海藻酸鈉包埋啤酒酵母絮凝劑的制備研究

張龍顏，李保珍，李丹，張曉峰，王蘭＊

（1.山西大學 生命科學學院，山西 太原 030006；2.山西省煤炭地質局，山西 太原 030006）

0 引言

山西擁有豐富的地下巖溶水資源，但是礦化度和硬度很高。經(jīng)測定，太原市清徐縣地下巖溶水的礦化度和硬度（以CaCO3計）分別高達3 109 mg·L－1、2 856 mg·L－1，屬于高礦化度和高硬度水，不能直接作為工農業(yè)生產(chǎn)用水和生活飲用水［1］。常規(guī)化學絮凝劑在使用過程中會對水質帶來一定危害，例如化學絮凝劑聚合氯化鋁中的鋁離子對環(huán)境危害主要包括：毒害水生生物和微生物，通過食物鏈和飲用水最終危害人體健康［2］。近年來，微生物作為一種新型的絮凝劑備受關注。研究發(fā)現(xiàn)，利用微生物進行水處理具有良好的效果，體現(xiàn)出活性高、用量少、無二次污染等優(yōu)點［3－6］。

微生物處理污水和廢水的原理是，運用微生物菌體或其產(chǎn)生的代謝物對水體中的污染有機物、固體懸浮顆粒、菌體細胞及膠體粒子等發(fā)生凝聚、沉淀［7］。郭彥涵［8］發(fā)現(xiàn)用啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）制作的固定化菌可以處理高礦化度和高硬度水，即利用固定化劑海藻酸鈉包埋啤酒酵母制作的固定化小球，較單獨添加啤酒酵母或海藻酸鈉空白球處理效果更好；其發(fā)現(xiàn)固定化小球在投加量4g·L－1、絮凝時間60 min時，對巖溶水中離子吸附效果最大；分析水樣后發(fā)現(xiàn)，啤酒酵母固定化小球對巖溶水中的離子尤其是Ca2＋、Mg2＋具有很強的吸附性能，能夠降低巖溶水的硬度和礦化度。但是，關于固定化因素對小球物理性質及對硬度礦化度處理效率的影響少見報道。

本研究從制作固定化小球的固定化因素出發(fā)，選出具有最優(yōu)物理性質的固定化區(qū)間，再以選出的最優(yōu)物理性能的固定化因素為水平區(qū)間，以巖溶水的硬度和礦化度處理效率為指標進行正交實驗，探討固定化因素對巖溶水硬度和礦化度絮凝效果的影響，研制出固定化小球的最優(yōu)固定化條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

海藻酸鈉（優(yōu)級純，天津光復精細化工研究所）；氯化鈣（分析純，天津市巨星圣源化學試劑有限公司）；鈣和鎂標準液：購自國家標準樣品研究所；

1.1.2 主要儀器

火焰原子吸收儀（美國瓦里安公司，AA240FS）、雷磁便攜式電導率儀（上?；瘜W精密科學儀器有限公司，DDB-303A）、空氣恒溫搖床（美國 GXROMAX，SK-767）、醫(yī)用高速離心機（北京醫(yī)用離心機廠）、磁力攪拌器（雙向磁力加熱攪拌器，78-2型）、掃描電子顯微鏡（日本，JSM-6360LV）、冷凍干燥機（上海比朗儀器制造有限公司，F(xiàn)D-1A-50）

1.1.3 實驗菌種

啤酒酵母（取自山西大學生命科學學院微生物實驗室），所需培養(yǎng)基如下：種子培養(yǎng)基：馬鈴薯20 g，葡萄糖2 g，蒸餾水100 m L；121℃滅菌30 min［9］。擴大培養(yǎng)基：葡萄糖2 g，麥芽糖3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，酵母粉10 g，牛肉膏5 g，蒸餾水1 000 m L；121℃滅菌30 min［10］。培養(yǎng)方法：取一環(huán)保藏的啤酒酵母菌種接種到種子培養(yǎng)基上，恒溫搖床110 r·min－1、28℃培養(yǎng)3 d，再以3% 的接種量接種到擴大培養(yǎng)基上。在110 r·min－1、28℃條件下進行擴大培養(yǎng)3 d后［11］，取啤酒酵母菌液在離心機上以4 000 r·min－1、10 min離心得到菌體之后，用無菌蒸餾水沖洗菌體再次離心。重復3次后得到菌體備用。

