宮頸鱗癌組織HPV16型E6與P73蛋白表達及其關系

李敏，王蓁，劉磊，董嫻寧，王冠群，李莎

(青島大學附屬醫(yī)院，山東 青島 266003； 1 婦科； 2 產(chǎn)科； 3 病理科)

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宮頸鱗癌組織HPV16型E6與P73蛋白表達及其關系

李敏1，王蓁1，劉磊2，董嫻寧3，王冠群3，李莎1

(青島大學附屬醫(yī)院，山東 青島 266003； 1 婦科； 2 產(chǎn)科； 3 病理科)

目的 研究人乳頭瘤病毒(HPV)16型E6蛋白(HPV16-E6蛋白)與P73蛋白在宮頸鱗癌組織中的表達及兩者的相關性，探討HPV16-E6蛋白、P73蛋白在宮頸腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。方法 選取正常宮頸組織10例、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(CIN)組織22例、宮頸鱗癌組織38例，采用PV-6000二步法檢測3種組織中HPV16-E6、P73蛋白的表達情況,分析兩者與相關臨床病理參數(shù)間的關系及兩者之間的相關性。結果 鱗癌組HPV16-E6蛋白的表達明顯高于正常組、CIN組，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=21.703，P<0.05)。鱗癌組P73蛋白表達明顯低于正常組、CIN組，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=15.461，P<0.05)。宮頸鱗癌組織中HPV16-E6蛋白陽性表達率與組織學分級顯著相關(χ2=9.011，P<0.05)；與發(fā)病年齡、臨床分期、淋巴結轉(zhuǎn)移及腫瘤大小無關(P>0.05)。HPV16-E6蛋白與P73蛋白的陽性表達呈負相關(rs=-0.301,P<0.05)。結論 HPV16-E6蛋白表達升高可能與宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展相關。隨著宮頸腫瘤發(fā)展程度的增高,P73蛋白的表達逐漸降低,提示p73基因可能是宮頸腫瘤的抑癌基因。

宮頸腫瘤；宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變；人乳頭狀瘤病毒16；免疫組織化學

宮頸癌是常見的女性生殖道惡性腫瘤之一，其中鱗癌是最主要的類型，占80%～85%[1]。宮頸癌的主要致病因素包括人乳頭瘤病毒(HPV) 感染, 尤以HPV16型(HPV16)常見。而高危型HPV16-E6蛋白在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。HPV16-E6蛋白通過E6-AP的介導，結合并降解腫瘤抑制蛋白P53蛋白，最終導致腫瘤發(fā)生。近來研究顯示，p73 基因是p53 基因家族的新成員,具有與p53基因相似的結構與功能，能轉(zhuǎn)錄性激活 p53 的靶基因并以 p53 相似的方式誘導細胞凋亡。但P73蛋白與HPV16-E6 蛋白之間是否有作用、兩者的相關性如何，以及其在 E6 致癌機制中的作用還有待于進一步研究探討。因此，本研究檢測了宮頸鱗癌組織中HPV16-E6蛋白及P73 蛋白的表達，旨在探討兩者的相關性及在宮頸腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機選取我院婦科2010年1月—2014年7月存檔的在該院行手術治療、且經(jīng)病理確診為宮頸癌的標本38例及宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)組織標本22例,隨機選取同期因子宮肌瘤行全子宮切除術的正常宮頸組織標本10例作為對照組。宮頸癌組按細胞分化程度分為高分化4例,中分化12例,低分化22例；根據(jù)2009年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期標準:Ⅰ期26例,Ⅱ期12例；按病理類型分類均為鱗癌;術后病理證實有淋巴結轉(zhuǎn)移8例，無淋巴結轉(zhuǎn)移30例。病人年齡33～61歲，中位年齡46歲。CIN組Ⅰ級7例,Ⅱ級5例,Ⅲ級10例;病人年齡38～60歲，中位年齡48歲。對照組年齡45～65歲，中位年齡49歲。所有病例均未接受過放化療治療，均經(jīng)病理檢查確診。各組年齡、體質(zhì)量比較差異均無顯著性，具有可比性。

1.2 試劑來源

兔抗人HPV16-E6多克隆抗體、兔抗人P73多克隆抗體、DAB試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司；即用型PV-6000試劑購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

