江西惡性血液病患者殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體基因多態(tài)性研究

熊莉，孫瑜，李國良

(江西省血液中心，江西 南昌330052)

近年來，NK細(xì)胞在惡性血液病的發(fā)病和治療中的作用日益受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。目前認(rèn)為，NK細(xì)胞的功能由其表面多種受體的綜合作用來實(shí)現(xiàn)，其中比較重要的一類受體是殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體 (killer cell immunoglobulin-like receptor,KIR)，KIR是主要表達(dá)于NK細(xì)胞和部分T細(xì)胞表面的免疫球蛋白樣超家族成員[1]。可通過特異性識(shí)別HLA-I類分子，介導(dǎo)調(diào)節(jié)NK細(xì)胞和部分效應(yīng)T細(xì)胞的殺傷功能的激活或耐受。許多臨床資料顯示，某些特定的KIR-HLA錯(cuò)配背景下的造血干細(xì)胞移植具有更好的移植物植入率及移植物抗白血病(graft-versus-leukemia，GVL)效應(yīng)。 我們采用PCR-SSP檢測技術(shù)對(duì)62例惡性血液病患者進(jìn)行KIR基因的檢測和分析，并與正常人群進(jìn)行比較，以探討KIR基因的多態(tài)性與惡性血液病發(fā)生的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 病例組：南昌市三甲醫(yī)院臨床確診為惡性血液病的江西籍患者62例，男38例，女24例，年齡21~67(40.72)歲,其中急性髓系白血病(AML)15名,急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)16名,慢性髓系白血病 (CML)21例,骨髓增生異常綜合癥(MDS)4例,急性混合型白血病(AMLL)3例，淋巴瘤3例。對(duì)照組：葉倩等[2]研究的江西籍健康體檢者150例。

1.2 基因組DNA提取 取乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝靜脈血，DNA提取采用EZHighTM DNA Extraction Kit(吉盈科技公司)，操作方法依據(jù)試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.3 KIR基因分型 運(yùn)用序列特異性引物聚合酶鏈法，采用OIerup SSP KIR Genotyping試劑盒(北京博富瑞公司) 檢測 KIR2DLl、2DL2、2DL3、2DL4、2DL5、2DSl、2DS2、2DS3、2DS4、2DS5、3DLl、3D12、3DL3、3DSl、2DP1、3DP1， 具體操作按照說明書。Taq DNA聚合酶購自Promega公司，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 KIR基因出現(xiàn)頻率(f)通過計(jì)數(shù)測得，KIR基因頻率 (GF)計(jì)算公式為：；病例組與正常對(duì)照組間差異顯著性用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件四格表χ2檢驗(yàn)公式計(jì)算。最終結(jié)果以P值、優(yōu)勢比(OR值)及95%可信區(qū)間(CI)列出。

2 結(jié)果

2.1 病例組與正常對(duì)照組KIR基因頻率比較 本實(shí)驗(yàn)共檢測出16個(gè)KIR基因。62例患者個(gè)體中，3DL2出現(xiàn)頻率為100%。其他較常見的KIR基因分 別 為 2DL4、2DP1、2DS4、2DL1、2DL3、3DL1、3DL3、3DP1，頻率依次為 87.31%、82.03%、82.03%、78%、78%、61.89%、56.01%、54.21%；2DL5、2DS5、2DL2、2DS1、2DS2、2DS3、3DS1 分布頻率較低，頻率 依 次 為 18.68% 、15.76% 、15.76% 、14.81% 、9.30%、7.54%、6.67%。 對(duì)照組 3DL3、3DL2、2DL4出 現(xiàn) 在 所 有 個(gè) 體 中 ，2DL3、2DP1、3DL1、2DS4、2DL1基因比較常見，頻率依次為88.42%、78.39%、71.72%、66.33%、56.02%；2DL2、2DS3、2DS2、2DS5、2DS1、3DS1、2DL5比較少見，頻率依次為5.84%、7.98%、8.35%、13.20%、13.98%、14.75%、17.54% 。另外，病例組中2DL1、2DL2基因頻率高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)；病例組中2DL3、3DL3、3DS1、3DP1基因頻率低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他KIR基因位點(diǎn)頻率未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見表1。

表1 惡性血液病患者與正常對(duì)照人群KIR基因頻率比較

2.2 惡性血液病患者KIR基因型分析 根據(jù)http://www.allelefrequencies.net網(wǎng)站上的KIR基因型命名，在62例患者個(gè)體中檢出32種基因型?！癗ew?”表示查不到相應(yīng)的GENOTYPE ID號(hào)，是新發(fā)現(xiàn)的基因型。 惡性血液病患者中最常見的單倍型為AA(1)，但在單倍型Bx中，最常見的為Bx(9)。AA型和Bx型分別為34例和28例，其中在Bx型中，AB型為26例，BB型為2例。A型單倍型與B型單倍型的比例為3.13:1。見表2。

