江西省急性髓系白血病NPM1和FLT3-ITD基因突變分析

簡正偉 ，石淙 ，聞芳 ，萬臘根 ，張長林

(1、南昌大學第四附屬醫(yī)院檢驗科，江西 南昌330003；2、南昌大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，江西 南昌330006)

急性髓細胞白血病 (acute myeloid leukemia,AML)是多能干細胞發(fā)生突變所形成的一類具有細胞和分子遺傳學特征的高度異質性疾病。隨著分子生物學技術不斷的應用于臨床，越來越多的基因突變檢測對臨床的治療起著重要提示作用。其中NPM1和FLT3-ITD基因是突變率最多見的兩類，2010年美國血液學會 (American Society of hematology)會議已明確[1]，NPM1基因突變是AML,尤其是正常核型AML預后良好的指標,而具有FLT3-ITD基因突變患者預后較差。本研究分析187例初發(fā)急性髓細胞白血病患者NPM1和FLT3-ITD基因突變情況，并分析其臨床特征。

1 材料與方法

1.1 臨床病例 收集2011年6月至2013年2月南昌大學第一附屬醫(yī)院急性髓細胞白血病初發(fā)病例187例，所有患者都經(jīng)細胞形態(tài)學和流式細胞術免疫學分型，并參照《血液病診斷及療效標準》[2]確診為AML的病例。其中M1占9例，M2占72例，M3占50例，M4占20例，M5占24例，M6占4例。男女比例100:87，中位年齡41(13～79)歲。

1.2 染色體分析 取肝素抗凝的骨髓液2ml，換算成有核細胞約(1～2)×106／ml，然后分別用直接法和短期培養(yǎng)法制備染色體，采用G顯帶技術進行核型分析。染色體核型描述參照《人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN 2005)》。

1.3 NPM1和FLT3-ITD突變檢測 取200μlEDTA抗凝骨髓，參照飛捷生物科技公司的微量基因組DNA極速抽提試劑盒提取基因組DNA，獲得的基因組DNA通過紫外分光光度計進行定量，取50～100ng/μl基因組DNA進行基因突變檢測。NPM1突變檢測方法見參考文獻[3]。以特異性引物擴展FLT3-ITD基因突變區(qū),上游引物為5’gcaatttaggtatgaaagccagc-3’， 下游引物為 5’ctttcagattttgacggcaacc-3’,擴展產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，野生型FLT3擴展產(chǎn)物為329bp，存在ITD突變會在野生型條帶上游出現(xiàn)特異性條帶。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行分析，以中位數(shù)進行統(tǒng)計，P<0.05有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NPM1和FLT-ITD突變檢測 采用等位基因特異性PCR(Allele-specific PCR,AS-PCR)方法檢測NPM1基因突變，該方法可以檢測到4種常見的NPM1基因突變(圖1)。采用PCR擴展FLT3基因第12外顯子，通過觀察PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳的遷移情況判斷FLT3-ITD突變(圖2)。在收集到的187初發(fā)急性髓系白血病患者中，共檢查到67例(35.83%)患者存在基因突變，其中39例(20.68%)AML患者存在單一 NPM1突變，15例(8.02%)出現(xiàn)單一FLT3-ITD突變，13例(6.95%)患者同時存在NPM1和FLT3-ITD突變。

圖1白血病病人NPM1突變檢測

圖2 FLT3-ITD突變檢測

2.2 NPM1和FLT-ITD突變與FAB分型關系 見表1。

表1 白血病病人基因突變情況n(%)

2.3 臨床資料特征 在187例患者中，有NPM1突變患者和非NPM1突變患者之間在男女比例、中位年齡、血小板中位數(shù)和骨髓原始細胞比例中位數(shù)均沒有差異性，但是白細胞中位數(shù)二者有差異(表2)。在FLT3-ITD突變患者臨床特征分析中，在男女比例、中位年齡、血小板中位數(shù)和非FLT3-ITD突變患者沒有差異性，兩者在白細胞中位數(shù)和骨髓原始細胞比例中位數(shù)有差異性，F(xiàn)LT3-ITD突變患者白細胞中位數(shù)和骨髓原始細胞比例中位數(shù)都比非FLT3-ITD突變患者高(表3)。

