基于NP968核酸提取儀 (磁珠法)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)HBVDNA的性能評(píng)價(jià)

王建偉，孫嘉峰，黃毅

(1、福建省立醫(yī)院南院福建省立金山醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 福州350008；2、福建省立醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 福州350001)

乙型肝炎病毒DNA(hepatitis B virus Deoxyribonucleic acid，HBV DNA)是反映HBV復(fù)制活躍程度及傳染性的最直接指標(biāo)，也是觀(guān)察抗病毒藥物療效、預(yù)后和指導(dǎo)抗病毒藥物應(yīng)用的重要指標(biāo)之一。HBVDNA定量檢測(cè)從根本上突破了免疫學(xué)方法等間接方法的局限性，通過(guò)直接檢測(cè)病毒核酸水平，可真實(shí)反應(yīng)患者體內(nèi)病毒水平[1-3]。目前提取HBVDNA主要采用煮沸法，該法不能有效去除干擾物質(zhì)如血紅蛋白，提取的血漿HBV DNA含量較低，接近臨界值標(biāo)本的提取結(jié)果不穩(wěn)定，在臨床檢測(cè)中容易產(chǎn)生假陰性[4]。本研究應(yīng)用西安天隆NP968自動(dòng)核酸提取儀(磁珠法)提取HBVDNA，相比傳統(tǒng)的煮沸法，具有快速、簡(jiǎn)便、減少人工誤差等特點(diǎn)。根據(jù)ISO15189醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)[5]，必須對(duì)其檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行性能評(píng)價(jià)，本文通過(guò)分析其精密度、線(xiàn)性、回收率、最低檢出限，并將檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)煮沸法進(jìn)行對(duì)比，分析其相關(guān)性，從而評(píng)價(jià)該法對(duì)HBVDNA檢測(cè)的性能。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 來(lái)自2014年10月13日至10月17日我院PCR實(shí)驗(yàn)室接收的79例門(mén)診患者血漿標(biāo)本及我院免疫室接收的20份我院國(guó)內(nèi)體檢健康人血清標(biāo)本。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 試劑 HBVDNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒與HBVDNA標(biāo)準(zhǔn)品(廣州達(dá)安公司)；核酸提取(磁珠法)試劑盒(西安天隆公司)。

1.2.2 儀器 NP968核酸提取儀(NP968，西安天隆公司)；ABI7300實(shí)時(shí)熒光PCR儀 (ABI7300,美國(guó)ABI公司)。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 HBVDNA提取與檢測(cè)

1.3.1.1 煮沸法 按照達(dá)安公司HBVDNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)取待測(cè)血漿樣本、HBVDNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒內(nèi)陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品、標(biāo)準(zhǔn)品和自制高值、低值質(zhì)控品各30μl，分別加入70μl核酸提取液，充分振蕩混勻后 ，100℃ 恒 溫 處 理 10±1min，12000r/min 離 心5min，取 20μl上清液加入反應(yīng)管，在 ABI7300實(shí)時(shí)熒光PCR儀上進(jìn)行HBVDNA的定量檢測(cè)。

1.3.1.2 磁珠法 按照NP968自動(dòng)核酸提取儀 (磁珠法)試劑盒說(shuō)明書(shū)，取待測(cè)血漿、達(dá)安試劑盒陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品各200μl，加入預(yù)先分裝好自動(dòng)核酸提取液的板孔內(nèi)，放入NP968自動(dòng)核酸提取儀內(nèi)，按預(yù)定的提取程序自動(dòng)執(zhí)行核酸提取，最終得到100μl洗脫液，取20μl上清液加入反應(yīng)管，在ABI7300實(shí)時(shí)熒光PCR儀上進(jìn)行HBVDNA的定量檢測(cè)。

1.3.2 精密度評(píng)價(jià) 按照CLSI EP15-A2標(biāo)準(zhǔn)：2個(gè)濃度水平，5d實(shí)驗(yàn)，每天一批，每批每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定3次，所有測(cè)定數(shù)據(jù)均轉(zhuǎn)化為對(duì)數(shù)值。

1.3.3 線(xiàn)性評(píng)價(jià) 選擇1份高值患者血漿標(biāo)本，濃度接近廠(chǎng)家試劑盒說(shuō)明書(shū)給出的線(xiàn)性范圍上限(5.00E8 IU/ml)，按1:10用正常人血漿倍比稀釋此高值標(biāo)本直至濃度接近線(xiàn)性范圍下限 (1.00E2 IU/ml)，形成濃度由高到低7份待測(cè)實(shí)驗(yàn)樣品。每份實(shí)驗(yàn)樣品在檢測(cè)系統(tǒng)上重復(fù)測(cè)定2次,結(jié)果轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)，取2次測(cè)定的均值作為實(shí)測(cè)值(Y)；以其系列稀釋后理論上應(yīng)含有的濃度(亦取對(duì)數(shù))作為預(yù)期值(X)，將所有結(jié)果點(diǎn)在X-Y坐標(biāo)圖上，計(jì)算回歸方程:Y=bX+a。

