楓香樹DNA提取及SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

李芳芳， 楊少宗， 柳新紅， 李海波， 王麗玲， 李永華

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南 鄭州 450002；2.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023)

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楓香樹DNA提取及SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

李芳芳1，2， 楊少宗2， 柳新紅2， 李海波2， 王麗玲2， 李永華1

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南 鄭州 450002；2.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023)

通過不同處理的楓香樹葉片及基因組DNA提取方法的對比，并采用L16(45)正交試驗設(shè)計，對影響SRAP-PCR反應(yīng)體系的Mg2+，dNTPs，引物濃度及Taq DNA聚合酶和模板DNA用量等5個因素進行優(yōu)化，確立楓香樹SRAP-PCR最佳反應(yīng)體系。結(jié)果表明，改良CTAB法提取楓香樹基因組DNA的產(chǎn)率和純度均可滿足下游試驗需要。SRAP-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系為：總體積20 μL，含 1×PCR Buffer，1.5 mmol·L-1Mg2+，0.16 mmol·L-1dNTPs，0.5 μmol·L-1引物，0.9 U Taq DNA聚合酶和40 ng模板DNA。各因素對反應(yīng)結(jié)果的影響大小順序為Taq DNA聚合酶量>dNTPs濃度>Mg2+濃度>模板DNA用量>引物濃度。運用優(yōu)化的SRAP-PCR反應(yīng)體系對10個不同居群的楓香樹基因組DNA擴增檢測，結(jié)果均能獲得穩(wěn)定性高、多態(tài)性豐富和重復(fù)性好的條帶圖譜。

楓香樹;DNA提取;SRAP-PCR;正交試驗設(shè)計;反應(yīng)體系優(yōu)化

楓香樹(LiquidambarformosanaHance.)系金縷梅科(Hamamelidaceae)楓香樹屬落葉喬木，分布于秦嶺淮河以南地區(qū)，跨北熱帶和南、中、北亞熱帶等4個氣候帶，是中國重要的鄉(xiāng)土闊葉速生樹種，集觀賞、藥用和材用等多種價值于一身。多年來,對楓香樹的研究主要集中在無性繁殖技術(shù)[1-3]、人工林和混交林技術(shù)[4-6]、葉片的葉色分析[7]、種子生物學(xué)特性[8, 9]、楓香樹林的生理生化研究及園林應(yīng)用[10]等方面，而對其分子水平的遺傳多樣性研究較少，目前，僅見楓香樹群體細(xì)胞學(xué)水平的同工酶[11]和特定群體的ISSR分析[12, 13]等。相關(guān)序列擴增多態(tài)性(Sequence Related Amplified Polymorphism，SRAP) 標(biāo)記是2001年發(fā)展的一種新型分子標(biāo)記技術(shù)[14]，具有簡便、快捷、共顯性高、重復(fù)性好、易于分離條帶及測序等優(yōu)點，已成功用于多種植物，如棉花[15, 16]、桃和油桃[17]、西葫蘆[18]、草坪草[19-21]、菊花[22]、一串紅[23]、黃瓜[24]及槭屬[25]和安息香屬[26, 27]等，均顯示其可作為遺傳多樣性評價、品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建和研究系統(tǒng)發(fā)生的有效工具[28]。該標(biāo)記在金縷梅科的研究則未見報道。SRAP標(biāo)記作為一種有效的分子標(biāo)記技術(shù)，其重要前提條件是研究物種的基因組DNA高質(zhì)量提取方法及其反應(yīng)體系的優(yōu)化和確立。本研究在傳統(tǒng)小量法提取植物基因組DNA的CTAB方法基礎(chǔ)上加以改良和優(yōu)化，建立適合楓香樹基因組DNA的提取方法：運用正交試驗設(shè)計，對影響楓香樹SRAP-PCR體系的Taq DNA聚合酶，Mg2+，dNTPs，引物和模板DNA用量等5種因素進行優(yōu)化試驗，獲得適合楓香樹SRAP-PCR反應(yīng)的最優(yōu)體系，并對此優(yōu)化體系進行檢測驗證，以期為楓香樹不同居群的遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和分子育種等領(lǐng)域研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 分別于2013年9月和2014年3月采集不同居群楓香樹生長健壯、無病蟲害的幼葉和老葉，置于保鮮袋中，于超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑設(shè)備 為Taq DNA聚合酶, Mg2+, dNTPs和10×Buffer等,均購自TaKaRa公司，其他試劑均為分析純；引物合成由上海生物工程有限公司完成；主要儀器有Nano Drop 2000C微量核酸蛋白測定儀、ABI Veriti 96孔多重控溫梯度PCR儀、BIO-RAD水平電泳系統(tǒng)及Syngene G: BOX凝膠成像系統(tǒng)等。