3 討論

KIR基因定位于人類染色體19q13.4的白細(xì)胞受體基因群(leukocyte receptor complex，LRC)內(nèi)，是繼HLA之后發(fā)現(xiàn)的人類又一具有高度多態(tài)性的免疫遺傳系統(tǒng)。已知的16個(gè)KIR基因包括：7個(gè)抑制性基因 (2DL1－3、2DL5、3DL1－3)、6 個(gè)活化性基因 (2DS1－5、3DS1)、1個(gè)同時(shí)具有活化和抑制功能的基因(2DL4)以及2個(gè)編碼無功能性 KIR受體的假基因(2DP1、3DP1)[3，4]。 NK 細(xì)胞毒性被認(rèn)為由于KIR發(fā)揮著刺激性效應(yīng)和抑制性效應(yīng)之間平衡的結(jié)果[5，6]。有研究報(bào)道，機(jī)體對(duì)惡性血液病細(xì)胞的免疫殺傷和免疫逃逸與NK細(xì)胞功能的增強(qiáng)或缺失密切相關(guān)[7-9]。

KIR具有遺傳多樣性：一方面表現(xiàn)為同一KIR基因座位包含多個(gè)等位基因，另一方面由于同一個(gè)體的不同T、NK細(xì)胞克隆表達(dá)的KIR不同而表現(xiàn)為AA和Bx(包括AB及BB)等不同的單倍型。KIR基因高度多態(tài)性構(gòu)成了不同個(gè)體和種族疾病易感性和免疫應(yīng)答差異的遺傳學(xué)基礎(chǔ)。在對(duì)惡性血液病患者KIR基因多態(tài)性的研究中，學(xué)者們的研究結(jié)果不盡相同。Verheyden等[8]證實(shí)，比利時(shí)高加索人中白血病患者KIR2DL2和KIR2DS2的基因表達(dá)顯著增加。Zhang[10]等在研究了263例白血病患者的基因型后發(fā)現(xiàn)2DS1、2DS4基因頻率明顯升高。陳阿梅等[11]也報(bào)道北方地區(qū)白血病患者3DL1和2DL1比健康對(duì)照組顯著降低。

表2 惡性血液病患者KIR基因型分布

本研究結(jié)果顯示，惡性血液病患者的2DL1、2DL2基因頻率高于健康對(duì)照組，而2DL3、3DL3、3DS1、3DP1基因頻率低于健康對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道不完全相同，分析原因如下：(1)本研究對(duì)象為惡性血液病患者。惡性血液病除了白血病，還包括淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征等。另外，白血病分為多種類型，不同疾病的病理和臨床表現(xiàn)不同，說明它們的免疫發(fā)病機(jī)制也不同。多個(gè)KIR基因與惡性血液病相關(guān)聯(lián)，且不同類型的惡性血液病關(guān)聯(lián)的KIR基因也不完全相同，這表明了KIR與惡性血液病發(fā)病的相關(guān)性及復(fù)雜性。(2)病例組和正常對(duì)照組的標(biāo)本量都較少，采用不同的對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比，可能會(huì)出現(xiàn)不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。僅僅是基因頻率水平的探討，要想揭示KIR基因在惡性血液病中如何作用是不夠全面的，需要擴(kuò)大樣本做進(jìn)一步研究。(3)研究國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)這些研究數(shù)據(jù)具有較大差異，結(jié)果不具有統(tǒng)一性，不能代表不同地區(qū)的實(shí)際情況。究竟是由于人種和地域差異所致，還是另有原因，還需進(jìn)一步求證。

研究證實(shí)，對(duì)NK細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)不是單個(gè)KIR基因作用的結(jié)果，而是抑制性受體基因和活化性受體基因共同作用的結(jié)果，因此，對(duì)個(gè)體KIR基因的研究應(yīng)注重抑制性KIR和活化性KIR間的平衡以及最終表達(dá)于個(gè)體細(xì)胞表面的 KIR基因型。本實(shí)驗(yàn)在惡性血液病患者中檢出32種基因型，單倍型AA、AB、BB分別為 34例、26例和 2例，A型單倍型與B型單倍型的比例為3.13:1。最常見的單倍型為 AA(1)，這與之前文獻(xiàn)報(bào)道相一致[12，13],說明KIR基因組合型以抑制性信號(hào)通路為主是一種常態(tài)，或許可以解釋NK細(xì)胞的自然殺傷效應(yīng)受到KIR常態(tài)抑制作用，使自身細(xì)胞不會(huì)遭受自然殺傷。由于缺乏健康對(duì)照組的KIR基因型數(shù)據(jù)，本研究尚且無法比較惡性血液病患者的KIR基因型特點(diǎn)。此外，個(gè)體NK細(xì)胞的活性與KIR及其配體HLA-I類分子間的組合模式密切相關(guān)，因此探討KIR與HLA的相互作用及KIR對(duì)惡性血液病中不同疾病的影響是以后工作的研究方向。

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