SiRNA干擾慢性炎性痛大鼠患側(cè)背根神經(jīng)節(jié)MrgC表達(dá)及PKCε磷酸化的研究

林小溪，方 芳，方劍喬，劉盈君

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，杭州 310053）

SiRNA干擾慢性炎性痛大鼠患側(cè)背根神經(jīng)節(jié)MrgC表達(dá)及PKCε磷酸化的研究

林小溪，方 芳，方劍喬，劉盈君

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，杭州 310053）

目的 觀察鞘內(nèi)注射小干擾 RNA(small interference RNA，siRNA）對(duì)完全弗氏佐劑(complete freund’s adjuvant，CFA）誘導(dǎo)的慢性炎性痛大鼠患側(cè)背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG）中MrgC(Mas－related G protein－coupled receptor C，MrgC）mRNA與蛋白表達(dá)的干擾作用，并觀察該作用對(duì)大鼠患足痛閾及患側(cè)DRG PKCε絲氨酸729點(diǎn)位磷酸化 (phosphorylation of PKCε Ser729，p－PKCε Ser729）水平的影響。方法健康雄性 SD (Sprague－Dawley，SD）大鼠16只，隨機(jī)分為對(duì)照siRNA組，MrgC siRNA組，每組8只。大鼠脊髓鞘內(nèi)插管成功后，兩組大鼠給予相應(yīng)藥物鞘內(nèi)注射4 d，1次/d，5 μg/d/只。給藥第4 d，大鼠右后足底注射CFA 0．1 mL建立慢性炎性痛模型，此后隔日注射藥物，直至給藥第11 d處死。分別于鞘內(nèi)置管前、給藥前、給藥4 d(CFA造模0 h）、給藥5 d (CFA造模24 h）、給藥11 d(CFA造模7 d）5個(gè)時(shí)點(diǎn)檢測(cè)大鼠患足機(jī)械縮腿閾(Paw withdrawal thresholds，PWTs）的變化。熒光定量PCR法檢測(cè)患側(cè)DRG MrgC的mRNA的表達(dá)，免疫熒光法檢測(cè)患側(cè)DRG MrgC表達(dá)量及p－PKCε Ser729的含量。結(jié)果 與給藥4 d比較，給藥5 d兩組大鼠的PWTs均有顯著的下降(P＜0．01）;給藥前后各時(shí)點(diǎn)，兩組大鼠之間PWTs沒有明顯差異。觀察給藥11d時(shí)大鼠患側(cè)L4－L6 DRG MrgC mRNA的表達(dá)，與對(duì)照siRNA組比較，MrgC siRNA組各神經(jīng)節(jié)MrgC mRNA的表達(dá)均明顯下降(P＜0．01）;觀察大鼠給藥11d時(shí)大鼠患側(cè)L4－L6 DRG MrgC與p－PKCε Ser729的表達(dá)，與對(duì)照siRNA組比較，MrgC siRNA組患側(cè)DRG的MrgC陽性細(xì)胞率明顯減少(P＜0．01），而p－PKCε Ser729的陽性細(xì)胞率顯著上升(P＜0．05）。結(jié)論 MrgC siRNA片段可有效干擾CFA慢性炎性痛大鼠患側(cè)L4－L6 DRG MrgC mRNA與MrgC的表達(dá)，對(duì)MrgC的干擾作用能顯著上調(diào)PKCε Ser729磷酸化的水平，但不影響大鼠患足機(jī)械縮腿閾。

小干擾RNA;MrgC;蛋白激酶C ε亞基Ser729磷酸化;慢性炎性痛;背根神經(jīng)節(jié)

慢性炎性疼痛廣泛地存在于各種疾病的進(jìn)程中，目前抑制疼痛的藥物阿片受體激動(dòng)劑嗎啡與炎性介質(zhì)抑制劑的臨床療效都不佳，而慢性疼痛相關(guān)的外周細(xì)胞與分子功能研究成為鎮(zhèn)痛研究的重要方向。

