對胃粘膜損傷有輔助保護功能的評價試驗中的病理學方法的探討與建議

金 毅,甘玉璽,劉遠平,陳潤樺,謝天柱,黃澤愉

（1.深圳市藥品檢驗所深圳藥品質(zhì)量標準研究重點實驗室，廣東深圳 518057；

2.中興通訊股份有限公司，廣東深圳 518055）

對胃粘膜損傷有輔助保護功能的評價試驗中的病理學方法的探討與建議

金 毅,甘玉璽2,劉遠平1,陳潤樺1,謝天柱1,黃澤愉1

（1.深圳市藥品檢驗所深圳藥品質(zhì)量標準研究重點實驗室，廣東深圳 518057；

2.中興通訊股份有限公司，廣東深圳 518055）

目的 建立科學的大體病理學檢查和組織病理學診斷的評分原則、更合理的評分標準以及合理的統(tǒng)計學方法，為保健食品對胃粘膜損傷有輔助保護作用提供更為科學、可行的評價方法。方法 通過對大鼠胃黏膜急性損傷酒精模型的全面分析，針對現(xiàn)行方法中評價方法的缺點，根據(jù)病變特點及病理學檢查的原則和半定量分析方法，以及相應(yīng)的統(tǒng)計學方法等信息化處理，進行方法學探討。結(jié)果 大體病理學檢查按照病變所占面積以及在整個胃粘膜所占的比例；組織病理學診斷根據(jù)病變累及粘膜層的深度作為判定粘膜受損嚴重程度的主要依據(jù)，其他各種病變作為參考因素。分別分為未見異常（0分）、輕度病變（1分）、中度病變（2分）和重度病變（3分）。統(tǒng)計學方法采用Ridit統(tǒng)計學方法分析病理學半定量的結(jié)果。結(jié)論 從大體病理學、組織病理學的評價方法以及數(shù)據(jù)處理方法和結(jié)果判定等方面，提出了對胃粘膜損傷有輔助保護功能的動物實驗相對更為科學、可行的評價方法的建議。

病理學；評價方法；急性胃黏膜損傷酒精模型；信息化

《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》（2003年版）［1]（以下簡稱為2003版規(guī)范）為我國保健食品檢驗和監(jiān)督的主要依據(jù)。2012年4月，國家食品藥品監(jiān)督管理局（CFDA）組織對其中的9個保健食品功能評價方法進行了修訂［2]（以下簡稱新方法），并于2014年5月1日正式頒布實施。其中，對胃粘膜損傷有輔助保護功能評價的新方法與2003版規(guī)范相比，動物實驗的方法有改進、表述更細致，有利于獲得更準確的實驗結(jié)果。另外，新方法對動物實驗的結(jié)果判定，在原有的胃黏膜損傷大體觀察的基礎(chǔ)上，增加了組織病理學檢查，并且要求大體病理學檢查和組織病理學檢查結(jié)果均為陽性，即“動物實驗：實驗組與模型對照組比較，大體觀察評分與病理組織學檢查評分結(jié)果均標明胃粘膜損傷明顯改善，可判定該受試樣品動物實驗結(jié)果為陽性?！币虼?，如何在大體病理學以及組織病理學上運用科學的方法評價動物實驗結(jié)果至關(guān)重要。

為了分析新方法在評價原則、評分標準和相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理方法的科學性和可行性，本文著眼于急性胃粘膜損傷酒精模型的動物實驗，探討評價方法，提出更趨合理、可行的建議。

1 新方法中動物實驗方法的改進有利于進行準確的病理學評價

1.1 相對于2003版規(guī)范要求的“禁食不禁水24 h”，新方法強調(diào)“嚴格”禁食。這一點非常重要，如果未做到嚴格禁食，動物在沒有飼料供應(yīng)的情況下，會吃其周圍能獲得的任何物品，如自身的糞便、脫落的體毛等，直接干擾無水乙醇對胃粘膜損傷的程度。

1.2 相對于2003版規(guī)范要求的給受試物第30天灌胃受試物1 h后造模的方法，新方法修改為各劑量組灌胃30 d后，嚴格禁食24 d，第31天造模。這樣的改變，更著重于評價受試物連續(xù)30 d灌胃的功效，消除造模前1小時的灌胃受試物減輕胃損傷程度的可能性。