1.2 方法

1.2.1 楓香樹基因組DNA的提取與檢測 采用十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)和試劑盒等方法[29-31]，并改進試劑質(zhì)量濃度和處理方法，用ddH2O溶解稀釋至20 ng·μL-1，25 ℃保存?zhèn)溆?。純化后分別用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和微量核酸蛋白測定儀對DNA進行定性和定量檢測(表1)。

表1 不同提取方法的楓香樹基因組DNA純度和含量的測定結(jié)果Table 1 Determination of purity and content of genomic DNA of Liquidambar formosana by different methods

注：A.新鮮葉片；B.硅膠干燥處理葉片。

Note: A. Fresh leaves； B. Dried leaves saved in silica.

1.2.2 SRAP-PCR 反應(yīng)體系的正交試驗優(yōu)化與檢測根據(jù)蓋鈞鎰等[32]的方法對Taq DNA聚合酶，Mg2+濃度，dNTPs濃度，SRAP引物質(zhì)量濃度，模板DNA用量等5因素在4個水平上設(shè)計L16(45) 正交試驗方案(表2)。

表2 楓香樹SRAP-PCR反應(yīng)因素水平L16(45)正交設(shè)計Table 2 Orthogonal design for SRAP-PCR optimization on Liquidambar formosana

其中，Taq DNA聚合酶用量分別為0.5、0.7、0.9、1.1 U；dNTPs濃度分別為0.1、0.12、0.14、0.16 mmol·L-1；Mg2+濃度分別為1、1.5、2、2.5 mmol·L-1；SRAP引物濃度分別為0.3、0.4、0.5、0.6 μmol·L-1；模板DNA含量分別為40、60、80、100 ng，反應(yīng)總體積為20 μL。篩選SRAP引物Me3-Em11組合進行試驗驗證，3次重復(fù)。SRAP-PCR擴增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 sec，35 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，5次循環(huán)；94 ℃變性30 s，50 ℃ 變性30 s，72 ℃ 延伸1 min，30次循環(huán)；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。擴增產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠(含0.05%溴化乙錠)電泳檢測，凝膠成像分析結(jié)果并拍照。

1.2.3 SRAP-PCR反應(yīng)體系的穩(wěn)定性檢測 隨機選擇不同居群楓香樹10個單株的基因組DNA為模板，篩選SRAP引物組合(Me3-Em11, Me8-Em8)，按照上述最優(yōu)SRAP-PCR反應(yīng)體系擴增檢測，對優(yōu)化確立的楓香樹SRAP-PCR反應(yīng)體系的穩(wěn)定性進行檢驗。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理 采用正交直觀分析法和新復(fù)極差法對所得數(shù)據(jù)進行處理分析[32, 33]。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種方法提取楓香樹基因組DNA的純度和產(chǎn)率

不同提取方法、葉片發(fā)育時期和處理保存方式所提取的DNA質(zhì)量和產(chǎn)率不同(表2)。由表2可知，對不同處理的嫩葉，試劑盒法所得DNA的OD260/OD280為2.04和2.08，改良CTAB法為1.84和1.87，2者OD260/OD230都接近于2，電泳條帶明亮清晰，無明顯彌散拖尾現(xiàn)象(圖1)。