2001年發(fā)現(xiàn)的 MrgC(Mas－related G proteincoupled receptor C，MrgC）是一種新型的G蛋白偶聯(lián)受體，其基因僅在外周神經(jīng)系統(tǒng)中與痛覺調(diào)制有密切聯(lián)系的背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglion，DRG）和三叉神經(jīng)節(jié)的中小型感覺神經(jīng)元高度表達(dá)［1－2］。研究證實(shí)MrgC參與慢性炎癥引發(fā)的外周痛覺過敏的調(diào)制，但其機(jī)制遠(yuǎn)未闡明，且目前尚未有MrgC特異性抑制劑供進(jìn)一步深入研究。

細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子蛋白激酶C(protein kinase C，PKC）是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶［3］。其亞基PKCε在慢性疼痛外周痛覺敏化的形成中起著關(guān)鍵性作用［4］。PKCε磷酸化是其功能被激活的重要標(biāo)志［2，5］。研究表明MrgC的調(diào)制作用與PKC密切相關(guān)［6］，因此本實(shí)驗(yàn)擬建立完全弗氏佐劑(complete freund’s adjuvant，CFA）慢性炎性痛模型，鞘內(nèi)注射MrgC小干擾RNA(small interference RNA，siRNA），觀察該片段對(duì)大鼠患側(cè)L4－L6 DRG MrgC mRNA和受體表達(dá)的沉默作用及其對(duì)PKCε絲氨酸729點(diǎn)位磷酸化(phosphorylation of PKCε Ser729，p－PKCε Ser729）水平和機(jī)械痛的影響，為后續(xù)MrgC生理藥理功能的深入研究打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用清潔級(jí)健康雄性SD大鼠16只，體重280～300 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK (滬）2013－0016】，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)【SYXK(浙）2013－0184】，飼養(yǎng)期間給予嚙齒動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及自由飲水，12 h循環(huán)燈光，室溫23±2℃。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

MrgC抗體(批號(hào)：0121212030827，美國Abnova有限公司）;CFA(批號(hào)：051M8725，美國 Sigma公司）;山羊血清封閉液(批次：140214;BIOSS公司）;多聚賴氨酸處理載玻片(南通天盛實(shí)驗(yàn)器材有限公司）;MrgC siRNA與對(duì)照 siRNA(批號(hào)：3360;life technologies公 司）;Goatanti－rabbitIgG(批 號(hào)： A120101F13;美國 Abnova有限公司）;Anti－PKCε (phospho S729）antibody(批號(hào)F1510;美國Abnova有限公司）;抗熒光淬滅 PVP封片液(產(chǎn)品編號(hào)： p0128;碧云天生物技術(shù)研究所）;Trizol：(批號(hào)： 28218;life technologies公司）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)： RR047A，大連寶生物公司）;PCR試劑盒(批號(hào)： 1725201AP;美國Bio－Rad公司）。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

Thermo冰凍切片機(jī)(型號(hào)：HM550，美國Thermo Scientific公司）;激光共聚焦顯微鏡(型號(hào)： AIR;日本尼康公司）;紫外分光光度計(jì)(型號(hào)： smartspecTMplus，BIO－RAD公司）;熒光定量PCR儀(型號(hào)：CFX96TMReal－Time system，BIO－RAD公司）;逆轉(zhuǎn)錄儀(S1000TMThermal cycler，BIO－RAD公司）; PE導(dǎo)管(型號(hào)：PE－10，OD 0．5 mm，ID 0．25 mm;公司：寧波市科技園區(qū)安來軟件科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型制備

1．3．1 脊髓鞘內(nèi)置管模型［7－10］

大鼠禁食1 d后，水合氯醛350 mg/kg麻醉，剃除腰背部鼠毛，酒精消毒，切開皮膚，分離肌肉，暴露L5棘突，用咬骨鉗扳掉棘突，將PE－10聚乙烯管插入脊髓蛛網(wǎng)膜下腔，從L5向L2緩緩進(jìn)管約3．5 cm。見有腦脊液流出后，即封住外口，縫合肌肉和皮膚，并將PE－10管固定于淺層肌肉上。術(shù)后恢復(fù)3 d后，鞘內(nèi)給予10 μL鹽酸利多卡因，選取在30 s內(nèi)雙下肢癱瘓，5～10 min內(nèi)恢復(fù)正常的大鼠進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1．3．2 CFA慢性炎性痛模型