1.3 相對于2003版規(guī)范“取胃于10％甲醛溶液中固定20 min”的粗略說法，新方法細化為“暴露完整胃，結(jié)扎幽門，灌注適量10％甲醛溶液，固定20 min”。這一做法使胃腔充盈，粘膜面平整舒展，有利于觀察，見彩插4圖1A；如果不做幽門結(jié)扎灌注適量固定液或灌注失敗，

皺縮，不利于大體病理觀察、測量以及組織病理學評價，見彩插4圖1B。

2 急性胃粘膜損傷酒精模型的大體病理學評價方法分析

2.1 評分原則

2.1.1 新方法評分原則分析

新方法中“因?qū)挾人頁p傷的嚴重性遠較長度大，故雙倍積分。”的原則，實際上肉眼所見的病變寬度不能代表組織病理學損傷嚴重程度。如彩插4圖2 A和B所示，肉眼觀察胃粘膜寬度為1.1 mm，其組織病理學可觀察到的損傷約為粘膜全層的1/3，屬于輕度胃粘膜損傷；彩插4圖2 C和D所示，肉眼觀察胃粘膜寬度為0.6 mm，遠小于彩插4圖2 A和B中的病變，而其組織病理學損傷約為粘膜全層的2/3，屬于中度胃粘膜損傷；彩插4圖2 E和F所示，肉眼觀察胃粘膜寬度同彩插4圖2 C和D為0.6 mm，其組織病理學可觀察到的損傷約為粘膜全層，屬于重度胃粘膜損傷。大體病理學檢查只能通過肉眼觀察到病變的表象，如病變累及的面積、性狀、色澤等，而無法代表使用光學顯微鏡觀察才能確定的組織深層的病變及其程度。

2.1.2 建議

遵循病理學觀察的基本原則，如實記錄肉眼可觀察到的損傷性狀、面積以及損傷占胃粘膜比例的大小等，做出大體病理學檢查的評價。

2.2 評分標準

2.2.1 新方法的評分標準分析（見表1）

表1 急性胃粘膜損傷酒精模型的肉眼觀察評分標準Tab.1 Scoring criteria of gross pathologic findings in acute gastricmucosa injury induced by alcohol

如彩插5圖3中的兩例，圖A病例的病變累及面積和范圍明顯多于圖B病例，從病理學對病變進行半定量的角度分級，前者病變?yōu)橹卸龋笳邽楦叨?，很客觀地反應(yīng)了肉眼觀察的結(jié)果。同樣是這兩例，按照新方法的評分標準計算，由于圖A的胃粘膜上可以查到29個出血點，和許多大小不等的出血、充血節(jié)段，總積分為65分；而圖B的總積分為39分，明顯低于前者。

按照新方法的評分標準，總長20 mm的病變，隨著存在形式的不同而使積分從5分至20分不等，出現(xiàn)很大差距。例如圖4中所示，圖A有20個≤1 mm的點狀病變，為20分；圖B為一條長度20 mm、寬度≤2 mm的病變，則僅為5分；圖C是兩條長度10 mm、寬度≤2 mm的病變，為6分；圖D是兩條長度分別為9mm和11mm，寬度均≤2mm的病變，為7分；圖E是5條長度4 mm、寬度≤2 mm的病變，則為10分。從病理學的角度，對于相同的病變，其所占面積以及在總體中所占比重是判斷病變程度的依據(jù)，以上假設(shè)的幾種情況基本屬于同一程度的改變，不會出現(xiàn)如此巨大的差距。

圖4 新方法評分示意圖

上述可見，按照新方法的記分方法，無論從實際還是理論上都可能引起較大偏差，根據(jù)病變形態(tài)的不同而引起不均等的積分。

從大體病理學和臨床角度出發(fā)，胃粘膜的總面積是一定的，粘膜發(fā)生病變是在這個面積之內(nèi)的一個有限的改變。由于整個試驗的核心是評價受試物對胃黏膜損傷的輔助保護功能，因此，著眼點和評價的關(guān)鍵是胃黏膜損傷的程度，即病變在胃粘膜整體中的比例（例如，胃粘膜無異常所見，或為輕、中、重度等），而不是新方法的計分方法導(dǎo)致的可以無限增加、沒有上限的分值。

