PMSG和hCG誘導(dǎo)長爪沙鼠超數(shù)排卵方案的優(yōu)化

唐 旺，李長龍，杜小燕，陳振文

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069）

PMSG和hCG誘導(dǎo)長爪沙鼠超數(shù)排卵方案的優(yōu)化

唐 旺，李長龍，杜小燕，陳振文

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069）

目的優(yōu)化PMSG和hCG誘導(dǎo)長爪沙鼠超數(shù)排卵方案。方法通過對動物周齡、激素劑量和間隔時間等系統(tǒng)研究，優(yōu)化出用于長爪沙鼠超數(shù)排卵的最佳動物周齡、激素組合劑量和間隔時間。結(jié)果 對6周齡長爪沙鼠使用10單位激素計量及間隔70 h可以獲得最佳超數(shù)排卵效果。在合籠16 h后80%的動物得以排卵，獲卵數(shù)為32．6±3．0枚/只，其中24．8±5．4枚/只可以發(fā)育至二細(xì)胞胚胎。結(jié)論本研究獲得了利用PMSG和hCG誘導(dǎo)長爪沙鼠超數(shù)排卵的優(yōu)化方案，為長爪沙鼠胚胎生物技術(shù)研究奠定了基礎(chǔ)。

長爪沙鼠;超數(shù)排卵;孕馬血清促性腺激素;人絨毛膜促性腺激素

長爪沙鼠是源自中國的實驗動物，隨著對長爪沙鼠實驗動物化研究的不斷深入，長爪沙鼠的應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大，培育的長爪沙鼠模型品種也逐漸增多［1－9］。為了保存這些珍貴的動物資源，人們除了加強(qiáng)活體保種外，為了確保種子安全，還要開展動物胚胎冷凍保存［10］。這就需要更多的長爪沙鼠胚胎來源，超速排卵為解決胚胎來源提供了最有效途徑［11］。近年來隨著應(yīng)用長爪沙鼠開展更為深入的研究，制作轉(zhuǎn)基因和基因敲除動物已成為迫切需求，應(yīng)用長爪沙鼠開展特殊生物學(xué)特性的發(fā)育生物學(xué)研究也備受重視。但這些研究無不需要以長爪沙鼠胚胎為實驗材料，因此超數(shù)排卵就成了關(guān)鍵技術(shù)。雖然超數(shù)排卵在小鼠、金黃地鼠、大鼠等多種實驗動物已成為成熟技術(shù)，但在長爪沙鼠尚存在許多疑慮，國內(nèi)外對長爪沙鼠超數(shù)排卵方案研究中鮮有較為穩(wěn)定高效的報道，在使用動物的周齡、激素劑量及間隔時間等也存在較大差異［12－14］，極大地阻礙了應(yīng)用長爪沙鼠開展科學(xué)研究的進(jìn)程和保種規(guī)劃的實施。本研究擬利用首都醫(yī)科大學(xué)飼養(yǎng)的長爪沙鼠通過對動物周齡、激素劑量及間隔時間的對比研究，優(yōu)化出高效穩(wěn)定的長爪沙鼠超數(shù)排卵方案。通過本研究不但可為長爪沙鼠資源冷凍保存奠定基礎(chǔ)，而且將加速應(yīng)用長爪沙鼠開展科學(xué)研究的進(jìn)展，擴(kuò)大其在生命科學(xué)研究及生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雌性普通級長爪沙鼠200只，10周齡以下，體重30～60 g;雄性普通級長爪沙鼠50只，10～12周齡，體重60～80 g。所有長爪沙鼠均來自首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部，飼養(yǎng)于控制溫濕度的普通環(huán)境中【SYXK(京）2013－0005】。

1.2 試劑和儀器

孕馬血清促性腺激素(PMSG）購自寧波第二激素廠(批號：140324），人絨毛膜促性腺激素(hCG）購自寧波第二激素廠(批號：140322），M2培養(yǎng)基(M7167，Sigma），M16培養(yǎng)液(M7292，Sigma），透明質(zhì)酸酶(H1136，Sigma），生理鹽水，75%酒精等。35 mm無菌塑料培養(yǎng)皿，體視顯微鏡，倒置顯微鏡，CO2培養(yǎng)箱，超凈工作臺，滅菌手術(shù)器械(眼科剪、眼科鑷、顯微剪和顯微鑷等）。