從大鼠右后足墊部向踝關(guān)節(jié)方向注入 CFA (0．1 mL/只），4 h后注射關(guān)節(jié)局部出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，并出現(xiàn)痛覺過敏，大鼠致炎關(guān)節(jié)腫脹疼痛可持續(xù)4周以上［11］。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

1．4．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

大鼠行鞘內(nèi)置管術(shù)后恢復(fù)5 d，檢測(cè)大鼠患側(cè)足縮腿閾，隨機(jī)分為兩組，對(duì)照 siRNA組和 MrgC siRNA組，每組8只。

1．4．2 藥物配制與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理

1．4．2．1 藥物配制

MrgC siRNA序列為［12］5'－CAUGUCAGCUAU UAUAUGUt－ps－t－3'和 3'－t－ps－t GUACAGUCGAUAA UAUACA－5';錯(cuò) 位 對(duì) 照 siRNA 序 列 為 5' CAAGUUAUC UAGUAAUUAUa－ps－t－3和 3'－t－ps－a GUU CAA UAG AUC AUU AAU A－5'。序列中的“t”代表2－O－甲基尿嘧啶核苷;“a”代表2'－O－甲基腺嘌呤;“ps”代表硫代磷酸鍵。均為life technologies公司制備。將siRNA 50 μg加入DEPC水43．3 μL配置成100 μm siRNA溶液，將siRNA加入216．5 μL的I－fectTM轉(zhuǎn)染試劑中，用槍頭輕輕攪拌，使之均勻，在室溫放置5 min，使siRNA和轉(zhuǎn)染試劑充分反應(yīng)成有效的轉(zhuǎn)染試劑siRNA復(fù)合物。

1．4．2．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理

兩組大鼠CFA造模前分別給予4 d不同藥物：對(duì)照siRNA組給予對(duì)照siRNA和MrgC siRNA組給予MrgC siRNA，第4天藥后CFA造模，造模后隔日注射相應(yīng)藥物3次，劑量均為5 μg/d/10μL。

于鞘內(nèi)置管前、給藥前、給藥4 d(CFA造模0 h）、給藥5 d(CFA造模24 h）、給藥11 d(CFA造模7 d）共計(jì)5個(gè)時(shí)點(diǎn)檢測(cè)大鼠患側(cè)足縮腿閾。

1.5 樣本制備

大鼠行腹腔水合氯醛350 mg/kg麻醉，用于免疫熒光檢測(cè)的大鼠生理鹽水經(jīng)心灌注后，再用4%多聚甲醛滴注，快速取得患側(cè)L4－L6 DRG，用4%多聚甲醛溶液固定4 h，蔗糖溶液梯度脫水(15%蔗糖溶液24 h，30%蔗糖溶液48 h），經(jīng)液氮速凍，放入－80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。用于PCR的大鼠僅灌注生理鹽水，冰上取患側(cè)L4－L6 DRG，立即置于－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1．6．1 足縮腿閾(paw withdrawal thresholds，PWTs）

以患側(cè)PWTs作為機(jī)械痛敏的評(píng)定值：測(cè)量前，將大鼠放置于透明塑料盒(69 cm×17 cm×14 cm）中適應(yīng)15 min。待大鼠安靜后，將類似Von Frey絲的金屬絲(φ0．5 mm）置于大鼠足底正中(避開足墊），從0開始以2．5 g/s遞增的強(qiáng)度刺激大鼠足底，直至引發(fā)大鼠縮足反射，記錄此時(shí)刺激強(qiáng)度，連續(xù)測(cè)量3次，每次間隔5 min，取平均值作為測(cè)定結(jié)果。設(shè)定最大刺激強(qiáng)度為50 g，截止時(shí)間為20 s，以免大鼠足爪損傷。

1．6．2 大鼠患側(cè)L4－L6 DRG中的MrgC mRNA的表達(dá)

總RNA的提?。喝〕龃笫驦4－L6 DRG，加入1 mL Trizol，冰上超聲粉碎，室溫靜置5 min，加入200 μL氯仿，混勻后劇烈震蕩，靜置15 min，4℃，11，440 r/min離心15 min，取上清液再加入500 μL異丙醇，混勻后4℃，11，440 r/min離心10 min，取沉淀加入75%乙醇1mL，用移液槍進(jìn)行輕輕吹打，4℃，10，444 r/min離心5 min，待RNA沉淀干燥后，加入0．1% DEPC水溶解。紫外分光光度法檢測(cè) OD260/ OD280的比值，并計(jì)算其濃度。取該比值在1．8～2．0之間的RNA溶液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)