1,4,5,6：硅膠干燥處理和新鮮老葉(試劑盒法和改良CTAB法)；2,3,7,8：硅膠干燥處理和新鮮嫩葉(試劑盒法和改良CTAB法)。

1,4,5,6: Dried old leaves saved in silica and fresh old leaves (Isolation kit method and modified CTAB method); 2,3,7,8: Dried tender leaves saved in silica and fresh tender leaves (Isolation kit method and modified CTAB method).

圖1 不同提取方法的楓香樹基因組DNA電泳檢測圖
Fig.1 Electrophoresis map ofLiquidambarformosanagenomic DNA extracted by different methods

2種方法提取的楓香樹嫩葉DNA在含量和純度上相差不大，均能滿足后續(xù)PCR擴增要求。而對于老葉，改良CTAB法所得DNA的OD260/OD280為1.92和1.82，試劑盒法為1.64和1.45，結(jié)合OD260/OD230值分析表明,改良CTAB法提取老葉基因組DNA的產(chǎn)率和純度均較試劑盒法高。后者不僅含量較低，且含有其他雜質(zhì)，DNA降解較嚴(yán)重，將對下游PCR反應(yīng)和其他DNA分子操作產(chǎn)生不利影響。

2.2 SRAP-PCR擴增體系的確立

2.2.1 正交試驗結(jié)果分析 參照劉萌芽等[33]的方法，對楓香樹基因組DNA的SRAP-PCR反應(yīng)體系中Mg2+濃度, dNTPs濃度,引物濃度,Taq DNA聚合酶和模板DNA用量等設(shè)計5個因素4個水平組合的正交試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析(表2)。R值結(jié)果表明，對楓香樹基因組DNA的SRAP-PCR反應(yīng)體系影響程度由大到小依次為：Taq DNA聚合酶，dNTPs濃度，Mg2+濃度，模板DNA用量和引物濃度；從K值來看，Taq DNA聚合酶用量為0.9 U，Mg2+濃度為1.5 mmol·L-1，dNTPs濃度為0.16 mmol·L-1，引物濃度在0.4～0.5 μmol·L-1范圍都較好，模板DNA用量在80 ng最好。根據(jù)3次正交試驗重復(fù)結(jié)果，初步確立楓香樹基因組DNA的SRAP-PCR擴增的適宜反應(yīng)體系應(yīng)為：0.9 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol·L-1Mg2+、0.14 mmol·L-1dNTPs、80 ng模板DNA及0.4～0.5 μmol·L-1引物濃度。

按照表2正交試驗設(shè)計的16個反應(yīng)體系，隨機選用Me3-Em11引物進行SRAP-PCR反應(yīng)(圖2)，結(jié)果表明，采用不同濃度的Mg2+,dNTPs,引物及不同用量的Taq DNA聚合酶和模板DNA的16個反應(yīng)體系，其擴增結(jié)果存在明顯差異。第1、14、15和16號反應(yīng)體系的擴增效果較差，條帶弱且多態(tài)性也較低；第2、3、4、6、7、8、9、13號反應(yīng)體系多態(tài)性好，但條帶均較弱；第5、10、11、12號4個反應(yīng)體系的擴增結(jié)果不僅條帶清晰且多態(tài)性豐富。根據(jù)遺傳多樣性分析要求初步選定10號反應(yīng)體系：0.9 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol·L-1Mg2+、0.16 mmol·L-1dNTPs、 0.5 μmol·L-1引物及40 ng模板DNA。

1-16：不同的SRAP-PCR反應(yīng)體系; M：DL2000 DNA marker.下同。

1-16：SRAP-PCR amplification patterns in different reaction systems);

M：DL2000 DNA marker. The same as below.