表2 NPM1突變患者臨床特征分析

表3 FLT3-ITD突變患者臨床特征分析

2.4 突變和細胞遺傳學的關系 在187例白血病患者中，有72例患者沒有檢測染色體或者檢測了未檢見分裂相，在可分析的115例患者中，80例正常核型當中，有17例(21.3%)NPM1突變;在35例異常核型組中，檢見13例NPM1突變；在正常核型中同時檢測出11例FLT3-ITD突變，突變率為13.8%，而在異常核型組中，檢出8例FLT3-ITD突變，突變率為22.9%，但兩者之間均無統(tǒng)計學意義(表 4)。

表4 比較白血病病人NPM1和FLT3-ITD突變患者染色體情況

2.5突變型和野生型療效的比較 187例患者治療效果比較，其中NPM1突變型52例，野生型135例，2組之間≤2個治療周期CR緩解率分別為79.5%和35.8%(P<0.05);FLT3-ITD突變患者28例，野生型159例，兩者之間≤2個治療周期CR緩解率分別為27.6%和72.8%(P<0.05);隨訪時間1~25.6月，中位隨訪周期9.6月。

此外，我們把187例患者分成NPM1+/FLT3-ITD-組、NPM1-/FLT3-ITD-組、NPM1+/FLT3-ITD+組和NPM1-/FLT3-ITD+組進行療效觀察，2個治療周期CR緩解率分別為82.3%、65.8%、52.9%和26.8%。其中單獨NPM1突變組完全緩解率最高，而單獨FLT3-ITD突變組完全緩解率最低。

3 討論

急性髓系白血病AML是起源于造血干細胞的惡性克隆性疾病，具有高度的異質性。一直以來，我們都是通過檢測白血病患者染色體的變異來區(qū)分病人的預后情況。但是對于一些染色體正常核型病人，我們不能很好地區(qū)分患者的預后情況。隨著分子生物學技術不斷地應用于臨床，一些新型基因突變檢測可以很好地對病人治療、預后提供指導價值。在這些基因突變中，NPM1和FLT3-ITD是突變率最高，對預后評估最有價值的兩類基因。

我們在187例初發(fā)白血病患者中分別檢測出NPM1突變率為27.80%(52/187)；檢測出FLT3-ITD突變率為14.97%(28/187)。 和日本學者Suzuki T(24.9%NPM1,22.6%FLT3-ITD)[4]；德國學者 Thiede C(27.5%NPM1,21%FLT3-ITD)[5]、泰國學者 Boonthimat C (26%NPM1,33%FLT3-ITD)[6]相比較，NPM1突變率基本接近，但是他們FLT3-ITD突變率都比我們的研究結果要高，可能是由于樣本分布不同和種族差異有關。

在本研究中NPM1突變主要存在于M5、M2和M1中。丁子軒等[7]研究656例中國急性髓系白血病患者NPM1基因突變情況，其中有169例突變，突變率大約25.8%，其中以M5、M1多見。Jeon Y等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在83例AML患者中有NPM1突變19例，突變率為22.9%，在形態(tài)學亞型中多見于M5和M2。這和我們的研究結果相近。但是我們研究FLT3-ITD突變多存在于M1、M4中較多見，而國外學者研究病例中FLT3-ITD突變多存在于M3[9]，這可能是病例樣本組成不同或者國內外樣本差異有關。

我們研究FLT3-ITD突變患者在年齡 、性別和血小板中位數(shù)之間差異沒有統(tǒng)計學意義，但是突變陽性患者比陰性患者在白細胞中位數(shù)和骨髓原始細胞比例中位數(shù)均顯著偏高，這和國外研究結果相一致[10]。這可能與FLT3-ITD突變引起近膜區(qū)空間構型改變引起RTK持續(xù)激活,導致細胞增殖有關[11]。而NPM1突變患者在年齡 、性別、血小板中位數(shù)和骨髓原始細胞比例中位數(shù)同陰性患者之間無顯劇差異，但是突變陽性患者白細胞中位數(shù)較陰性患者偏高[12]。

國內外研究認為NPM1和FLT3-ITD突變在染色體正常核型多見[13]，但我們在187病例中只有115例可分析染色體核型，兩者突變在正常核型和異常核型之間并沒有差異性，這與國外研究結果不一致，可能是國內外病例組成不同；另外我們有72例患者沒有檢測出染色體，可能這部分病例有較多正常核型樣本，所以對正異常核型比有一定影響。