1.1.4 水樣

巖溶水（采自太原市清徐縣北營村井下700 m處），經(jīng)原子吸收儀測定水樣離子含量后，計算出開采出來的水樣總硬度（以CaCO3計）達到2 856 mg·L－1，礦化度（經(jīng)電導率儀測定后經(jīng)公式換算）達3 109 mg·L－1，屬于高礦化度高硬度水。

1.2 方法

1.2.1 啤酒酵母絮凝劑的制備流程

絮凝劑的制備流程如下：① 稱取一定質量的海藻酸鈉溶于水中，配成質量分數(shù)2%的海藻酸鈉溶液；②取一定質量的啤酒酵母加入到質量分數(shù)為2% 海藻酸鈉溶液中，攪拌均勻后配成菌體占總質量分數(shù)為8%的混合液；③ 用10 m L注射器取混合液滴入到預先配好的質量分數(shù)2% 的氯化鈣溶液中交聯(lián)成球，4℃ 冰箱靜置6 h，抽濾、洗滌后放入保藏培養(yǎng)基中備用［6，12］。

1.2.2 啤酒酵母包埋菌的馴化培養(yǎng)

配置保藏馴化培養(yǎng)基，保藏馴化培養(yǎng)基成分為：葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、p H自然，保藏培養(yǎng)基所用水為巖溶水。其中將制備好的固定化啤酒酵母以一定的質量比例加到裝有保藏培養(yǎng)基的250 m L三角錐瓶中，在空氣恒溫搖床上以110 r·min－1、28℃ 條件培養(yǎng)馴化3 d，期間保藏培養(yǎng)基每天一換。

1.2.3 啤酒酵母包埋菌絮凝巖溶水的分析方法

取上述制作馴化了的固定化啤酒酵母0.8 g投入到200 mL巖溶水中，在磁力攪拌器上（以750 r·min－1轉速）常溫處理60 min，之后取樣過濾，稀釋，測鈣、鎂離子含量及電導率，并計算硬度和礦化度及絮凝率［15－17］。

1.3 固定化因素對啤酒酵母絮凝劑物理性能的影響

1.3.1 海藻酸鈉濃度、菌體質量比、交聯(lián)時間及氯化鈣濃度對固定化小球物理性能的作用

在其他條件不變的情況下，相應的海藻酸鈉質量分數(shù)分別為1.0%－4.0%、菌體質量比分別為4%、6%、8%、10%、12%，交聯(lián)時間4 h、6 h、8 h、12 h、24 h以及氯化鈣濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%。制作方法與1.2.1的方法相同，選取一定量的小球過濾、抽濾、洗滌測其成球性能、機械強度和滲透性能。成球效果：肉眼觀察；機械強度測定：取制作好的10粒大小一樣的固定化小球放在兩個干凈的載玻片之間，用濾紙吸干小球水分，用載玻片緩慢壓小球，以小球破碎瞬間的電子天平指示的數(shù)值作為小球（換算成10－2N）機械能力指標，連測3次取平均值［13］；滲透性能測試：選取形態(tài)完好、大小均勻的固定化小球，浸入惰性紅墨水中，記錄小球被紅墨水完全滲透的時間［14］。

1.3.2 用正交實驗優(yōu)化制作啤酒酵母固定化小球的固定化因素

以SA濃度、菌體質量比、交聯(lián)時間和氯化鈣濃度為正交實驗因素，分別記作A、B、C、D，以單因素最優(yōu)物理性質為水平區(qū)間，以硬度、礦化度絮凝率為指標，通過正交實驗選出最優(yōu)固定化條件。

1.4 硬度和礦化度及絮凝率分析方法

總硬度測定方法用文獻［18-19］的方法，先用火焰原子吸收儀測定水樣中鈣和鎂離子的濃度，后用如下公式（1）計算總硬度，其中，TH 為總硬度，［Ca2＋］為 Ca2＋濃度（mg·L－1），［Mg2＋］為 Mg2＋濃度（mg·L－1），總硬度（TH）以CaCO3計，計算每升巖溶水中鈣鎂離子的總物質的量（mmol），并與系數(shù)100.08相乘得到每L巖溶水中所含CaCO3的質量（mg）即為總硬度。硬度絮凝率的計算如式（2）所示，其中R為絮凝率，C0為原巖溶水的硬度，C為經(jīng)絮凝劑處理后巖溶水的硬度。