2.2.2 建議

根據(jù)大體病理學檢查的半定量分析方法，建議按照病變所占面積以及在整個胃粘膜所占的比重，分為未見異常（0分）、輕度病變（1分）、中度病變（2分）和重度病變（3分）。

3 急性胃粘膜損傷酒精模型的組織病理學評價方法分析

3.1 評分方法

在胃粘膜損傷最嚴重的部位取材，觀察胃粘膜全層。以充血、出血、黏膜細胞變性壞死在整個粘膜上皮層的累及程度分為5級。充血權(quán)重為1，出血權(quán)重為2，上皮細胞變性壞死權(quán)重為3。

首先，在實際鏡檢工作中，對病變五等分的方法很難實行。如彩插5圖5所示，由于粘膜組織本身不是均一、等高的厚度，加之發(fā)生病變的組織充血、水腫以及細胞變性、壞死等引起病變部位的粘膜層厚度發(fā)生改變。因此，對病變累及的粘膜層按照三等分進行診斷合理可行。

其次，新方法中對充血、出血以及上皮細胞變性壞死權(quán)重的劃分也值得探討。由于胃粘膜受損的組織病理學改變?yōu)槎鄻有裕绮什?圖6中所示，有些以充血為主（A、B、C），有些以出血為主（D），有些以細胞變性、壞死、脫落為主（E、F），多種病變混合存在，很難說某一種病變的權(quán)重就一定大于其他病變，尤其是充血，往往是機體組織在遇到應(yīng)激條件時的反應(yīng)性表現(xiàn)，并不應(yīng)該因為充血的存在，而給病變另外加分。

3.2 建議

組織病理學診斷應(yīng)根據(jù)病變累及粘膜層的深度為判定粘膜受損嚴重程度的主要依據(jù)，各種病變形態(tài)等作為參考因素，分為未見異常（0分）、輕度病變（1分）、中度病變（2分）和重度病變（3分）。

4 急性胃粘膜損傷酒精模型的數(shù)據(jù)處理的統(tǒng)計學方法分析

4.1 2003版規(guī)范和新方法的統(tǒng)計學方法及分析

對胃粘膜損傷進行了量化處理后采用了方差分析的統(tǒng)計學方法。但是，由于在大體檢查和組織病理學檢查中量化方法不合理，需要根據(jù)建議的病理學半定量的數(shù)字化結(jié)果，采用相應(yīng)的統(tǒng)計學方法。

4.2 統(tǒng)計學方法建議

對病理學診斷的半定量結(jié)果進行組間統(tǒng)計學分析［3-7]，建議采用Ridit統(tǒng)計學方法分析病理學半定量的結(jié)果。因為胃粘膜未見異常（0分）、輕度損傷（1分）、中度損傷（2分）和重度損傷（3分），屬于單向有序分類資料或等級資料，Ridit分析對等級資料進行組間比較的假設(shè)檢驗方法，可以通過SPSS實現(xiàn)，根據(jù)是否有顯著性差異，判定病理結(jié)果的統(tǒng)計學意義。

4.3 信息處理方法建議

目前，云計算、大數(shù)據(jù)和移動互聯(lián)網(wǎng)等信息通信技術(shù)發(fā)展較快。為了與國際接軌，建議借鑒臨床前藥物安全性評價的國際性指導(dǎo)方針GAMP5（Good Automated Manufacturing Practice），向計算機化系統(tǒng)驗證 CSV（computerized system validation）發(fā)展［8]。實行身份認證和依托大數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析等信息化管理手段，真正實現(xiàn)實驗過程和實驗數(shù)據(jù)的在線監(jiān)控及實時記錄［9]，做到有依可循、有據(jù)可查、有源可溯，從而使實驗數(shù)據(jù)到評價結(jié)果能獲得國際承認和相關(guān)機構(gòu)互認。

5 結(jié)語

通過分析探討國家食品藥品監(jiān)督管理局2012年發(fā)布的新方法對胃粘膜損傷有輔助保護作用的功能評價方法，從大體病理學、組織病理學的評價方法以及數(shù)據(jù)信息化處理方法和結(jié)果判定等方面提出建議，通過準確評判動物實驗結(jié)果，實現(xiàn)更為科學、可行的對胃粘膜損傷有輔助保護作用的功能評價。

［1] 中華人民共和國衛(wèi)生部.保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范（2003年版）［S].133-135.