1.3.4 回收率 選擇廠(chǎng)家配套低值標(biāo)準(zhǔn)品為基礎(chǔ)樣本，取180μl基礎(chǔ)樣本和20μl蒸餾水作為對(duì)照樣本， 分別取 180μl基礎(chǔ)樣本和 20μl濃度為2.0E6IU/ml、2.0E5IU/ml和 2.0E4IU/ml的標(biāo)準(zhǔn)品作為回收樣品。每份樣品在檢測(cè)系統(tǒng)上測(cè)定3次，結(jié)果轉(zhuǎn)換為對(duì)數(shù)，取平均值。根據(jù)以下公式計(jì)算回收率：回收率=回收濃度/加入濃度×100%；回收濃度=最終測(cè)定濃度-基礎(chǔ)樣本濃度；加入濃度=標(biāo)準(zhǔn)品濃度×標(biāo)準(zhǔn)品體積/(標(biāo)準(zhǔn)品體積+基礎(chǔ)樣本體積)[6]。

1.3.5 最低檢出限 依據(jù)YY/T 1182-2010中華人民共和國(guó)醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 《核酸擴(kuò)增檢測(cè)用試劑(盒)》之6.8.2條款要求[7]，采用無(wú)菌注射用水將購(gòu)自衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心的HBVDNA血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(1.20±0.24)E6 IU/ml按 1：10000 進(jìn)行稀釋?zhuān)蛊錆舛冗_(dá)到廣州達(dá)安公司HBVDNA試劑聲明的最低檢出限(1.00E2 IU/ml)后，進(jìn)行25次重復(fù)檢測(cè)，以至少22次結(jié)果≥1.00E2 IU/ml為最低檢出限驗(yàn)證通過(guò)；如不符合此要求，應(yīng)查找原因，并補(bǔ)充數(shù)據(jù)或重新實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 參考區(qū)間 參考NCCLSC28-A2，通過(guò)測(cè)定29份我院國(guó)內(nèi)體檢健康人血清標(biāo)本 (標(biāo)本從我科免疫組獲得，乙肝兩對(duì)半模式為全陰/或-+---/或-+--+)的 HBV DNA 濃度，對(duì)〈1.00E3 IU/ml的生物參考區(qū)間進(jìn)行驗(yàn)證；若20份標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果均在參考區(qū)間內(nèi)或僅有2個(gè)標(biāo)本超出，則驗(yàn)證通過(guò)。否則，進(jìn)行參考區(qū)間確立實(shí)驗(yàn)。

1.3.7 相關(guān)性評(píng)價(jià) 分別采用煮沸法和磁珠法提取79例患者血漿標(biāo)本進(jìn)行熒光定量PCR，比較兩種方法的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 將定量HBVDNA拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化為對(duì)數(shù)值，所有統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均在SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件包上進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 精密度驗(yàn)證 低、高水平樣本檢測(cè)的批內(nèi)精密度均<3/5TEa，批間精密度均<4/5TEa。該檢測(cè)方法的批內(nèi)及批間精密度均符合廠(chǎng)家要求小于5%(見(jiàn)表1)。

表1 精密度驗(yàn)證結(jié)果

2.2 線(xiàn)性范圍驗(yàn)證 HBV-DNA在4.16E2-4.16E8 IU/ml范圍內(nèi)具良好線(xiàn)性關(guān)系 (廠(chǎng)家線(xiàn)性范圍1.0E2-5.0E8 IU/ml)，R2=0.989，b=1.01 在 0.97~1.03范圍內(nèi)；a=0.271，經(jīng)t檢驗(yàn)顯示a與0無(wú)顯著性差異(P>0.05)(見(jiàn)表 2，如圖 1)。

表2 線(xiàn)性范圍驗(yàn)證結(jié)果

圖1線(xiàn)性驗(yàn)證數(shù)據(jù)散點(diǎn)圖

2.3 回收實(shí)驗(yàn) 根據(jù)相關(guān)公式計(jì)算的檢測(cè)平均回收率為104%。見(jiàn)表3。

2.4 最低檢出限驗(yàn)證 廠(chǎng)家聲明的最低檢出限(1.00E2 IU/ml)驗(yàn)證試驗(yàn)通過(guò)。見(jiàn)表4。

2.5 參考區(qū)間 參考區(qū)間為<1.00E3 IU/ml。見(jiàn)表5。2.6兩種方法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性分析 以煮沸法檢測(cè)結(jié)果為X，以磁珠法檢測(cè)結(jié)果為Y，經(jīng)分析顯示兩者相關(guān)性良好(Y=0.995X+0.526,R2=0.951。見(jiàn)圖2。