所有標本均經(jīng)甲醛溶液固定，石蠟包埋,4 μm厚連續(xù)切片，采用PV-6000二步法進行免疫組織化學染色。HPV16-E6和P73的抗體工作濃度均為1∶200。所有切片均采用高壓抗原熱修復(切片浸入0.01 mol/L、pH 6.0的枸櫞酸鹽緩沖液中沸浴15 min)，DAB顯色，蘇木精復染，用已知陽性標本作陽性對照(HPV16-E6為宮頸鱗癌,P73為正常皮膚)，用PBS代替一抗作陰性對照。

1.4 結果判定

以細胞核或(和)細胞漿被染成黃色為HPV16-E6蛋白、P73蛋白陽性表達。結果采用半定量綜合法計分。用OLYMPUS照相顯微鏡計算陽性細胞數(shù)。先在100倍光鏡下找到癌巢，再用400倍光鏡隨機取5個視野計數(shù)陽性細胞并取平均值，根據(jù)平均陽性細胞所占百分比及染色強度計分。陽性細胞所占百分比：無陽性細胞為0分，陽性細胞≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。染色強度：細胞無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。以陽性細胞所占百分比與染色強度的乘積≥3分為陽性。

2 結 果

2.1 HPV16-E6與P73蛋白的表達

HPV16-E6蛋白的陽性表達分布于細胞核、細胞質(zhì)。CIN組及鱗癌組織中HPV16-E6蛋白陽性表達率分別為40.9%和78.9%，而在正常宮頸組織未見表達。鱗癌組HPV16-E6蛋白表達明顯高于正常組、CIN組，差異有顯著意義(χ2=21.703，P<0.05)。HPV16-E6蛋白在CINⅠ、CINⅡ及CINⅢ組的陽性表達率分別為42.9%、40.0%、40.0%，組間比較差異無顯著性(P>0.05)。

P73蛋白的陽性表達分布于宮頸鱗狀上皮的基底細胞核。正常宮頸組、CIN組及鱗癌組P73蛋白陽性表達率分別為80.0%、59.1%和21.1%。鱗癌組P73蛋白的表達明顯低于正常組和CIN組，差異有顯著意義(χ2=15.461，P<0.05)。P73蛋白在CINⅠ、CINⅡ及CINⅢ組陽性率分別為71.4%、60.0%、50.0%，組間差異無顯著性(P>0.05)。

2.2 HPV16-E6和P73蛋白表達與宮頸癌臨床病理特征的關系

HPV16-E6蛋白表達與宮頸癌組織學分級有關(χ2=9.011，P<0.05)，與臨床分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、腫瘤大小、發(fā)病年齡無關(P>0.05)。P73蛋白的表達與臨床病理特征均無關(P>0.05)。見表1。

2.3 HPV16-E6蛋白及P73蛋白表達的相關性

HPV16-E6與P73蛋白在宮頸組織中的表達呈負相關(rs=-0.301,P<0.05)。見表2。

表1 宮頸癌組織中HPV16-E6和P73蛋白表達與臨床病理特征的關系(例)

表2 HPV16-E6和P73蛋白在宮頸組織表達相關性(例)

3 討 論

生殖道HPV感染與宮頸癌的關系十分密切，該理論最早在1974年被提出[2]。在HPV的各亞型中，高危型HPV可引起宮頸癌等惡性腫瘤，尤以HPV16多見[3]。HPV16-E6基因是病毒感染后表達的早期基因，其編碼的E6蛋白與E6-AP相互作用，可以降解腫瘤抑制因子p53，從而影響細胞的生長。但這并非E6蛋白致癌惟一途徑[4]。本文研究結果顯示，HPV16-E6蛋白在鱗癌組的表達明顯高于正常組、CIN組，差異有顯著性，且HPV16-E6蛋白表達的陽性率由正?！鶦IN→鱗癌逐漸升高，提示HPV16-E6蛋白表達升高可能與宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展相關。