［2] 國家食品藥品監(jiān)督管理局.關(guān)于印發(fā)抗氧化功能評價方法等9個保健功能評價方法的通知（國食藥監(jiān)?；?012]107號）.http：//wenku.baidu.com/view/e8efd3176c175f0e7cd1376d.html

［3] 羅明奎，蔡昌啟，雷玉潔，等.等級資料Ridit分析及正確使用［J].中國衛(wèi)生統(tǒng)計.2003，20（4）：252-254.

［4] 李國春.SPSS編程在Ridit分析中的應(yīng)用［J].循證醫(yī)學.2004，4（1）：51-53.

［5] 劉嶸，白瑞華.Ridit分析的SPSS實現(xiàn)［J].中國衛(wèi)生統(tǒng)計.2004，21（4）：236，238.

［6] 武松，葉冬青.多組單向有序資料的Ridit分析在SPSS中的實現(xiàn)［J].中國衛(wèi)生統(tǒng)計.2006，23（6）：554.

［7] 金毅，徐峰，魯藝.關(guān)于四氯化碳肝損傷的組織病理學診斷方法的探討及建議［J].中國新藥雜志.2014，23（19）：2224-2227.

［8] 金志虎，甘玉璽，金毅，等.GAMP5的IP承載網(wǎng)建設(shè)研究［J].廣東科技.2013，22（6）：117-118，80.

［9] 甘玉璽，胡龍斌，龔超美，等.柔性重構(gòu)的高性能超寬帶綜合業(yè)務(wù)網(wǎng)關(guān)平臺［J].計算機應(yīng)用與軟件.2015，32（7）：133 -136.

Pathologic study and suggestion on evaluation methods of
auxiliary protective function on gastric mucosa injury

JIN Yi1，GAN Yu-xi2，LIU Yuan-ping1，CHEN Run-hua1，XIE Tian-zhu1，HUANG Ze-yu1
（1.Shenzhen Key Laboratory of Drug Quality Standard Research，Shenzhen Institute for Drug Control，Guangdong Shenzhen 518057，China；2.ZTE Corporation，Guangdong Shenzhen 518057，China）

Objective To establish a scientific and practical principle，grading standard and reasonable statistical method for evaluating the protective effect of health food to gastric mucosal injury，based on general pathology and histopathological diagnosis.M ethods A methodological study was conducted on ratmodel of acute gastric mucosa injury induced by alcoholic through comprehensive analysis and comparing shortcomings of the current standard evaluation method，and methods of semi-quantitative analysis and corresponding information statistic processing were based on characteristics of the lesion and principles of pathology.Results Gross pathologicalevaluation ofgastricmucosa lesion was based on the area occupied and proportion in the whole gastric mucosa.Histopathological diagnosis was based on the mucous layer depth of lesion as main determination point and other lesions as reference factors.Grades of lesion weredivided into no abnormality（0），mild lesions（1 point），moderate lesions（2 points），and severe lesions（3 points）.Ridit statistical method was used for pathological analysis of semi-quantitative results.Conclusion A scientific and feasible evaluationmethod for the protective effect of health food to gastricmucosal injury was provided from the aspects of gross pathology，histopathological evaluation method，data processing method and result determination.

Pathology；Evaluation methods；Animal model of acute gastric mucosa injury induced by alcohol；Information

R-332

A

1671-7856（2015﹞10-0038-04

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.010.009

金毅（1971-），女，副主任藥師，醫(yī)學博士，主要研究領(lǐng)域：病理，臨床前安全性評價，醫(yī)療信息化等。

﹞2015-08-28

研究報告