逆轉(zhuǎn)錄：采用含DNA酶消化步驟的Takara的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按說明書操作，合成cDNA：吸取2 μL總RNA溶液、隨機(jī)引物、RTmix(含RNAsin和DTT）、dNTP混合液、DEPC水按照逆轉(zhuǎn)錄體系比例配制反應(yīng)體系。

定量PCR：采用 PRIMER5．0軟件設(shè)計(jì)引物，MrgC上游引物：5'－ACTCTGGCTCTTGGGATT－3'，下游引物：5'－GAGGGACCGATGCTTTT－3';采用糖酵解反應(yīng)中的甘油三磷酸脫氫酶(glyceraldehydephosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參［13］，其上游引物：5'－TGCTGAGTATGTCG TGGAG－3'，下游引物：5'－GTCTTCTGAGTGGCAGTG AT－3'，均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。參照BIORAD試劑盒，以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參，采用SYBR Green法在20 μL反應(yīng)體系中擴(kuò)增cDNA樣品。MrgC與GAPDH的反應(yīng)條件為：95℃30 s，然后95℃5 s，56℃30 s，共39循環(huán)。設(shè)置溶解曲線檢測(cè)產(chǎn)物反應(yīng)的純度65℃ ～95℃5 s，0．5℃步進(jìn)。每次擴(kuò)增的同時(shí)設(shè)置無cDNA的陰性對(duì)照，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。采用2－△CT法進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果以對(duì)照siRNA組基因表達(dá)量的倍率表示。

1．6．3 大鼠患側(cè)L4－L6 DRG中MrgC和p－PKCε的陽性細(xì)胞率的檢測(cè)

采用貼片法，DRG冰凍切片(14 μm），貼于載玻片上，室溫晾干1 h。用組化油筆將待染組織圈好，1%PBS浸洗4次，每次10 min。取出玻片，滴加10%山羊血清(1%PBS稀釋）37℃孵育1 h。棄山羊血清，加入 MrgC抗體(1∶100）(p－PKCε(1∶2000）），置濕盒中4℃過夜。次日拿出濕盒，放于37℃孵育45 min，棄一抗，1%PBS浸洗4次，每次10 min。滴加羊抗兔IgG(1∶1000）(羊抗小鼠IgG(1∶1000））進(jìn)行熒光標(biāo)記，37℃避光孵育1 h。棄二抗，1%PBS浸洗4次每次10 min(避光）。晾干后滴加抗熒光淬滅封片液封片。設(shè)立陰性對(duì)照：采用不含一抗的稀釋液替代一抗，其余條件不變。激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍片。以陰性對(duì)照為參考，用Ipp 6．0軟件進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算患側(cè)L4－L6 DRG中總細(xì)胞數(shù)及陽性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算MrgC與p－PKCε陽性細(xì)胞的表達(dá)率。

1.7 統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 鞘內(nèi)注射siRNA對(duì)CFA大鼠PWTs的影響

筆者分別檢測(cè)了鞘內(nèi)置管前、給藥前、給藥4 d (CFA造模0 h）、給藥5 d(CFA造模24 h）、給藥11 d(CFA造模7 d）共計(jì)5個(gè)時(shí)點(diǎn)的大鼠患側(cè)PWTs，來評(píng)價(jià)大鼠機(jī)械痛閾，將給藥前的痛閾作為基礎(chǔ)痛閾。

如圖1所示，鞘內(nèi)置管術(shù)前、給藥前兩組大鼠之間患側(cè)后足PWTs沒有明顯差異(P＞0．05）。給藥4 d后于大鼠CFA造模前(CFA造模0 h）檢測(cè)兩組PWTs，MrgC siRNA組的足縮腿閾較對(duì)照siRNA組有所上升，但其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05）。給藥5 d(CFA造模后24 h）時(shí)，可見兩組PWTs較給藥4 d(CFA造模0 h）均明顯下降(P＜0．01），MrgC siRNA組的PWTs高于對(duì)照siRNA組，兩組間差異仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05）。此趨勢(shì)一直持續(xù)到給藥第11天，兩組的PWTs均低于給藥4 d(CFA造模0 h）的 PWTs，但兩組之間并無明顯差異(P＞0．05）。