圖2 不同反應(yīng)體系中楓香樹SRAP-PCR擴增圖譜(引物組合Me3-Em11)
Fig.2 SRAP-PCR amplification patterns in different reaction systems (primer combination Me3-Em11)

2.2.2 SRAP-PCR 擴增體系的確立及引物篩選

由表2，圖2知，考慮擴增效果及試驗成本，將正交試驗的模板用量由80 ng調(diào)為40 ng，而將10號反應(yīng)體系的引物濃度由0.5 μmol·L-1調(diào)為0.4 μmol·L-1。最終確定楓香樹基因組DNA的SRAP-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系為總體積20 μL中含有1×PCR Buffer, 1.5 mmol·L-1Mg2+, 0.16 mmol·L-1dNTP, 0.5 μmol·L-1引物, 0.9 UTaq DNA聚合酶和40 ng模板DNA。在該體系下隨機選用楓香樹單株基因組DNA進行SRAP引物篩選，按照多態(tài)性豐富、條帶清晰和重復(fù)性好的原則，在96對SRAP引物組合中篩選出18對條帶清晰、穩(wěn)定且多態(tài)性豐富的引物，作為楓香樹基因組的擴增引物組合(圖3，表3)。

圖3 篩選出的18對SRAP引物Fig.3 18 pairs of screened SRAP primers

表3 SRAP引物及序列Table 3 Primer sequence(5′-3′)applied for SRAP-PCR

2.3 SRAP-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定性分析

運用上述最優(yōu)反應(yīng)體系，隨機選擇SRAP引物組合Me3-Em11和Me8-Em8，在不同居群楓香樹隨機選擇10個單株基因組DNA進行SRAP-PCR擴增(圖4)。結(jié)果顯示,隨機選擇的引物對隨機選擇的基因組DNA均可擴增出多態(tài)性豐富且條帶清晰的DNA片段。說明該SRAP-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定可靠，適用于楓香樹基因組DNA的SRAP-PCR擴增反應(yīng)。

圖4 楓香樹基因組DNA 的SRAP-PCR擴增圖譜Fig.4 SRAP-PCR amplificaion pattern of genomic DNA from L. formosana

3 結(jié)論和討論

改良的CTAB法可獲得含量、純度和完整性較高的楓香樹基因組DNA，且實用性和性價比較高。楓香樹葉片中含有大量的萜類、黃酮類、苯丙素類、多糖類、酚酸類化合物及其苷類等次生代謝產(chǎn)物，并且這些物質(zhì)的含量隨葉片成熟逐漸增多[7, 34-37]。而這些物質(zhì)易與DNA結(jié)合形成極難溶解的黏稠狀物質(zhì)，并抑制PCR反應(yīng)過程中Taq DNA酶的活性，使擴增條帶模糊甚至消失，嚴(yán)重影響PCR的反應(yīng)效果。KIM等[38]研究表明,使用抗氧化劑PVP可以提高DNA的提取產(chǎn)率，陳大明等[30]利用細(xì)胞區(qū)室化多酚類物質(zhì)來排除干擾也獲得了較好的基因組DNA。改良CTAB法可以采用針對性的手段和步驟去除楓香樹基因組DNA雜質(zhì)，更適合楓香樹葉片基因組DNA的提取，尤其是對于硅膠快速干燥處理的楓香樹老葉來說，無論DNA的產(chǎn)率還是電泳結(jié)果都明顯優(yōu)于試劑盒法，這對于特定時間內(nèi)大規(guī)模調(diào)查和采樣來研究DNA分子水平上的楓香樹群體遺傳多樣性來說，具有節(jié)省時間和經(jīng)費的優(yōu)勢。楓香樹基因組DNA的SRAP-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系擴增結(jié)果顯示其具有多態(tài)性豐富、條帶清晰、重復(fù)性和穩(wěn)定性好等特點。該標(biāo)記克服了RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 重復(fù)性差、SSR (Simple Sequence Repeat) 位點較少和AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) 成本高等缺點。SRAP-PCR反應(yīng)體系易受反應(yīng)條件和擴增程序變化及物種的影響。對影響楓香樹SRAP-PCR反應(yīng)的5因素4水平的正交試驗結(jié)果表明，Taq DNA聚合酶的用量直接影響SRAP-PCR擴增結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性：用量過低將降低反應(yīng)的靈敏度，減少擴增量；用量過多則會降低反應(yīng)的特異性，易出現(xiàn)非特異性擴增，且試驗成本增高。dNTPs質(zhì)量濃度是影響PCR反應(yīng)的另一關(guān)鍵因素，該結(jié)果與樊洪泓等[39]對石斛屬SRAP-PCR擴增體系的影響因素實驗結(jié)果相一致，但與楚愛香[40]和任緒瑞等[41]研究結(jié)果不同，這可能是不同物種對SRAP-PCR反應(yīng)體系中的影響因素敏感性差異所致。此外，多數(shù)研究結(jié)果表明引物濃度對擴增結(jié)果的影響很小[42]，也與本研究結(jié)果一致。由此可知，不同物種的基因組結(jié)構(gòu)和組成有其自身的特點，從而對PCR擴增體系的敏感性有所差異，既有相似的影響因素，也有各自特殊的反應(yīng)條件。因此，應(yīng)對不同的物種設(shè)計不同的PCR反應(yīng)條件。

