大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)微菌核缺陷突變體的篩選及其側端序列分析

汪 敏，趙 靜，李洪連，谷素靜，馬宗斌，焦 睿

(1.河南農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，河南鄭州450002;2.河南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，河南鄭州450002;3.河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河南鄭州450002)

棉花黃萎病(Verticillium wilt of cotton)是一種土傳性的維管束真菌病害。該病害不僅造成棉花嚴重減產(chǎn)，而且影響纖維長度和強度，是制約棉花優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的關鍵因素［1，2］。中國引起棉花黃萎病的病原菌主要為大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)［3－5］，該病菌寄主范圍極為廣泛，可侵染 200 多種植物，而且具有傳播途徑多、防治難度大的特點，常常造成嚴重的經(jīng)濟損失［5］。微菌核是大麗輪枝菌的主要存活結構和初侵染源，其形成數(shù)量與存活情況直接影響棉花黃萎病的發(fā)生程度［6，7］。微菌核是由大麗輪枝菌單根或多根菌絲經(jīng)分隔膨大、細胞壁增厚和多向芽殖形成的多細胞結構，內(nèi)外層細胞的細胞壁均較厚，積累有大量的黑色素，能抵抗不良環(huán)境條件，在土壤中可存活10～15 a。在適宜條件下，微菌核受寄主根系分泌物的刺激萌發(fā)后，從植株根部侵入，并在根內(nèi)定殖和擴展［7］。有研究表明，大麗輪枝菌的VDH1和VMK1基因與微菌核的形成密切相關［8－10］。但目前有關其微菌核形成相關基因的研究報道不多，微菌核形的分子機理尚不清楚。本研究利用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT)獲得大麗輪枝菌T-DNA插入突變體，從中篩選TDNA插入微菌核形成能力喪失(或減弱)的突變體，并利用高效 TAIL-PCR方法擴增其側端序列，以期為大麗輪枝菌微菌核形成的相關基因克隆與分子機理研究等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及棉花品種 用于農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化的大麗輪枝菌菌株為落葉型強致病力菌株FGH2，由河南農(nóng)業(yè)大學植物病理實驗室分離并保存［11］。大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化載體pATMT1(由pCAMBIA 1300改造而成)、農(nóng)桿菌菌株 AGL-1均由河南農(nóng)業(yè)大學植物病理實驗室保存。大麗輪枝菌致病力測定所用的棉花品種為感黃萎病品種銀山1號。

1.1.2 主要試劑和儀器 Ex Taq酶、dNTP和限制性內(nèi)切酶、pMD19-T Vector、DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司，乙酰丁香酮、卡那霉素(Kan)購自美國Sigma公司，潮霉素B購自德國Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 大麗輪枝菌T-DNA插入突變體庫的構建利用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化構建大麗輪枝菌T-DNA插入突變體庫，參照 MULLINS等［12］的方法，并略有改進［11，13］。采用凍融法將構建的載體 pATMT1轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌AGL-1中，將誘導的農(nóng)桿菌菌液與大麗輪枝菌分生孢子懸浮液涂在濾膜上共培養(yǎng)，5～7 d后挑取陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至含有潮霉素的PDA平板上，進行2次篩選，對陽性轉(zhuǎn)化子單孢分離并保存，獲得大麗輪枝菌T-DNA插入突變體庫。

1.2.2 大麗輪枝菌微菌核形成缺陷的T-DNA突變體篩選 將待測的T-DNA插入突變體和野生菌FGH2分別接種于PDA培養(yǎng)基平板上，暗培養(yǎng)10 d后，用直徑0.7 cm的打孔器在菌落的邊緣處選取菌餅，置于PDA平板中心，每皿1塊，暗培養(yǎng)15 d后對其進行菌落形態(tài)的觀察和分類。

根據(jù)突變體的菌落形態(tài)和黑色微菌核的有無將其分為菌核型、菌絲型和中間型3種類型［14］。分類標準如下:菌落表面為白色氣生菌絲團、基質(zhì)內(nèi)布滿黑色微菌核的為菌核型;菌落上氣生菌絲少、產(chǎn)生少量黑色微菌核的為中間型;菌落上氣生菌絲發(fā)達、白色、絨毛狀，培養(yǎng)15 d后仍未產(chǎn)生黑色微菌核的為菌絲型。