圖1 兩組大鼠在各時(shí)點(diǎn)PWTs變化情況Note：Compared with control siRNA group，＊＊P＞0．05;4d VS 5d，△△P＜0．01．Fig．1 The PWTs of two groups at different time points

2.2 鞘內(nèi)注射MrgC siRNA對(duì)大鼠患側(cè)L4-L6 DRG中MrgC mRNA表達(dá)的影響

分別檢測(cè)給藥11 d后兩組大鼠患側(cè)腰神經(jīng)節(jié)L4、L5、L6的MrgC mRNA的表達(dá)量，以對(duì)照siRNA組表達(dá)量的倍數(shù)作圖，結(jié)果見下圖2。如圖中所示，MrgC siRNA組患側(cè)L4、L5、L6的MrgC mRNA表達(dá)量均低于對(duì)照siRNA組對(duì)應(yīng)神經(jīng)節(jié)的表達(dá)量(P＜0．01，P＜0．01，P＜0．01），分別為對(duì)照siRNA組表達(dá)量的0．71、0．67、0．71倍。

圖2 兩組大鼠患側(cè)L4－L6 DRG MrgC的mRNA表達(dá)量的變化Note：compared with control siRNA group，＊＊P＜0．01．Fig．2 Comparison of the expression of MrgC mRNA in ipsilateral DRG L4－L6 between two groups

2.3 鞘內(nèi)注射MrgC siRNA對(duì)大鼠患側(cè)L4-L6 DRG中MrgC受體表達(dá)的影響

如圖3中所示，MrgC主要表達(dá)在DRG的中小神經(jīng)元中。分別檢測(cè)給藥11d后兩組的MrgC表達(dá)變化，與對(duì)照siRNA組比較，MrgC siRNA組的MrgC陽性細(xì)胞率明顯降低(P＜0．01），約為對(duì)照siRNA組的60%。熒光結(jié)果見彩插7圖5。

圖3 兩組大鼠患側(cè)L4－L6 DRG MrgC陽性細(xì)胞率的比較Note：compared with control siRNA group，＊＊P＜0．01．Fig．3 Rate of the expression of MrgC cells in L4－L6 ipsilateral DRG in each group

2.4 鞘內(nèi)注射MrgC siRNA對(duì)大鼠患側(cè)L4-L6 DRG中p-PKCε陽性細(xì)胞率的影響

檢測(cè)給藥11 d后L4－L6 DRG PKCε Ser729點(diǎn)位磷酸化的變化，以 p－PKCε的陽性細(xì)胞率來評(píng)價(jià)。結(jié)果如圖4，與對(duì)照siRNA組比較，MrgC siRNA組的p－PKCε陽性細(xì)胞率明顯升高(P＜0．05），約為對(duì)照siRNA組的126%。熒光結(jié)果見彩插7圖6。

圖4 兩組大鼠患側(cè)DRG p－PKCε陽性細(xì)胞率的比較Note：compared with control siRNA group，*P＜0．05．Fig．4 Rate of the expression of p－PKC in ipsilateral DRG of each group

3 討論

MrgC是2001年發(fā)現(xiàn)的一類新型的G蛋白偶聯(lián)受體，其基因僅僅高度表達(dá)于外周神經(jīng)系統(tǒng)的DRG和三叉神經(jīng)節(jié)的中小型感覺神經(jīng)元中。研究發(fā)現(xiàn)MrgC參與慢性炎癥引發(fā)的外周痛覺過敏的調(diào)制［14］。但由于目前尚未發(fā)現(xiàn)MrgC特異性抑制劑，未有直接的證據(jù)證實(shí)MrgC在慢性炎性痛發(fā)展過程中對(duì)疼痛的調(diào)制作用，進(jìn)一步的功能研究只能通過siRNA干擾mRNA表達(dá)或基因敲除。siRNA干擾是指內(nèi)源性或外源性小片段雙鏈RNA與靶基因的mRNA同源互補(bǔ)，在細(xì)胞內(nèi)特異降解靶mRNA，從而特異性封閉靶基因的過程［15］。研究報(bào)道，脊髓鞘內(nèi)給予siRNA能夠通過轉(zhuǎn)染脊髓背角淺層的初級(jí)傳入神經(jīng)纖維逆行至DRG發(fā)揮其干擾作用［16］。本實(shí)驗(yàn)研究通過鞘內(nèi)給予siRNA，觀察到給藥11 d時(shí)即CFA造模后第7天，MrgC siRNA組別DRG L4－L6的MrgC mRNA的表達(dá)量均明顯低于對(duì)照siRNA組相應(yīng)神經(jīng)節(jié)的表達(dá)量，進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)MrgC siRNA組MrgC的表達(dá)明顯降低，約為對(duì)照siRNA組的60%，與MrgC mRNA變化相一致。這說明鞘內(nèi)注射該siRNA片段有效的抑制MrgC基因及其蛋白的表達(dá)，從而在CFA慢性炎性痛的基礎(chǔ)上成功建立了MrgC基因沉默模型。