礦化度的測定參照公式（3）時紅［20］的方法，其中，y為礦化度（mg·L－1），x為電導率（mS·cm－1），先用電導率儀測定水樣中的電導率，再通過公式（3）計算礦化度，并計算絮凝率，絮凝率的計算如式（2）。

2 結果

2.1 包埋菌形態(tài)及表面微觀結構

新制備的包埋菌小球（如圖1a）為直徑約1～2 mm的規(guī)則小球，其中小球凝膠部分為白色呈半透明狀，整體顏色因包埋活性啤酒酵母而成肉眼可見的乳白色，小球表面光滑且有彈性，機械強度良好，無異味。將固定化小球冷凍干燥后、噴金、在掃描電子顯微鏡下觀察（圖1b、c、d），可以發(fā)現(xiàn)固定化小球表面凹凸不平并有大量凸起，分別放大300和1 000倍后，發(fā)現(xiàn)固定化小球表面附著著大量的啤酒酵母菌，海藻酸鈉跟氯化鈣的交聯(lián)能夠為啤酒酵母提供良好的生存環(huán)境；在凸起處有許多球形突起，說明啤酒酵母與包埋凝膠體表面結合緊密。而菌團狀的啤酒酵母則增強了其對金屬離子的集中絮凝能力；菌越集中，則受到水的沖刷力就越小。在包埋菌馴化絮凝巖溶水后發(fā)現(xiàn)，小球表面變化較大（圖1e），其中小球表面附著大量的似菌體代謝產(chǎn)物的絮狀物，小球表面多出許多孔隙和空洞，能夠為與金屬離子結合提供條件，而菌代謝產(chǎn)物蛋白質、核酸上的活性基團能夠與金屬離子絡合并形成絡合物并附著在小球表面。

Fig.1 Shape and SEM pictures of immobilization pellets圖1 固定化小球形態(tài)與表面微觀結構

2.2 海藻酸鈉濃度對固定化小球物理性能的影響

表1 海藻酸鈉濃度對固定化效果的影響Table 1 Effect of sodium alginate concentration on immobilization effect

從表1可以看出，隨著SA濃度的增大，固定化小球機械強度逐漸增強，滲透時間逐漸增加。當SA溶液濃度在1.0%－1.5%時，固定化小球不成球或者成球形狀不規(guī)則。滲透時間短表明紅墨水傳質性能良好；機械強度低使得抗壓力差、容易破碎，導致不能重復利用。當SA溶液在2.0%－3.0% 時，固定化小球成球形狀規(guī)則、有彈性，滲透時間較短、傳質性能良好；機械強度隨著SA溶液濃度的增加而增加，增加重復利用性。然而，當SA溶液濃度高于3.0%時，固定化小球成球有嚴重的拖尾現(xiàn)象，機械強度雖然大但是傳質性能不理想，不利于菌體發(fā)揮其活性。故選用2.0%－3.0% 濃度的SA作為包埋劑包埋菌體。

2.3 菌體包埋比、交聯(lián)時間與氯化鈣濃度對固定化小球物理性能的影響

依據(jù)海藻酸鈉濃度對固定化菌物理性質的實驗分析方法，同理可得，當啤酒酵母菌體與SA質量比例為6%－10%時，固定化小球成球規(guī)則，機械強度好，達到32.61×10－2N以上，傳質性能好。交聯(lián)時間是指菌體－SA混合液滴入交聯(lián)劑氯化鈣溶液后的成球反應時間，由實驗結果可知，當交聯(lián)時間為6～10 h時，其小球成球規(guī)則，機械強度高、傳質性能良好。同理，應選用2%－4% 氯化鈣作為其最佳包埋交聯(lián)劑濃度。

2.4 正交實驗因素與結果

本實驗采用正交表L9（34）進行試驗，即四因素三水平，共有9組實驗組，每組三次重復。以海藻酸鈉、菌體質量比、氯化鈣和交聯(lián)時間為因素，以單因素物理性質實驗選出的最優(yōu)水平為正交實驗水平，分別以硬度和礦化度絮凝率為試驗指標。正交試驗因素及水平如下表2所示，正交試驗結果及方差分析如表3、表4、表5、表6所示，其中礦化度絮凝率結果及方差分析如表3、表4所示，硬度絮凝率結果及方差分析如表5、表6所示。