表3 回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4 最低檢出限驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 參考區(qū)間驗(yàn)證結(jié)果

圖2磁珠法與煮沸法檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性分析

3 討論

我國(guó)人群對(duì)HBV普遍易感，HBVDNA是HBV感染最直接、特異性強(qiáng)和靈敏性高的指標(biāo)。HBVDNA陽(yáng)性提示HBV復(fù)制和有傳染性，其含量越高表示病毒復(fù)制越厲害，傳染性越強(qiáng)。因此，HBV DNA定量檢測(cè)對(duì)于判斷乙型肝炎傳染性強(qiáng)弱、乙型肝炎病毒復(fù)制情況、乙型肝炎抗病毒治療效果等都有十分重要的意義[8-11]。

病毒核酸的檢測(cè)是生命科學(xué)領(lǐng)域一個(gè)重要的分支，在臨床病原體檢測(cè)、傳染性疾病及基因診斷方面具有獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值。核酸提取是核酸檢測(cè)中關(guān)鍵的步驟，直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果[12]。目前，實(shí)驗(yàn)室一般采用傳統(tǒng)的手工提取方法(煮沸法、柱提取法等)。煮沸法直接將病毒DNA從病毒顆粒中釋放出來(lái)，離心后的上清液中不僅含有病毒核酸，還含有少量血紅蛋白等一些干擾PCR的抑制性雜質(zhì)；并且在處理臨床標(biāo)本時(shí)，存在生物安全等問(wèn)題。因此，臨床實(shí)驗(yàn)室迫切需要自動(dòng)化方法來(lái)進(jìn)行核酸提取[13]。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，極大的推動(dòng)了基于磁珠微球的自動(dòng)核酸提取法的發(fā)展，目前自動(dòng)核酸提取法(磁珠法)已經(jīng)應(yīng)用于臨床核酸(DNA和RNA)等多種物質(zhì)的分離和純化[14]。磁珠法方法提取的核酸純度高，能夠除去大多干擾PCR的抑制因子，如蛋白質(zhì)、多糖、酚類(lèi)等物質(zhì)，使實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法更靈敏、更準(zhǔn)確[15]。NP968自動(dòng)核酸提取儀具有自身的優(yōu)勢(shì)：(1)提取速度快，操作時(shí)間短，30~60min/次，通量大，每次可同時(shí)提取32份樣品；(2)內(nèi)置紫外光殺菌功能可自我清潔；(3)嚴(yán)格控制孔間污染及批次間污染；(4)能有效避免人工操作引起的差異及錯(cuò)誤，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好。

精密度評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)按照EP15-A2文件進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示基于NP968自動(dòng)核酸提取儀 (磁珠法)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，檢測(cè)HBVDNA的低、高水平批內(nèi)精密度均<3/5TEa，批間精密度均<4/5TEa，精密度良好。線(xiàn)性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)根據(jù)CLSI EP6-A文件，采用簡(jiǎn)便的平均斜率法，結(jié)果顯示基于NP968自動(dòng)核酸提取儀(磁珠法)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)HBVDNA，在4.16E2~4.16E8 IU/ml范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，達(dá)到廠(chǎng)家的檢測(cè)聲明。最低檢出限驗(yàn)證 依據(jù)YY/T 1182-2010中華人民共和國(guó)醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 《核酸擴(kuò)增檢測(cè)用試劑(盒)》之6.8.2條款要求，廠(chǎng)家聲明的最低檢出限(1.00E2 IU/ml)驗(yàn)證試驗(yàn)通過(guò)。在定量分析驗(yàn)證時(shí)，準(zhǔn)確度通?？捎没厥章时硎荆厥章试浇咏?00%表明分析方法準(zhǔn)確度越高。本研究回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，基于磁珠法的HBVDNA檢測(cè)回收率為104%，接近100%，準(zhǔn)確度高。根據(jù)NCCLSC28-A2，參考區(qū)間<1.00E3IU/ml驗(yàn)證試驗(yàn)通過(guò)。此外，通過(guò)對(duì)79例患者血漿標(biāo)本磁珠法與煮沸法HBVDNA檢測(cè)結(jié)果的比較，表明兩者相關(guān)性良好(Y=0.995X+0.526,R2=0.951)。總之，基于NP968自動(dòng)核酸提取儀(磁珠法)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了快速、自動(dòng)化提取HBVDNA，對(duì)HBVDNA具有良好檢測(cè)性能，適合臨床實(shí)驗(yàn)室推廣使用。

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