1.2.3 大麗輪枝菌T-DNA插入突變體的致病力測定 大麗輪枝菌T-DNA插入突變體的致病力測定采用分生孢子浸根移栽法［11］。將供試的銀山1號棉種脫絨催芽，在溫室中進行育苗。收集待測的大麗輪枝菌T-DNA插入突變體和大麗輪枝菌FGH2分生孢子懸浮液，調(diào)節(jié)其體積分數(shù)為1.0×107個·mL－1。待棉苗長至 2片真葉時，挑選根系生長良好的植株進行浸根接種后，移栽至裝有無菌土的紙杯中，25℃下生長。每個菌株接種15棵棉苗，3次重復。30 d左右時接種30 d后，按照石磊巖等棉花苗期分級標準進行病情調(diào)查［15］。

1.2.4 大麗輪枝菌微菌核形成缺陷的T-DNA插入突變體側端序列擴增 挑選大麗輪枝菌T-DNA插入菌絲型突變體和大麗輪枝菌FGH2于Czapek液體培養(yǎng)基中，150 r·min－1培養(yǎng) 6 d，收集菌絲用于DNA提取。采用CTAB法提取菌株的基因組DNA。采用TAIL-PCR法擴增突變體T-DNA插入位點側端序列，試驗參照 LIU等［16］的方法進行。所用隨機引物序列和特異性引物序列見表1。將初始PCR產(chǎn)物稀釋20倍作為第2輪PCR的模板，第2輪PCR產(chǎn)物稀釋10倍作為第3輪PCR的模板。

表1 hiTAIL-PCR擴增引物Table 1 Primers list used for hiTAIL-PCR

1.2.5 PCR產(chǎn)物連接、測序和序列分析 將第3輪PCR產(chǎn)物膠回收后與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，挑選陽性克隆進行測序。獲得的突變體T-DNA插入位點右側序列與美國 BROAD 研 究 網(wǎng) 址 (http://www.broad.mit.edu/)公布的大麗輪枝菌VDLs.17和黑白輪枝菌(V.albo-atrum)VaMs.102的基因組序列進行比對分析。

2 結果與分析

2.1 農(nóng)桿菌介導大麗輪枝菌的遺傳轉(zhuǎn)化

利用農(nóng)桿菌介導構建大麗輪枝菌T-DNA插入突變體庫。將誘導的農(nóng)桿菌菌液與大麗輪枝菌分生孢子懸浮液涂在濾膜上共培養(yǎng)48 h，將濾膜置于含50 mg·L－1潮霉素抗性的PDA培養(yǎng)基生長上。將選擇培養(yǎng)基上長出的陽性轉(zhuǎn)化子再轉(zhuǎn)接到含70 mg·L－1潮霉素PDA培養(yǎng)基上進行2次篩選。對陽性轉(zhuǎn)化子進行單孢分離和保存，共獲得了270個大麗輪枝菌T-DNA插入轉(zhuǎn)化子。

2.2 大麗輪枝菌微菌核形成能力喪失或減弱的T-DNA插入突變體的篩選

將獲得的270個T-DNA插入突變體和野生型大麗輪枝菌FGH2活化后，接于PDA培養(yǎng)基中，25℃下生長15 d，測量菌落直徑并觀察微菌核形成情況。野生型大麗輪枝菌FGH2在PDA培養(yǎng)基上25℃恒溫培養(yǎng)時產(chǎn)生大量微菌核，氣生菌絲較為發(fā)達。突變體11-2、26-2、229-2-1、971-1 均為菌絲型，菌落氣生菌絲濃密，且不產(chǎn)生微菌核(圖1)。

圖1 野生型FGH2和突變體在PDA平板上培養(yǎng)15d后菌落形態(tài)(正、反面)Fig.1 The colony morphology of FGH2and mutants grown on PDA plate for 15 days(the front and the back)

2.3 大麗輪枝菌T-DNA插入突變體的致病力測定

對270個大麗輪枝菌T-DNA插入突變體和野生型菌株進行孢子懸浮液浸根接種，測定突變體與野生型的致病性差異。結果表明，大麗輪枝菌FGH2接種感病品種銀山1號14 d左右葉片開始發(fā)病，30 d左右棉苗表現(xiàn)為落葉、死亡，維管束變褐，病情指數(shù)達95.21。大多數(shù)大麗輪枝菌T-DNA插入突變體的致病力與野生型無顯著性差異(圖2)。