表2 正交試驗因素及水平Table 2 Factors and levels of orthogonal array design

表3 礦化度正交試驗結果Table 3 Orthogonal results of salinity

表3是以礦化度絮凝率為指標計算出的各因素條件下的實驗結果之和與極差，分別用k1、k2、k3表示，極差用R表示，k越大表示條件越優(yōu)，從表可以看出：比較k1、k2、k3的大小可以得出，A2B3C3D3為各個因素的最佳水平組合，分析極差R大小可以得出各因素對礦化度絮凝率影響順序為：B（菌體質量比）＞D（交聯(lián)時間）＞A（SA濃度）＞C（氯化鈣濃度）。當P＜0.01時，表明該因素對實驗結果影響極顯著；當0.01＜P＜0.05時，表明該因素對實驗結果影響為顯著；而P＞0.05為不顯著。由表4方差分析結果可知，菌體質量比對絮凝劑礦化度絮凝率影響呈極顯著；交聯(lián)時間影響顯著；而SA濃度和氯化鈣濃度則影響不顯著，比較P值和F值大小可得絮凝劑對礦化度絮凝率影響大小順序為：菌體質量比＞交聯(lián)時間＞SA濃度＞氯化鈣濃度，與直觀極差分析相吻合。綜合來看，對礦化度絮凝率最優(yōu)的絮凝劑的制作條件為：3%SA濃度、10%的菌體質量比、4%的氯化鈣濃度和10h的交聯(lián)時間。絮凝劑對礦化度絮凝率影響大小順序為：菌體質量比＞交聯(lián)時間＞SA濃度＞氯化鈣濃度。

表4 礦化度方差分析Table 4 Anova for salinity

表5 硬度正交試驗結果Table 5 Orthogonal results of hardness

表6 硬度方差分析Table 6 Anova for hardness

由表5同理可知，比較k值大小可以得出，A1B2C1D3為各個因素的最佳水平組合，即2%的SA濃度、8%的菌體質量比例、2%的氯化鈣濃度和10 h的交聯(lián)時間。比較極差R大小可知各因素對礦化度絮凝率影響順序為：A（SA濃度）＞B（菌體質量比）＞D（交聯(lián)時間）＞C（氯化鈣濃度）。由表6可知：氯化鈣濃度對絮凝劑硬度絮凝率影響不顯著，其余因素都呈極顯著，比較P值和F值大小可得絮凝劑對硬度絮凝率影響大小順序為：SA濃度＞菌體質量比＞交聯(lián)時間＞氯化鈣濃度。

對硬度絮凝率較好的最優(yōu)組合為：A1B2C1D3；而礦化度最優(yōu)組合為：A2B3C3D3，故對因素A（SA濃度）來說，可以選取A1A2二種情況。但是從極差與方差分析來看，A因素對硬度絮凝率影響較大，結合成本來考慮，應選A1即2.0%的海藻酸鈉。對于因素B來說，可取B2B3，但由于因素B對礦化度絮凝率影響較大，即選擇B310% 的菌體海藻酸鈉質量比作為最佳包埋比例。因素C對硬度礦化度影響都比較小，可得C1或者C3即2%、4% 的氯化鈣濃度都可以作為其最佳交聯(lián)劑濃度。結合處理率考慮，選擇C3即4%作為最佳氯化鈣濃度；同理可得交聯(lián)時間D3即10 h為其最佳交聯(lián)時間。綜合考慮各因素確定固定化小球最佳制作方案為：A1B3C3D3，即2.0% 的海藻酸鈉濃度、10% 的菌體包埋比、4.0% 氯化鈣和10 h的交聯(lián)時間，并且硬度礦化度處理率分別達到76.97% 和59.77%，礦化度從3 109 mg·L－1降到1 258 mg·L－1，硬度從2 856 mg·L－1降到了658 mg·L－1。

2.5 固定化啤酒酵母絮凝巖溶水的機理初探

一般情況下，微生物絮凝重金屬離子有以下幾種情況：胞外富集，表面吸附或者絡合，胞內富集。其中，表面的吸附和絡合對死、活微生物都存在，而胞外和胞內的大量富集則往往要求微生物具有活性［21］。在一個絮凝體系中，可能會存在上述一種或幾種過程。本實驗中啤酒酵母對巖溶水進行絮凝，其特點有攪拌快速、處理時間較短、絮凝率高，而一般微生物的胞內或胞外富集則用時較長且絮凝率低，表明主要發(fā)揮作用的是菌體表面吸附或絡合。根據(jù)郭彥涵對啤酒酵母絮凝劑的研究，本實驗所用的啤酒酵母包埋菌在處理巖溶水時還應該包括固定化劑（即高聚合化合物）對金屬離子吸附作用，而高聚合化合物對金屬離子的吸附作用主要是螯合架橋作用。因此，啤酒酵母固定化菌是在雙重作用下表現(xiàn)出良好的絮凝效果。