1.3 實驗設(shè)計

1．3．1 動物周齡的優(yōu)化

隨機(jī)挑選5、6、7、8、9、10周齡的長爪沙鼠，每組20只，注射劑量為10 IU PMSG/hCG。激素注射間隔時間50 h，激素注射方式為腹腔注射，注射hCG后合籠，次日檢查陰道栓并取卵。

1．3．2 激素劑量的優(yōu)化

隨機(jī)將12只6周齡雌性沙鼠分為4組，每組3只，劑量分別為5、10、20、30 IU的PMSG/hCG。激素注射間隔時間50 h，激素注射方式為腹腔注射，注射hCG后合籠，次日檢查陰道栓并取卵。

1．3．3 激素間隔時間的優(yōu)化

隨機(jī)將60只6周齡雌性沙鼠分為3組，每組20只，劑量為10 IU的PMSG/hCG。激素注射間隔時間分別為50 h、70 h和90 h，激素注射方式為腹腔注射，注射hCG后合籠，次日檢查陰道栓并取卵。

1.4 取卵步驟

注射hCG后并與雄鼠合籠16～17 h后，在漏底飼養(yǎng)籠下托盤上檢查陰道栓脫落情況，并將超數(shù)排卵使用的雌性長爪沙鼠脫頸處死，俯臥噴灑75%酒精，打開背側(cè)腹腔，分別取出兩側(cè)輸卵管和卵巢置于盛有M2培養(yǎng)液液滴的培養(yǎng)皿中，在體視顯微鏡下，用顯微鑷撕開輸卵管膨大的壺腹部，釋出卵母細(xì)胞－卵丘細(xì)胞復(fù)合體，重復(fù)檢查確保將所有卵母細(xì)胞取出。將卵母細(xì)胞－卵丘細(xì)胞復(fù)合體收集到含有0．1%透明質(zhì)酸酶的M2液滴中，處理3～5 min，移入M2液滴中，洗滌3次，在體視顯微鏡和倒置顯微鏡下觀察，計算卵母細(xì)胞數(shù);移入M16液滴中，放入CO2培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)，次日統(tǒng)計二細(xì)胞胚胎數(shù)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

對于不同激素劑量、不同周齡以及不同激素間隔時間各組間的比較，采用單因素方差分析方法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P ＜0．05的值在統(tǒng)計學(xué)上具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 動物周齡對超數(shù)排卵的影響

通過注射10 IU激素劑量，激素間隔時間為50 h，對不同周齡(10周齡及以下）長爪沙鼠進(jìn)行超排，結(jié)果顯示：5及以下周齡長爪沙鼠沒有檢查到陰道栓，取卵數(shù)為0;9～10周齡動物獲得平均7．1～7．6枚卵;6～8周齡鼠的動物平均每只獲得14．6～17．5枚卵。統(tǒng)計結(jié)果表明，6～8周齡動物超數(shù)排卵數(shù)量顯著高于與9～10周齡動物(P ＜0．05）;6周齡超數(shù)排卵率為80%，明顯高于其他周齡組(表1）。

2.2 激素劑量對超數(shù)排卵的影響

激素劑量是超數(shù)排卵的重要影響因素。通過腹腔注射激素，激素間隔時間50 h，對6周齡長爪沙鼠激素劑量優(yōu)化，結(jié)果如表2所示，5 IU激素劑量不能促進(jìn)長爪沙鼠排卵，取卵數(shù)為0;10～30 IU激素劑量均能產(chǎn)生超數(shù)排卵效應(yīng)，其中10 IU劑量組獲得55枚卵，每只平均取卵數(shù)為27．5枚。5 IU激素劑量組未檢測到陰道栓，在輸卵管也未發(fā)現(xiàn)排卵現(xiàn)象。10 IU以上劑量組均有排卵現(xiàn)象，排卵數(shù)隨著激素劑量的升高而降低。