一般研究認為NPM1基因突變是預后良好的指標，存在NPM1基因突變的患者緩解率高，生存期長，并且在疾病進展中比較穩(wěn)定[14，15]。而FLT3-ITD突變意義則相反，一般預后較差。2008年世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)和歐洲造血與血液病理學協(xié)會共同制定AML新的分型分類計劃，認為NPM1基因突變的可以作為AML亞群中獨立的預后指標[16]。我們把NPM1和FLT3-ITD突變陽性和陰性患者在2個治療周期CR緩解率進行比較，發(fā)現(xiàn)NPM1陽性患者在2個治療周期CR緩解率較陰性患者效果好，而FLT3-ITD突變陽性患者則CR緩解率效果差，兩者之間差異均有統(tǒng)計學意義。同時我們按NPM1和FLT3-ITD突變陰陽性分成四組，發(fā)現(xiàn)單獨NPM1突變組完全緩解率最高，而單獨FLT3-ITD突變組完全緩解率最低，這與國內外研究結果相符[17]。

通過同時檢測NPM1和FLT3-ITD突變情況，可以給臨床白血病患者治療、預后提供指導意義。

[1]Foran JM.New prognostic markers in acute myeloid leukemia perspective from the clinic[J].Hematology Am Soc Hemato Educ Program,2010:47-55.

[2]張之南,沈悌.血液病診斷及療效標準[M].第3版．北京:科學出版社,2007:106-116.

[3]簡正偉,徐芬,石淙,等.一種檢測多種NPM1突變體的ARMS-PCR方法的建立[J].中國實驗血液學,2013,21(4):1058-1062.

[4]Suzuki T,Kiyoi H,Ozeki K,et al.Clinical characteristics and prognostic implications of NPM1 mutations in acute myeloid leukemia[J].Blood,2005,106,(8):2854-2861.

[5]Thiede C,Koch S,Creutzig E,et al.Prevalence and prognostic impact of NPM1 mutations in 1485 adult patients with acute myeloid leukemia(AML)[J].Blood,2006,107(10):4011-4020.

[6]Boonthimat C,Thongnoppakhun W,Auewarakul CU.Nucleophosmin mutation in Southeast Asian acute myeloid leukemia:eight novel variants,FLT3 coexistence and prognostic impact of NPM1/FLT3 mutations[J].Haematologica,2008，93(10)：1565-1569.

[7]Ding ZX,Shen HJ,Miao JC,et al.C-kit,NPM1 and FLT3 gene mutation patterns and their prognostic significance in 656 Chinese patients with acute myeloid leukemia[J].Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi,2012,33(10):829-834.

[8]Jeon Y,Seo SW,Park S,et al.Identification of two novel NPM1 mutations in patients with acute myeloid leukemia[J].Ann Lab Med,2013,33(1):60-64.

[9]Small D.FLT3 mutations:biology and treatment[J].Hematology Am Soc Hematol Educ Program,2006:178-184.

[10]Frohling S,Schlenk RF,Breitruck J,et al.Prognostic significance of activating FLT3 mutations in younger adults(16 to 60 years)with acute myeloid leukemia and normal cytogenetics:a study of the AML Study Group Ulm[J].Blood,2002,100(13):4372-4380.

[11]Stirewalt DL,Radich JP.The role of FLT3 in haematopoietic malignancies[J].Nat Rev Cancer,2003,3(9):650-665.

[12]Dohner K,Schlenk RF,Habdank M,et al.Mutant nucleophosmin(NPM1)predicts favorable prognosis in younger adults with acute myeloid leukemia and normal cytogenetics:interaction with other gene mutations[J].Blood,2005,106(12):3740-3746.

[13]Falini B,Mecucci C,Tiacci E,et al.Cytoplasmic nucleophosmin in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype[J].N Engl JMed,2005,352(3):254-266.

[14]Kronke J,Schlenk RF,Jensen KO,et al.Monitoring of minimal residual disease in NPM1-mutated acute myeloid leukemia:a study from the German-Austrian acute myeloid leukemia study group[J].JClin Oncol,2011,29(19):2709-2716.

[15]Schnittger S,Kern W,Tschulik C,et al.Minimal residual disease levels assessed by NPM1 mutation–specific RQ-PCR provide important prognostic information in AML[J].Blood,2009,114(11):2220-2231.

[16]Vardiman JW,Thiele J,Arber DA,et al.The 2008 revision of the World Health Organization(WHO)classification of myeloid neoplasms and acute leukemia:rationale and important changes[J].Blood,2009,114(5):937-951.

[17]Schneider F，Hoster E,Unterhalt M,et al.NPM1 but not FLT3-ITD mutations predict early blast cell clearance and CR rate in patients with normal karyotype AML(NK-AML)or high-risk myelodysplastic syndrome(MDS)[J].Blood,2009,113(21):5250－5253.