以RBP-4為靶點(diǎn)的疫苗對(duì)2型糖尿病小鼠血糖降低的研究

李彥涵,余柄廷,孫 靜,李建芳,烏美妮,王海璇,胡云章,胡凝珠

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所疫苗研究室云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室云南省重大傳染病疫苗工程技術(shù)研究中心，昆明 650118；2.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071000）

以RBP-4為靶點(diǎn)的疫苗對(duì)2型糖尿病小鼠血糖降低的研究

李彥涵1,余柄廷2,孫 靜1,李建芳1,烏美妮1,王海璇1,胡云章1,胡凝珠1

（1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所疫苗研究室云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室云南省重大傳染病疫苗工程技術(shù)研究中心，昆明 650118；2.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071000）

目的 探討以人源RBP-4為靶標(biāo)的疫苗免疫干預(yù)胰島素抵抗的有效性和可行性，為2型糖尿病治療新方法的推進(jìn)提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。方法 以T7噬菌體為載體表達(dá)人源RBP-4的疫苗經(jīng)皮下免疫2型糖尿病小鼠，同時(shí)設(shè)空載體組和空白對(duì)照組，經(jīng)2次免疫后在不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)體液免疫水平、空腹血糖值及體重，并于20周處死動(dòng)物進(jìn)行病理學(xué)切片檢測(cè)。結(jié)果 RBP-4疫苗有效誘導(dǎo)了抗RBP-4 IgG抗體的產(chǎn)生，并于12周達(dá)到峰值，同時(shí)，免疫組的空腹血糖值從第8周開(kāi)始逐步下降，到第12周時(shí)較空載體組和空白組有顯著差異，并始終維持在2型糖尿病發(fā)病值（7 mmol/L）以下。實(shí)驗(yàn)期間，2型糖尿病小鼠未出現(xiàn)蜷縮、豎毛、搔鼻、抽搐等明顯異常，免疫組、空載體組小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟組織均未觀察到明顯病變，表明RBP-4疫苗安全性良好。結(jié)論 RBP-4疫苗能顯著降低2型糖尿病小鼠的血糖，有可能成為治療胰島素抵抗的一個(gè)新突破點(diǎn)。

2型糖尿??；RBP-4疫苗；db/db小鼠

目前，我國(guó)糖尿病發(fā)病人數(shù)達(dá)9840萬(wàn)，預(yù)計(jì)到2035年糖尿病的發(fā)病比例將達(dá)到13％［1]，隨著病程進(jìn)展2型糖尿病患者將出現(xiàn)許多嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量甚至死亡。在目前藥物治療尚不能治愈2型糖尿?。?]，并且長(zhǎng)期服藥將帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的情況下，另辟途徑尋找新的預(yù)防和治療方法具有重要意義。

由脂肪組織分泌的脂肪細(xì)胞因子視黃醇結(jié)合蛋白-4（retinol binding protein，RBP-4）是肥胖癥和胰島素抵抗之間的關(guān)聯(lián)因子［3]。在對(duì)胰島素不敏感性增加的小鼠及患有肥胖癥、2型糖尿病的患者體內(nèi)，其血清中RBP4的含量明顯增加［4]。血清中RBP-4含量的增加，會(huì)刺激肝臟表達(dá)葡糖異生酶—烯醇丙酮酸磷酸羧激酶，并削弱肌肉組織中的胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑［5]。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)過(guò)表達(dá)人源RBP-4或?qū)⒅亟MRBP-4注射到正常小鼠體內(nèi)，可以引起機(jī)體對(duì)胰島素的抵抗；相反，將RBP-4基因敲除后機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性增加。因此，RBP-4是一種源于脂肪細(xì)胞的“信號(hào)”，降低RBP-4的水平可能成為治療2型糖尿病的一個(gè)新的途徑［6-8]。

本實(shí)驗(yàn)將展示有人源全長(zhǎng)RBP-4序列的以T7噬菌體為載體的疫苗與鋁佐劑混合后免疫2型糖尿病db/db小鼠模型，觀察糖尿病小鼠免疫后體液免疫效果以及體重、血糖等指標(biāo)以及病理切片的變化，為以RBP-4為靶標(biāo)的疫苗治療2型糖尿病的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 抗原