表1 不同周齡長爪沙鼠注射10IU PMSG和hCG間隔50 h超數(shù)排卵效果比較Tab．1 Comparison of effects of different weeks old of Mongolian gerbils injected 10 IU PMSG and hGG at 50 hours intervals to superovulation

表2 不同劑量PMSG和hCG注射間隔時間50 h 6周齡長爪沙鼠超數(shù)排卵效果比較Tab．2 Comparison of effects of different dosages of PMSG and hGG injected at 50 hours intervals to superovulation in 6－weeks－old Mongolian gerbils

表3 不同間隔時間10 IU PMSG和hCG注射6周齡長爪沙鼠超數(shù)排卵情況比較Tab．3 Comparison of effects of different time interval of 10 IU PMSG and hGG injected to superovulation in 6－week－old Mongolian gerbils

2.3 激素給予間隔時間對超數(shù)排卵的影響

兩種激素給予間隔時間對超數(shù)排卵有很大的影響。通過10 IU激素劑量，對6周齡長爪沙鼠給予2種激素的間隔時間50 h、70 h和90 h觀察超速排卵效果，結(jié)果如表3所示，90 h未能達(dá)到超數(shù)排卵效果，平均取卵數(shù)僅為3枚;70 h獲得最佳的超數(shù)排卵效果，平均取卵數(shù)為32枚(圖1 A），發(fā)育至2－細(xì)胞(圖1 B）也更多，卵發(fā)育率由43%提高到76%，顯著優(yōu)于50 h和70 h組(P ＜0．05），圖1顯示取得的卵及其發(fā)育的2－細(xì)胞。

3 討論

排卵是由一系列極其復(fù)雜的生理過程累積而產(chǎn)生的結(jié)果，影響因素諸多，包括動物遺傳特性、體況、營養(yǎng)狀態(tài)、年齡、發(fā)情周期、卵巢功能、季節(jié)、溫度以及激素等［15］。野生和實驗室培育的長爪沙鼠均為“一雌一雄”長期同居的繁殖方式，一只死亡后另一只很難形成繁殖單元，強(qiáng)行合籠繁殖則導(dǎo)致嚴(yán)重爭斗致死［16－17］。長爪沙鼠的這種習(xí)性為后期配對增加了難點(diǎn)。為了克服這一問題，我們將離乳(4周）幼鼠雌雄分籠飼養(yǎng)，并且雄鼠(8周齡）單籠飼養(yǎng)，待實驗時，挑選合適周齡，并在注射激素后合籠，該方法可有效減少長爪沙鼠之間爭斗行為。

腹腔注射PMSG/hCG是一種有效地誘導(dǎo)長爪沙鼠超數(shù)排卵的方法。由于選擇動物隨機(jī)性，固定的發(fā)情周期對激素的作用會產(chǎn)生一定影響。年輕動物發(fā)情周期正在建立，機(jī)體自身分泌激素量少，容易受外界激素影響，此時注射激素可以降低動物自身激素對研究結(jié)果的影響。10周齡以上的長爪沙鼠在誘導(dǎo)超數(shù)排卵時，由于體內(nèi)激素影響，不僅排卵數(shù)目少(少于10枚），并且超數(shù)排卵極不穩(wěn)定，超數(shù)排卵率也低于40%，在增加激素量后也未見較好效果，故未統(tǒng)計在實驗數(shù)據(jù)中。超排長爪沙鼠9～10周齡接近性成熟，發(fā)情周期趨于穩(wěn)定，超數(shù)排卵受本身激素影響較大;5周齡及以下的雌鼠其卵巢發(fā)育未成熟，卵巢不具備排卵的能力，而6～8周齡雌鼠具備較好的超數(shù)排卵條件［12，18－19］，實驗結(jié)果也表明該年齡段可獲得良好的超數(shù)排卵效果，尤其在6周段，雌鼠超數(shù)排卵不僅排卵數(shù)目較高，而且超數(shù)排卵成功率(80%）極高。