CFA致炎性痛模型為一種經(jīng)典的研究慢性炎性痛的模型，單側(cè)注射CFA誘導(dǎo)產(chǎn)生的痛覺過敏一般在4 h內(nèi)發(fā)展，為炎性痛的急性期，24 h～48 h為慢性炎性痛早期，隨后在7 d左右痛覺過敏有個(gè)小高峰，之后慢慢恢復(fù)。文獻(xiàn)報(bào)道患側(cè)的痛覺過敏可持續(xù)4～6周，而在健側(cè)產(chǎn)生的炎性鏡像痛一般在18 d以上［11］。以往的研究多集中在CFA慢性炎性痛早期，Jiang［14］等人發(fā)現(xiàn)在椎管內(nèi)注射MrgC特異性激動(dòng)劑牛腎上腺髓質(zhì) 8－22肽(bovine adrenal medulla 8－22，BAM8－22）不能夠影響正常大鼠的基礎(chǔ)痛閾和削弱CFA引發(fā)的早期機(jī)械痛覺過敏(24 h），但能夠削弱CFA引發(fā)的早期熱痛覺過敏(24 h）。與該研究的結(jié)果相一致的是，本研究CFA造模前鞘內(nèi)給與4次MrgC siRNA干擾(文獻(xiàn)報(bào)道以2 μg/次劑量，4次注射該siRNA片段能夠使正常大鼠的MrgC mRNA表達(dá)量下降50%［12］），與對(duì)照siRNA組比較，沒有顯著的改變大鼠的機(jī)械痛閾。CFA造模后24 h，可見兩組的PWTs較造模前均顯著下降，提示CFA模型的成功建立。但繼續(xù)給與siRNA干擾直至CFA第7天，兩組間機(jī)械痛閾仍未見明顯差異。這結(jié)果表明抑制MrgC的表達(dá)未能影響CFA引發(fā)的機(jī)械痛覺過敏。另有Guan Y等［17］敲除Mrg基因家族(含MrgC基因）后鞘內(nèi)注射BAM8－22能同時(shí)延緩CFA引起的早期機(jī)械痛覺過敏與熱痛覺過敏(24 h），該現(xiàn)象可能是由于同時(shí)沉默了除MrgC基因之外的Mrg基因家族成員而引發(fā)的。因?yàn)楸狙芯繘]有觀察干擾MrgC基因?qū)τ贑FA引起的熱痛覺過敏的影響，這將是我們進(jìn)一步研究的目標(biāo)。