將人源全長(zhǎng)RBP-4序列與經(jīng)酶切處理的T7噬菌體基因組連接并展示于T7噬菌體表面作為免疫用的疫苗。該疫苗由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所疫苗研究室提供，噬菌體效價(jià)（1.5×1010pfu/mL）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

穩(wěn)豪血糖儀和血糖試紙購(gòu)自強(qiáng)生（中國(guó)）醫(yī)療器材有限公司；Al（OH）3佐劑（29.9mg/mL）由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供；ELISA試劑盒（AntiMouse ABT System）購(gòu)自美國(guó)KPL公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

B6.BKS（D）-Leprdb/JNjuⅡ型糖尿病小鼠（db/db小鼠）模型購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所【SCXK （蘇）2015-0001】，6～8周齡，體重30～35g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)【SYXK（滇）2013-0001】。

1.4 動(dòng)物分組及免疫

將30只Ⅱ型糖尿病小鼠（禁食后空腹血糖均≥10mmol/L）隨機(jī)分為3組：免疫組（RBP-4疫苗1.5×108pfu+Al（OH）30.6 mg/只）、空載體組（T7空載體1.5×108pfu+Al（OH）30.6 mg/只）、空白對(duì)照組（生理鹽水），每組各10只，免疫劑量為100 uL，檢測(cè)體液免疫效果及體重、血糖指標(biāo)變化。

1.5 血清中抗-RBP-4抗原特異性IgG抗體水平的檢測(cè)

于免疫后的4、8、12、16、20周采集尾靜脈血，分離血清，用RBP-4作為抗原包被板子，用間接ELISA法檢測(cè)抗RBP-4抗體。取RBP-4抗原，加入96孔板中，100μL/孔，4℃包被過(guò)夜；以BSA 37℃封閉1 h；洗板4次，加入倍比稀釋的小鼠血清（起始稀釋倍數(shù)為1：40），100μL/孔，37℃孵育1 h；洗板4次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1：400稀釋），100 μL/孔，37℃孵育1 h；洗板3次，加入TMB顯色液，100μL/孔，顯色5 min；加入2 mol/L H2SO4，100μL/孔，終止反應(yīng)。于酶標(biāo)儀405和655 nm波長(zhǎng)處，檢測(cè)各孔A值，以陽(yáng)性反應(yīng)的最大稀釋度作為樣品的抗體效價(jià)，根據(jù)ELISA結(jié)果計(jì)算各組的平均滴度。

1.6 體重及空腹血糖檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)期間，于免疫前及免疫后的4、8、12、16、20周檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血糖及體重指標(biāo)的變化。過(guò)夜禁食、禁水、撤墊料，禁食12 h后，測(cè)體重及空腹血糖。

1.7 安全性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)期間，觀察并記錄小鼠的飲食、體重、毛色、注射部位有無(wú)異常。免疫20周后，取RBP-4免疫組、空載體組及空白對(duì)照組小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟組織，制備病理切片，HE染色，顯微鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清中抗RBP-4疫苗IgG抗體水平

間接 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，RBP-4疫苗免疫db/db小鼠后，誘導(dǎo)了抗RBP-4抗體的產(chǎn)生，并且抗體水平在第二次免疫后的第12周時(shí)升至最高，并于之后開(kāi)始逐漸下降。

表1 2型糖尿病小鼠抗RBP-4疫苗IgG水平Tab.1 The anti-RBP-4 IgG levels of type 2 diabetemice

圖1 免疫后不同時(shí)間點(diǎn)免疫組小鼠抗RBP-4疫苗IgG水平

2.2 各組小鼠空腹血糖水平

各組小鼠于免疫前及二次免疫后的4、8、12、16、20周測(cè)空腹血糖。檢測(cè)結(jié)果顯示，空載體組和空白對(duì)照組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間血糖值均大于 7.0 mmol/L，免疫組在免疫后的第8周血糖值下降，從第12周開(kāi)始血糖值較空載體組和空白對(duì)照組差異顯著（P ＜0.01），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明RBP-4疫苗免疫2型糖尿病小鼠后，對(duì)小鼠產(chǎn)生了保護(hù)作用，避免血糖水平升高，并且從12周以后小鼠血糖值均處于發(fā)病值（7.0 mmol/L）以下，說(shuō)明RBP-4疫苗具有良好的降血糖的作用。