以不同居群楓香樹的10個隨機選擇個體基因組DNA為材料，采用正交試驗設(shè)計建立適宜于楓香樹SRAP-PCR擴增的最優(yōu)反應(yīng)體系，并分別利用2對SRAP引物組合進行穩(wěn)定性檢測。結(jié)果表明，本試驗建立的楓香樹SRAP-PCR反應(yīng)體系穩(wěn)定，可靠，可進一步應(yīng)用于楓香樹群體遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建和分子育種等方面研究。

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(責(zé)任編輯：梁保松)

Genomic DNA extraction and establishment of the optimal SRAP-PCR reaction system forLiquidambarformosanaHance.

LI Fangfang1,2, YANG Shaozong2, LIU Xinhong2, LI haibo2, WANG liling2, LI Yonghua1

(1.Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2.Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023, China)

In order to investigate theL.formosanagenomic DNA extraction methods and the optimal SRAP-PCR reaction system, two kinds of genomic DNA extraction methods for different materials were contrasted. By the orthogonal experiment design Ll6(45), five factors including Mg2+concentration, dNTPs concentration, primer concentration, Taq DNA polymerase and template DNA amount in SRAP-PCR reaction system were optimized, and the optimal SRAP-PCR reaction system suitable for genomic DNA extracted fromL.formosanawas also established. The results showed that the modified CTAB method was better than the isolation kit one, and the optimized SRAP-PCR reaction system was as follows: total volume 20 μL, containing 1×PCR Buffer, 1.5 mmol·L-1Mg2+, 0.16 mmol·L-1dNTPs, 0.9 U Taq DNA polymerase, 0.5 μmol·L-1primer, 40 ng template DNA. The effects of the five factors on SRAP-PCR amplification are different, in which, Taq DNA polymerase was the greatest， but that of template DNA amount was the least． The optimal SRAP-PCR reaction system is tested by means of ten random selected genomic DNA ofL.formosana., and the amplification pattern with rich polymorphism and clear band was obtained.

LiquidambarformosanaHance; genomic DNA extraction; SRAP-PCR; orthogonal experiment design; optimization and test of reaction system

1000-2340(2015)01-0046-06

2014-06-10

林業(yè)公益性行業(yè)科研項目(201404312)；浙江省重大科技項目(2012C12908-14)；浙江省重大科技項目(2012C12909-21)

李芳芳(1987-)，女，河南尉氏縣人，碩士研究生，從事觀賞園藝植物研究。

李永華(1976-)，男，河南周口人，副教授，博士。

S 722.3

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