圖1 采集的卵及發(fā)育的2－細(xì)胞胚胎Note：A：The digested eggs(×6）; B：The fertilized eggs developed to 2－cell embryos(×11．5）．Fig．1 The collected eggs and the developed 2－cell embryos

超數(shù)排卵對PMSG/hCG的注射劑量有一定要求，已有的研究報道中長爪沙鼠超數(shù)排卵使用的激素劑量范圍較大(10 ～40 IU）［12－14］，參考價值較低。一般認(rèn)為激素劑量過低，不能引起機(jī)體對激素的反應(yīng)，或者不能抵御自身發(fā)情周期所分泌的激素影響;而激素劑量過高，機(jī)體對激素負(fù)反饋調(diào)節(jié)效應(yīng)增強(qiáng)，抑制機(jī)體對激素產(chǎn)生效應(yīng);10～20 IU激素劑量能較好地克服自身發(fā)情周期影響，且不引起強(qiáng)烈的激素負(fù)反饋調(diào)節(jié)效應(yīng)，能高效地誘導(dǎo)長爪沙鼠超數(shù)排卵效果［12－14，18－19］。本研究中優(yōu)化了激素劑量，發(fā)現(xiàn)10 IU PMSG/hCG可以有效誘導(dǎo)6～8周齡長爪沙鼠超數(shù)排卵。如果實驗過程中使用年齡和體重較大的動物，可適當(dāng)增加激素劑量，以提高超數(shù)排卵效率［12，14］。

激素給予間隔時間也是超數(shù)排卵的重要影響因素。長爪沙鼠發(fā)情周期為4～6 d，PMSG/hCG的注射間隔時間需要探討。激素間隔時間過短，PMSG促進(jìn)卵泡發(fā)育尚未達(dá)到最高效應(yīng)，超數(shù)排卵后收集的卵較少;激素注射時間過長，PMSG效應(yīng)減退，不能起到超數(shù)排卵效果［12－13］。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PMSG/hCG的最佳間隔時間為70 h，同時胚胎發(fā)育率也提高至76%。

本研究得到的長爪沙鼠高效穩(wěn)定的超數(shù)排卵方案為：6周齡雌鼠，PMSG/hCG的劑量為10IU，間隔時間為70 h，注射激素后立即與雄鼠合籠，在16～17 h后取卵。本實驗中，最多單只雌鼠能取得57枚卵，其中56枚見明顯原核(即受精卵），發(fā)育至2－細(xì)胞數(shù)占90%。本研究的優(yōu)化方案大大的提高了長爪沙鼠超數(shù)排卵效率，為長爪沙鼠資源保存和胚胎生物技術(shù)研究奠定了基礎(chǔ)。

［1］聶嘉伍，王國良，任運(yùn)智，等．長爪沙鼠生物凈化的研究［J］．中國比較醫(yī)學(xué)雜志．1993，3(3，4）：135－138．

［2］聶金榮，劉金明，葉亞玉．長爪沙鼠的飼養(yǎng)管理與繁殖［J］．上海實驗動物與科學(xué)．1989，9(1）：20－22．

［3］黃繼榮，王炎，李聯(lián)濤．長爪沙鼠生物學(xué)特性調(diào)查研究［J］．寧夏農(nóng)林科技．2006，6：36－37．

［4］劉鋒華，郭紅剛，樓琦．鏈脲佐菌素誘導(dǎo)長爪沙鼠I型糖尿病模型的實驗研究［J］．中國實驗動物學(xué)報;2010，18(6）： 489－494．

［5］Honda S，F(xiàn)ujiokaT，TokiedaM，etal．CancerRes．Development of Helicobacter pylori－induced gastric carcinoma in Mongolian gerbils［J］．1998，58(19）：4255－9．

［6］Du XY，Zhu XD，Dong G，et al．Characteristics of circle of Willis variations in the mongolian gerbil and a newly established ischemia－prone gerbil group［J］．ILAR J．2011．52(1）：E1－7．