圖2 大麗輪枝菌突變體接種棉花銀山1號30 d后發(fā)病情況Fig.2 Pathogenicity assays of V.dahliae FGH2 and four microsclerotia defective mutants on cotton Yinshan 1 post inoculation 30 days

2.4 大麗輪枝菌微菌核形成能力喪失T-DNA插入突變體側端序列分析

采用高效TAIL-PCR方法對大麗輪枝菌4個菌絲型T-DNA插入突變體的插入位點側端序列進行擴增，將第二輪和第三輪的擴增的PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳圖譜分析，對第二、三輪的條帶大小做比較，理論上第三輪的條帶比第二輪小約70 bp，為本研究所需要的特異性條帶，將這4個突變體的第三輪全部產(chǎn)物進行凝膠電泳，進行切膠回收，得到突變體 11-2(A)、26-2(B)、229-2-1(C)和 971-1(D)含量較高的4條特異性條帶(圖3)，獲得目標片段片段大小分別約為 600、350、300、500 bp。

圖3 大麗輪枝菌突變體T-DNA側翼序列hiTAILPCR第二步和第三步產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis patterns of V.dahliae mutants T-DNA flanking sequence secondary and tertiary hiTAIL-PCR products.

對目標片段回收后與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌克隆，挑選陽性轉(zhuǎn)化子送生物公司進行DNA測序。將獲得的大麗輪枝菌突變體T-DNA側端序列與已在網(wǎng)上公布的大麗輪枝菌VDLs.17和黑白輪枝菌VaMs.102進行比對，獲得突變體T-DNA在大麗輪枝菌基因組插入位點的信息(表2)。突變體229-2-1 T-DNA插入位點位于基因VDAG_08333.1編碼區(qū)，突變體11-2T-DNA插入位點位于基因VDAG_07013.1啟動子區(qū)969 bp，26-2 T-DNA插入位點位于基因VDAG_02793.1啟動子區(qū)716 bp，而突變體971-1 T-DNA插入位點位于 2個基因 VDAG_05438.1和 VDAG_05439.1 之間。

表2 T-DNA側翼序列與 VdLs.17基因組序列比對結果Table 2 BLAST results of T-DNAflanking sequences hit to VdLs.17 genome

3 結論與討論

隨著多種植物病原真菌全基因序列的完成，利用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化技術構建覆蓋全基因組的T-DNA插入突變體庫，從全基因組水平研究植物病原真菌重要功能基因，進而鑒定關鍵的致病基因，已成為重要研究方向和研究方法［17－20］。本研究利用ATMT技術構建大麗輪枝菌T-DNA插入突變體庫，獲得了270個突變體，通過菌落形態(tài)觀察，篩選出4個菌絲型突變體，氣生菌絲發(fā)達、白色絨毛狀，在長期培養(yǎng)和多代轉(zhuǎn)接后，仍不產(chǎn)生黑色微菌核，并得到了其側端序列。其中突變體229-2-1 T-DNA插入位點位于基因VDAG_08333.1編碼區(qū)，突變體11-2，26-2 T-DNA插入位點分別位于基因VDAG_07013.1和VDAG_02793.1的啟動子區(qū)，而突變體971-1 T-DNA插入位點位于VDAG_05438.1和VDAG_05439.1 2個基因之間。推測這4個菌絲型突變體的表型變異可能由于T-DNA插入突變引起，為進一步研究這些微菌核形成相關基因奠定了基礎。

大麗輪枝菌產(chǎn)生由黑色素和菌絲細胞構成的微菌核，在遇到不利環(huán)境時黑色素顆粒可使微菌核進入休眠狀態(tài)，以抵抗不同的環(huán)境壓力條件，有利于微菌核的長期存活。已有研究表明，黑色素為稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)致病所必需的，稻瘟病菌黑色素形成喪失的突變體不能形成有功能的附著胞，從而喪失對水稻的致病性［21］。目前尚無研究表明，黑色素與大麗輪枝菌微菌核的形成與致病性的關系。本研究獲得的4個大麗輪枝菌菌絲型突變體，黑色素形成喪失且不產(chǎn)生微菌核，但這4個菌絲型突變體的致病力與大麗輪枝菌FGH2并無顯著性差異。由于本研究獲得返微菌核缺失突變體偏少，有必要進一步利用已建立的突變體庫，大量篩選微菌核形成能力減弱和喪失的突變體，在獲得其側端序列后，采用目標基因敲除和互補等手段，大規(guī)模鑒定微菌核形成相關基因。在此基礎上，深入研究大麗輪枝菌微菌核形成的分子機理，探討菌微菌核形成、黑色素與致病性的關系等。

［1］ ERDOGAN O，SEZENER V，OZBEK N，et al.The effects ofVerticillium wilt(Verticillium dahliae Kleb.)on cotton yield and fiber quality［J］.Asian Journal of Plant Sciences，2006，5(5):867 －870.

