保存及運(yùn)送條件的限制，有些送檢病料由于長(zhǎng)時(shí)間暴露于外界環(huán)境中，導(dǎo)致病毒的毒力降低，因此將這些分離到的毒株經(jīng)過(guò)除菌后接種SPF雞胚，不僅可以使毒株的毒力復(fù)壯，而且可以使這些毒株具有相同的增殖條件，增加了相互間的可比性。另外，哈爾濱地區(qū)的免疫雞群多發(fā)生非典型新城疫，即使經(jīng)多次免疫仍然發(fā)生該病，為了排除疫苗毒株的干擾，在進(jìn)行分離毒株的生物學(xué)特性研究之前，有必要對(duì)所分離的毒株進(jìn)行純化。

目前，通用的NDV生物學(xué)特性研究指標(biāo)主要有雞胚M(jìn)LD的MDT、一日齡雛雞ICPI和6周齡雞靜脈接種致病指數(shù)（IVPI）三項(xiàng)指標(biāo)。一般認(rèn)為ND強(qiáng)毒株的MDT為30～60 h，ICPI≥1.6，接種雞表現(xiàn)為頭部水腫、下痢，在4～8 d內(nèi)死亡，腸道有嚴(yán)重出血；中等毒力毒株MDT為60～90 h，ICPI為0.6～ 1.5，接種雞不表現(xiàn)強(qiáng)毒接種癥狀，只出現(xiàn)局部組織器官出血，少數(shù)發(fā)生共濟(jì)失調(diào)或麻痹；弱毒株MDT>90 h，ICPI<0.5，接種雞不發(fā)病、不死亡。本試驗(yàn)的6個(gè)毒株經(jīng)過(guò)MDT和ICPI測(cè)定結(jié)果表明，6個(gè)地區(qū)分離到的毒株全部為NDV強(qiáng)毒株。

3.2新城疫病毒分離物的蝕斑克隆與純化

目前，由于ND免疫接種的普及和流行毒株的廣泛存在，在臨床發(fā)病或死亡雞體內(nèi)常可同時(shí)分離到多種疫苗毒株與自然野毒株。如果不進(jìn)行分離株的純化而直接用于生物學(xué)研究，則容易造成結(jié)果的混亂，甚至產(chǎn)生假象。因此，采用將分離到的NDV提取物用蝕斑克隆法進(jìn)行純化，選擇在疫病流行（或發(fā)?。┻^(guò)程中起主導(dǎo)作用的毒株作進(jìn)一步的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在無(wú)胰酶或鎂離子存在的情況下，低毒力NDV在細(xì)胞培養(yǎng)物中不能形成蝕斑，而強(qiáng)毒及中等毒力毒株可以形成蝕斑，因此很容易排除疫苗毒的干擾[ 1 ]。本試驗(yàn)同時(shí)證明NDV分離物在無(wú)胰酶的細(xì)胞培養(yǎng)物上形成蝕斑的能力可在臨床的快速診斷上作為一種簡(jiǎn)單的體外檢查NDV病毒毒力的方法。在蝕斑大小、形態(tài)與毒力的關(guān)系研究過(guò)程中，認(rèn)為蝕斑的大小與毒力成正比，也就是說(shuō)能形成大蝕斑的毒株是強(qiáng)毒株，但并非所有強(qiáng)毒株都能形成大蝕斑[ 2-7 ]。在本研究中所有6株NDV均能形成中蝕斑或大蝕斑。

4結(jié)論

本研究采集哈爾濱18個(gè)地區(qū)的196個(gè)代表性養(yǎng)殖場(chǎng)所提供的216份病料，分離出HRB1、HRB2、HRB3、HRB4、HRB5、HRB6共6株強(qiáng)毒株，表明哈爾濱地區(qū)雞群中存在ND強(qiáng)毒株。

研究發(fā)現(xiàn)，從很多非典型ND發(fā)病雞群中分離到的病毒是疫苗源的弱毒，而不是野外強(qiáng)毒感染造成。說(shuō)明應(yīng)用疫苗進(jìn)行免疫接種，控制了ND的大規(guī)模流行，但由于哈爾濱地區(qū)各種雞場(chǎng)制定的免疫程序不統(tǒng)一、免疫方法不當(dāng)以及各廠家疫苗質(zhì)量參差不齊等多種因素的影響，導(dǎo)致雞群中ND免疫失敗，從而使哈爾濱地區(qū)出現(xiàn)大量的非典型ND。這種NDV流行的復(fù)雜性給哈爾濱地區(qū)養(yǎng)雞業(yè)ND的綜合防控造成很大困難。

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Isolation and Identification of Newcastle Disease Virus and Partial Biological Characteristics Research in Harbin Area

LIANG Hongzhi
（Animal Epidemic Prevention Station of Harbin, Harbin 150016, China）

Abstract:From April 2012 to April 2014, six viral strains which have hemagglutination activity were isolated from the chicken flocks with suspected newcastle disease (ND) in 18 regions of Harbin. Through the observation re?sults of the HI, HA test and electron microscopy, it was confirmed that these virus were the newcastle disease vrius (NDV). By the biological characteristics study in the plaque purified, it was found that the mean death time (MDT) of chicken embryos and 1 day old chicks intracerebral pathogenicity index (ICPI) were between 37.2～60.8 h and 1.71～ 1.80, which belongs to the virulent strains or velogenic and mesogenic strains of NDV.

Key words:Harbin; newcastle disease virus; isolation and identification; biological characteristics

作者簡(jiǎn)介：梁宏志（1973-），遼寧興城人，碩士，高級(jí)畜牧師，主要從事動(dòng)物疾病預(yù)防與控制。

收稿日期：2015-01-26

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.65

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-0084（2015）04-0046-05