2.3 各組小鼠體重水平

各組小鼠于免疫前及二次免疫后的4、8、12、16、20周測(cè)體重。檢測(cè)結(jié)果顯示，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，免疫組較空載體組及空白組體重不具有顯著差異（P＞0.5），說(shuō)明RBP-4疫苗對(duì)體重?zé)o影響。

圖2 免疫前及免疫后不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠空腹血糖值（單位：mmol/L）

圖3 免疫前及免疫后不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠體重水平（單位：g）

2.4 安全性檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠體重、毛色均正常，未出現(xiàn)蜷縮、豎毛、搔鼻、抽搐、痙攣、水腫及休克等異常反應(yīng)，各組小鼠注射部位均未出現(xiàn)紅腫、結(jié)節(jié)。顯微鏡下觀察顯示，免疫組、空載體組及空白對(duì)照組小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟組織均未觀察到病變，表明RBP-4安全性良好，病理切片圖片見(jiàn)彩插6圖4。

3 討論

慢性非傳染性疾病是全球一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，已成為影響人民健康的主要危害。

糖尿病已成為繼腫瘤和心腦血管病之后的第三大非傳染病，是導(dǎo)致病殘和死亡的第三大原因。根據(jù)最新文獻(xiàn)報(bào)道，2013年全球已確診的糖尿病患者約3.82億，預(yù)計(jì)到2035年將增長(zhǎng)至5.92億，其中在發(fā)展中國(guó)家糖尿病患者的數(shù)目將顯著增加［1]。

2型糖尿病是指由于胰島素抵抗伴胰島素分泌不足所致的持續(xù)性慢性高血糖，占糖尿病總數(shù)的90％以上。2型糖尿病為終身疾病，可出現(xiàn)多種并發(fā)癥，給患者、家庭以及社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。治療2型糖尿病的主要藥物有磺酰脲類、雙胍類降血糖藥、α葡萄糖苷酶抑制劑和胰島素增敏劑［9-10]。但是采用2型糖尿病藥物治療具有以下不可避免的缺點(diǎn)：1.只能從一定程度上控制血糖；2.藥物價(jià)格昂貴，導(dǎo)致治療成本高；3.長(zhǎng)期服用藥物有一定的副作用；4.需要長(zhǎng)期服藥，給患者帶來(lái)極大的不便。

RBP-4是一種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其主要功能是在血液循環(huán)中轉(zhuǎn)運(yùn)視黃醇。正常情況下，血清RBP4主要來(lái)源于肝細(xì)胞，其次為脂肪組織。新近發(fā)現(xiàn)，由脂肪組織分泌的RBP4是肥胖癥和胰島素抵抗之間的關(guān)聯(lián)因子。在正常個(gè)體中，胰島素與分布于細(xì)胞膜上的相應(yīng)胰島素受體結(jié)合后，刺激GLUNT4通路將葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)到肌肉組織和脂肪細(xì)胞中，并抑制肝臟生成葡萄糖，由此維持血糖處于正常水平。Yang等［11]發(fā)現(xiàn)，在肥胖動(dòng)物的脂肪組織中，GLUT4的表達(dá)量降低，伴隨的是脂肪細(xì)胞分泌的RBP4表達(dá)量和分泌量的增加。這種分泌因子可能與視黃醇一起作用削弱肌肉組織中胰島素信號(hào)通路，阻遏葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，并干擾胰島素對(duì)肝臟中葡萄糖生成的抑制作用，最終導(dǎo)致血糖升高。因此RBP-4作為一種新的脂肪源性信號(hào)，為胰島素抵抗和2型糖尿病的干預(yù)治療提供了新靶標(biāo)。