［7］李長龍，郭紅剛，石巧娟，等．長爪沙鼠高膽固醇血癥模型的建立與辛伐他汀的作用［J］．中國比較醫(yī)學(xué)雜志;2010，20 (8）：44－49．

［8］Cheal ML．The gerbil：unique model for research on aging［J］．Exp Aging Res．1986，1：3－21．

［9］姚蘋蘋，徐芳，朱函坪，等．腎綜合征出血熱的4周齡長爪沙鼠模型［J］．中國人獸共患病雜志．2005，1：60－61．

［10］劉雅琳，張益鳴．動物胚胎冷凍保存技術(shù)研究進(jìn)展［J］．上海畜牧獸醫(yī)通訊;2006，(5）：12－13．

［11］章志國，章孝榮．動物超數(shù)排卵的影響因素及發(fā)展現(xiàn)狀［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)．2003，31(1）：41－43．

［12］郭紅剛，盧領(lǐng)群，周生來，等．乙二醇玻璃化冷凍液二步法對長爪沙鼠2－細(xì)胞胚胎的冷凍保存［J］．實驗動物科學(xué)．2014，31(4）：28－31．

［13］路靜，朱祥宇，王超，等．周齡和激素水平對長爪沙鼠超數(shù)排卵效果的影響［J］．中國比較醫(yī)學(xué)雜志．2012，22(8）：15－17．

［14］Kameyama Y，K Arai，Ishijima Y．Interval between PMSG Priming and hCG Injection in Superovulation of the Mongolian Gerbil［J］．J Mamm Ova Res．2004，21：105－109．

［15］劉維俊，高珊，唐菲，等．小鼠超數(shù)排卵相關(guān)問題的探討［J］．黑龍江動物繁殖．2011，19(1）：1－9．

［16］朱景麗，王靖宇，李慧玲．長爪沙鼠的生理及行為研究初探［J］．遼東學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版）．2007，2：73－76．

［17］聶金榮，聶朝暉．長爪沙鼠行為觀察［J］．上海實驗動物科學(xué)．1995，3：154－156．

［18］盧靜，喬欣，石淑靜，等．長爪沙鼠生長繁殖性能的研究［J］．中國實驗動物學(xué)報．2004，12(2）：123－126．

［19］劉寒英，文端成，戴麗軍，等．長爪沙鼠生長與繁殖性能的主要指標(biāo)測定［J］．動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)．2004，21(12）：35－36．

The optimization scheme of Mongolian gerbils superovulation induced by PMSG and hCG

TANG Wang，LI Chang－long，DU Xiao－yan，CHEN Zhen－wen
(School of Basic Medical Science，Capital Medical University，Beijing 100069，China）

Objective To optimize the scheme of Mongolian gerbil superovulation．Methods Based on the analysis of the animal－week－old，the dose and time interval of hormone，we got the best animal－week－old，dose and time interval of hormone for Mongolian gerbil superovulation．Results The 6 week old female Mongolian gerbils which injected of 10 IU PMSG and followed by 10 IU hCG in 70 hours later could get the best superovulation．We collected eggs at 16 hour after mate with male gerbils．The ovum pick－up rate reached 80%，the number of oocytes were 32．6±3．0，the number of the fertilized egg developed to 2－cell are 24．8±5．4．Conclusions This study summarizes the optimization scheme of Mongolian gerbil superovulation induced by PMSG and hCG and it supported the foundation for Mongolian gerbils embryo biotechnology．

Mongolian gerbil;Superovulation;PMSG;hCG

A

1671－7856(2015）07－0059－05

10．3969．j．issn．1671．7856．2015．007．012

國家科技支撐計劃項目(2015BAI09B01;2011BAI15B01－32）;北京市自然基金重點(diǎn)課題(7141002）。

唐旺(1989－），男，碩士生，研究方向：實驗動物遺傳學(xué)，E－mail：522636161@qq．com。

陳振文(1959－），男，教授，博導(dǎo)，研究方向：實驗動物遺傳育種，E－mail：czwenteam@163．com。

2015－06－25