3 討論

合適的微生物固定化小球必須具備包埋操作簡單、成本低、對微生物無害、固定化細胞密度大、機械強度大、機制通透性和傳質性能好以及較好的物理強度和化學穩(wěn)定性等特點［22］。在本實驗發(fā)現(xiàn)，選擇海藻酸鈉作為包埋劑、氯化鈣作為交聯(lián)劑，不論從制作難易程度上還是制成球后的機械強度和傳質性能上，固定化小球均達到了一定的效果；固定化小球的傳質性能隨著的機械強度的增大而減小，在考慮機械強度的同時，也要考慮傳質性能，因為其很可能影響固定化小球吸附性能。綜合物理性質考慮，選取制作固定化小球的最優(yōu)區(qū)間為海藻酸鈉濃度2.0%－3.0%、菌體包埋比例為6%－10%、交聯(lián)時間為6～10 h、氯化鈣濃度2.0%－4.0%。這也與辛蘊甜、包木太［13－14］等對固定化小球的研究結果相似。

通過正交實驗分析我們得出，最佳固定化條件為：2.0% 的海藻酸鈉濃度、10% 的菌體包埋比、4.0% 氯化鈣和10 h的交聯(lián)時間，較郭彥涵［11］方法制作的固定化條件分別在菌體包埋比、氯化鈣濃度和交聯(lián)時間上都有所增加，機械強度也具有一定的提高，硬度礦化度處理率分別達到76.97% 和59.77%，分別提高了4.53%和3.68%，礦化度從3 109 mg·L－1降低到1 258 mg·L－1，，達到了《地下水質量標準》（GB／T14848-93）的Ⅳ類用水標準，硬度從2 856 mg·L－1降到了658 mg·L－1，接近《地下水質量標準》（GB／T14848-93）的Ⅳ類用水標準。通過正交實驗結果及其方差分析發(fā)現(xiàn)，四個因素影響礦化度和硬度處理率的主次順序并不相同。用極差和方差分析看出，菌體包埋比對硬度礦化度結果影響都比較顯著，這也驗證了郭彥涵［7］對微生物固定化小球的探究，即微生物固化菌發(fā)揮作用是兩方面共同作用的結果，一是具有活性的微生物對巖溶水中離子的吸附作用，另一方面固定化包埋劑也對水中的離子具有一定的吸附活性，微生物固定化小球是這兩方面因素共同作用的結果，所以兩者之間合適的比率必然會影響固定化小球的性能。通過分析我們選擇絮凝效果最好的10%的菌體包埋比作為固定化的最佳包埋比，也是機械強度能夠達到最好時的包埋比例。從極差分析可以看出，海藻酸鈉（SA）濃度對硬度處理率的影響要大于礦化度，所以在微生物固定化小球的制作過程中，如果著重降低硬度可以選擇低濃度即SA為2.0% 的濃度，礦化度則偏重選擇較高的SA濃度，交聯(lián)時間對硬度和礦化度影響則都不顯著。

4 結論

（1）制作微生物啤酒酵母固定化小球最優(yōu)物理性能區(qū)間為：海藻酸鈉質量分數(shù)2.0%－3.0%、菌體海藻酸鈉質量比6%－8%、交聯(lián)時間為6～10 h和氯化鈣質量分數(shù)2.0%－4.0%。

（2）通過正交實驗得出，海藻酸鈉濃度與菌體包埋比對絮凝劑絮凝率影響較大。以礦化度和硬度為指標可以得出制作固定化小球最優(yōu)固定化條件分別為：2%的海藻酸鈉濃度、10%的菌體包埋比、4%氯化鈣濃度和10 h的交聯(lián)時間，此時巖溶水的硬度礦化度絮凝率分別達到76.97% 和59.77%，巖溶水礦化度從3 109 mg·L－1降到1 258 mg·L－1，達到《地下水質量標準》（GB／T14848-93）的Ⅳ類用水標準；硬度從2 856 mg·L－1降到658 mg·L－1，接近《地下水質量標準》（GB／T14848-93）的Ⅳ類用水標準。

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