PKC是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子［3］，在損傷或炎癥引起的慢性痛覺過敏啟動(dòng)與維持中起著重要的作用［18］，它的膜移位和磷酸化是PKC被激活的重要標(biāo)志［19］。Honan等人基于正常大鼠的原痛研究發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)給予 MrgC特異性激動(dòng)劑BAM8－22，應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)與熱痛密切相關(guān)的辣椒素受體(transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1）敏化的神經(jīng)元大約占13%的DRG神經(jīng)元，這一效應(yīng)被PKC特異性抑制劑Ro－31－8220所抑制［6］;有研究表明鞘內(nèi)注射BAM8－22抑制了CFA誘發(fā)的脊髓背角膜上PKCγ的上升［20］。以上研究提示PKC在MrgC對(duì)疼痛的調(diào)控中起著重要的作用。但是目前尚無DRG中PKC在MrgC對(duì)CFA誘發(fā)的慢性炎性痛調(diào)制過程功能性改變的研究。PKC的亞基ε在90%以上的DRG中小直徑神經(jīng)元中表達(dá)，其Ser729點(diǎn)位磷酸化是PKCε引發(fā)痛覺過敏的一個(gè)必要調(diào)節(jié)因素，本研究觀察到在有效沉默MrgC基因后，PKCε的Ser729點(diǎn)位磷酸化水平明顯上升，該結(jié)果提示抑制DRG中PKCε的Ser729點(diǎn)位磷酸化從而抑制PKCε功能性激活是MrgC調(diào)制CFA慢性炎性痛的重要細(xì)胞學(xué)機(jī)制。

綜上所述，本研究在CFA慢性炎性痛的基礎(chǔ)上成功地建立了 MrgC基因沉默模型，該模型中對(duì)MrgC的抑制作用顯著上調(diào)PKCε Ser729磷酸化的水平，基于PKC是一個(gè)蛋白激酶，它激活了多種與疼痛密切相關(guān)的傷害性感受器，如TRPV1，下一步的研究將圍繞著MrgC/PKC深入展開。

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SiRNA interference on expression of MrgC and phosphorylation of PKCε in ipsilateral dorsal root ganglion of rats with chronic inflammatory pain

LIN Xiao－xi，F(xiàn)ANG Fang，F(xiàn)ANG Jian－qiao，LIU Ying－jun
(The Third Clinical Medical College，Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China）

Objective To observe the Interference effects of siRNA(small interference RNA）intrathecal injection on the expression of mRNA and protein of MrgC，on PWTs(paw withdrawal thresholds）and the phosphorylation of PKCε Ser729 in ipsilateral DRG(dorsal root ganglion）of rats with chronic inflammatory pain induced by CFA(complete freund’s adjuvant）．Methods 16 health adult male SD(Sprague－Dawley）rats were randomly divided into 2 groups：control siRNA group and MrgC siRNA group，8 rats in each group．After success of intrathecal catheterization，corresponding siRNA was injected in rats for 4d，once a day，5μg/d per rat．The model of chronic inflammatory pain was established by CFA(0．1ml per rat）subcutaneously injected into the right hind paw at 4th day post－administration，then two groups were administrated corresponding siRNA on alternate day and executed at the 11th day post－administration．The PWTs were measured at 5 time points of pre－intrathecal catheterization，pre－administration，4th day post－administration(0h post－CFA injection），5th day post－administration(24h post－CFA injection），11th day post－administration(7 d post－CFA injection）．The expression of MrgC mRNA in ipsilateral DRG was detected by fluorogenic quantitative PCR，and the expression of MrgC and the phosphorylation of PKCε Ser729 in ipsilateral DRG was detected by immumofluorescence method．Result Compared with 4th day post－administration，PWTs of both two groups at 5th day post－administration decreased significantly (P＜0．01）．While there was no significant difference of PWTs between two groups at every detective time point．Compared with control siRNA group，the expression of MrgC mRNA and the rate of MrgC positive cells in MrgC siRNA group both decreased significantly(P＜0．01，P＜0．05），whereas the rate of p－PKCε Ser729 positive cells increased obviously(P＜0．05）at 11th day post－administration．Conclusion MrgC siRNA can effectively interfere the expression of mRNA and protein of MrgC in L4－L6 ipsilateral DRGs of rats with chronic inflammatory pain induced by CFA，and the siRNA interference on MrgC can obviously up－regulate the phosphorylation of PKCε Ser729，while it has no significant effect on PWTs of rats．

SiRNA;MrgC;Phosphorylation of PKCε Ser729;Chronic inflammatory pain;Dorsal root ganglion

R－332

A

1671－7856(2015）07－0039－07

10．3969．j．issn．1671．7856．2015．007．009

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81202755）;浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃(2015KYA172）。

林小溪，女(1989－），碩士生。方芳，女(1976－），助理研究員。

方劍喬(1961－），男，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：針刺鎮(zhèn)痛的效應(yīng)基礎(chǔ)研究。E－mail：Fangjianqiao7532@163．com。

2015－07－02