p53基因是重要的抑癌基因，在多數(shù)惡性腫瘤組織中表達下調(diào)[5]。目前認為是由于HPV感染宮頸上皮后，其表達產(chǎn)物E6蛋白結合并降解p53，使之表達下調(diào)從而導致宮頸癌的發(fā)生。早在1997年，KAGHAD等發(fā)現(xiàn)了一個定位于1P36的新基因，即p73基因，其基因產(chǎn)物P73蛋白具有與p53同樣的4個主要功能區(qū)，以及與p53相似的E6結合模體，即VNQLVGQ序列[6-7]。p73作為p53家族的一員，基因結構和功能與p53基因具有同源性，很可能是HPV16-E6作用的另一重要靶分子，人們推測其亦為抑癌基因[8]。那么P73能否同樣被HPV的病毒癌基因E6結合并降解？研究表明，雖然HPV16-E6蛋白能抑制p73轉(zhuǎn)錄激活及其靶基因p21等的表達，但不能降解P73蛋白。例如，PARK等[9]研究顯示，HPV16-E6蛋白結合P73蛋白的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，一過性降低P73的活性。本研究結果顯示，P73蛋白在正常宮頸組、CIN組及鱗癌組的陽性表達率分別為80.0%、59.1%和21.1%，這種在正常鱗狀上皮高表達、在癌組織低表達的情況與NENUTIL等[10]的研究結果一致。鱗癌組P73蛋白表達明顯低于正常組、CIN組，三者間差異有顯著意義；P73蛋白表達的陽性率由正?！鶦IN→鱗癌逐漸降低，且與HPV16-E6蛋白的表達呈負相關，提示p73可能作為抑癌基因，與宮頸鱗癌的發(fā)生有關。在宮頸鱗癌組，隨著腫瘤分化程度的降低，P73蛋白的陽性表達率有所升高，但不同組織學分化程度之間的差異無顯著性，即P73蛋白在宮頸鱗癌組織的表達與組織學分級無關。這與何培芝等[11]的研究結果不符，可能有以下原因：樣本量少(鱗癌38例)，若能增大樣本，可能進一步增加實驗的代表性；免疫組化方法簡單，存在一定程度的非特異性染色等。

綜上所述，HPV16-E6蛋白在宮頸鱗癌組織中高表達，且與組織學分級密切相關，說明其在宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，可用于宮頸腫瘤的早期診斷，對于判斷宮頸腫瘤的惡性程度及指導治療也具有一定的價值。

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(本文編輯 厲建強)

EXPRESSIONS OF HPV16 E6 PROTEIN AND P73 IN SQUAMOUS CELL CARCINOMA OF THE CERVIX AND THEIR CORRELATION

LIMin,WANGZhen,LIULei,DONGXianning,WANGGuanqun,LISha

(Department of Gynecology, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo investigate the expressions of human papillomavirus (HPV)16-E6 protein and P73 in tissue of squamous cell carcinoma (SCC) of the cervix and their correlation, and explore their role in the occurence and development of the disease.MethodsTissue of normal cervix was selected from 10 cases, that of cervical intraepithelial neoplasia (CIN) from 22 cases and that of SCC from 38 cases. Employing PowerVision two-step immunohistochemical method to detect the expressions of HPV16-E6 protein and P73 in the three kinds of tissue, and analyze the relationship between both HPV16-E6 protein and P73 and correlated clinical pathologic parameters, as well as the relationship between HPV16-E6 protein and P73.ResultsThe positive rate of HPV16 E6 protein in SCC was higher than that in normal cervix and CIN, the difference was significant (χ2=21.703,P<0.05). In SCC group, the expression of P73 was lower than that in normal and CIN groups, the difference was significant (χ2=15.461,P<0.05). In SCC group, the expression of HPV16-E6 protein was related to histological grade (χ2=9.011,P<0.05), and unrelated to the age of onset, clinical stage, lymph node metastasis and the size of tumor (P>0.05). The expression of HPV16 E6 was negatively correlated with that of P73 (rs=-0.301,P<0.05).ConclusionThe elevation of HPV16-E6 expression is pro-bably correlated with the occurence and progression of squamous cell carcinoma of the cervix. The expression of P73 gradually decreases with the progression of the cancer, indicating that P73 may be a tumor suppressor gene of this malignancy.

uterine cervical neoplasms; cervical intraepithelial neoplasia; human papillomavirus 16; immunohistoche-mistry

2015-02-18;

2015-05-16

李敏(1989-)，女，碩士研究生。

王蓁(1963-)，女，碩士，教授,碩士生導師。

R737.33

A

1008-0341(2015)04-0442-03