［2］ FRADIN E F，THOMMA B H.Physiology and molecular aspects of Verticillium wilt diseases caused by V.dahliae and V.alboatrum［J］.Molecular Plant Pathology，2006，7(2):71 －86.

［3］ 汪 敏，焦 睿，邢小萍，等.棉花黃萎病菌致病的分子機理［J］.棉花學報，2011，23(3):272 －278.

［4］ 朱荷琴，馮自力，李志芳，等.分離自棉花的輪枝菌“種”的鑒定［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2013，46(10):2032－2040.

［5］ 朱荷琴，馮自力，尹志新，等.我國棉花黃萎病菌致病力分化及ISSR指紋分析［J］.植物病理學報，2012，42(3):225－235.

［6］ WILHELM S.Longevity of Verticillium wilt fungus in the laboratory and field［J］.Phytopathology，1955，45:180－181.

［7］ 李雪鈴，張?zhí)煊?，王立?棉黃萎病菌微菌核研究進展［J］.植物保護，1997，23(5)35 －37.

［8］ RAUYAREE P，OSPINA-GIRALDO M D，KANG S，et al.Mutations in VMK1，a mitogen-activated protein kinase gene，affect microsclerotia formation and pathogenicity in Verticillium dahliae［J］.Current genetics，2005，48(2):109 －116.

［9］ KLIMES A，DOBINSON K F.A hydrophobin gene，VDH1，is involved in microsclerotial development and spore viability in the plant pathogen Verticillium dahliae［J］.Fungal Genetics and Biology，2006，43:283－294.

［10］ KLIMES A，AMYOAE S，GRANT S，et al.Microsclerotia development in Verticillium dahliae:regulation and differential expression of the hydrophobin gene VDH1［J］.Fungal Genetics Biology，2008，45:1525 －1532.

［11］谷素靜，汪 敏，桑 茜，等.棉花黃萎病菌T-DNA插入突變體庫的構建及致病缺陷突變體篩選［J］.河南農(nóng)業(yè)科學，2014，43(1):69 －73，83.

［12］ MULLINS E D，CHEN X，ROMAINE P，et al.Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Fusarium oxyporum:an efficient tool for insertional mutagenesis and genetransfer［J］.Phytopathology，2001，91:173－180.

［13］桑 茜，袁虹霞，王振躍，等.河南省不同地區(qū)棉花黃萎病菌分離物致病性及其毒素致萎活性測定［J］.棉花學報，2010，22(4):333 －338.

［14］宋曉軒，朱荷琴，郭金城.棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae Kleb.)安陽菌系致病力分化研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，1997，30(1):13 －18.

［15］石磊巖，王 波，文 學.我國棉花黃萎病菌類型分化及培養(yǎng)特性研究［J］.植物保護學報，1993，20(3):247－252.

［16］ LIU Y G，CHEN Y L.High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences［J］.BioTechniques，2007，43(5):649 － 656.

［17］ BETTS M F，TUCKER S L，GALADIMA N，et al.Development of a high throughput transformation system for insertional mutagenesis in Magnaporthe oryzae［J］.Fungal Genetics and Biology，2007，44(10):1035 －1049.

［18］ JEON J，PARK S Y，CHI M H，et al.Genome-wide functional analysis of pathogenicity genes in the rice blast fungus［J］.Nature Genetics，2007，39(4):561 －565.

［19］徐榮旗，汪佳妮，陳捷胤，等.棉花黃萎病菌T-DNA插入突變體表型特征和側翼序列分析［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，2010，43(3):489 －496.

［20］高峰，彭 姍，彭曉玲，等.棉花黃萎病菌插入突變體庫的構建及致病相關基因DVK1的克隆與鑒定［J］.棉花學報，2011，23(1):64 －68.

［21］ HOWARD R J，VALENT B.Breaking and entering:host penetration by the fungal rice blast pathogen Magnaporthe grisea［J］.Annual Review of Microbiology，1996，50:491－512.