本實(shí)驗(yàn)用展示于T7噬菌體表面的人源RBP-4疫苗免疫2型糖尿病模型小鼠db/db，于2次免疫后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)db/db小鼠的體液免疫效果、體重、血糖指標(biāo)，免疫后第20周處死動(dòng)物，檢測(cè)病理切片。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RBP-4疫苗免疫小鼠后，誘導(dǎo)了抗RBP-4抗體的產(chǎn)生，并于12周達(dá)到峰值。同時(shí)，免疫組小鼠的空腹血糖值從2次免疫后的8周開(kāi)始逐漸下降，在12周時(shí)與空載體組及空白組空腹血糖相比較具有顯著差異，并在12周之后免疫組小鼠的空腹血糖值均低于2型糖尿病發(fā)病值（7 mmol/L），而空載體組和空白組小鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)間期空腹血糖值均高于2型糖尿病發(fā)病值（7 mmol/L）。因此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RBP-4復(fù)疫苗免疫2型糖尿病小鼠后有效的誘導(dǎo)了抗RBP-4抗體的產(chǎn)生，中和了小鼠血液中的RBP-4表達(dá)量，使胰島素對(duì)肝臟中葡萄糖生成的抑制作用恢復(fù)正常，最終血糖達(dá)到正常值，對(duì)2型糖尿病小鼠起到了有效的保護(hù)作用。病理切片結(jié)果顯示，免疫組小鼠各主要組織無(wú)明顯異常，安全性良好。但RBP-4疫苗對(duì)2型糖尿病小鼠的體重?zé)o干預(yù)作用，推測(cè)RBP-4雖然與糖代謝、脂代謝緊密相關(guān)，但在2型糖尿病干預(yù)過(guò)程中不涉及體重的降低。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將RBP-4作為2型糖尿病免疫干預(yù)的新靶標(biāo)，有可能成為治療胰島素抵抗的一個(gè)新突破點(diǎn)。

［1] Guariguata L，Whiting DR，Hambleton I，etal.Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035［J].Diabetes Res Clin Prac，2014，103：137-149.

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The research of RBP-4 vaccine reducing blood glucose of type 2 diabetem ice

LIYan-han1，YU Bing-ting2，SUN Jing1，LI Jian-fang1，WU Mei-ni1，WANG Hai-xuan1，
HU Yun-zhang1，HU Ning-zhu1
（1.Institute of Medical Biology，Chinese Academy of Medical College and Peking Union Medical College，Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research＆Development on Severe Infectious Diseases，Yunnan Research Center of Engineering Technique for Vaccines against Severe Infectious Diseases，Kunming 650118，China；
2.Life Science College of Hebei University，Hebei Baoding 071000，China）

Objective To explore efficacy of the human RBP-4 vaccine interventions targeting insulin resistance，and provide new ways to treatment of type 2 diabetes.M ethods T7 bacteriophage vector expressing human-derived vaccine RBP-4 subcutaneously immunized mice with type 2 diabetes，at the same time set up empty vector group and control group.After the second immunization，detecting humoral immunity levels，fasting plasma glucose value and weight at different time points，and the animalswere sacrificed for pathological slice assay at20 weeks.Results The anti-RBP-4IgG antibodies induced by RBP-4 vaccine was peaked at 12 weeks，the fasting blood glucose level of immunity group gradual decline from the 8th week to 12 weeks and compared with empty vector group and the control group were significantly different，and always maintain the value（7 mmol/L）or less.During the experiment，mice with type 2 diabetes did not appear straight，vertical hair，scratching nose，convulsions and other obvious abnormalities.The mouse heart，liver，spleen，lung and kidney lesions of Immunization group and vector group have no obviously pathological changes，indicating RBP-4 vaccine safety is good.Conclusion RBP-4 vaccine can significantly reduce fasting blood glucose level in type 2 diabeticmice，itmay become a new method in the treatment of insulin resistance.

Type 2 diabetes；RBP-4 vaccine；db/dbmouse

R-332

A

1671-7856（2015﹞10-0046-05

10.3969.j.issn.1671.7856.2015.010.011

2013年云南省高技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展項(xiàng)目計(jì)劃：基因工程藥物關(guān)鍵技術(shù)研究及新產(chǎn)品開(kāi)發(fā)應(yīng)用；云南省社會(huì)發(fā)展新藥專項(xiàng)（2013BC011）；北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院協(xié)和青年基金（33320140080）。

李彥涵（1982-），女，助理研究員，研究方向：疫苗研發(fā)。E-mail：110393273@qq.com。

胡凝珠（1961-），女，主任技師，研究方向：疫苗研發(fā)。E-mail：845653517@qq.com。

﹞2015-08-31