催乳素和瘦素對奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白及乳蛋白合成信號通路關(guān)鍵因子基因表達(dá)的影響

杜瑞平 王春艷 張興夫 高 民

(內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動物營養(yǎng)與飼料研究所，呼和浩特010031)

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催乳素和瘦素對奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白及乳蛋白合成信號通路關(guān)鍵因子基因表達(dá)的影響

杜瑞平 王春艷 張興夫 高 民*

(內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動物營養(yǎng)與飼料研究所，呼和浩特010031)

在奶牛乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)條件下研究了催乳素(prolactin)和瘦素(leptin)對主要乳蛋白與乳蛋白合成信號通路關(guān)鍵因子基因表達(dá)的影響。采用膠原酶消化法進(jìn)行乳腺上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)，并通過細(xì)胞形態(tài)觀察、生長曲線測定及特異性基因表達(dá)對所培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。試驗(yàn)分為4個(gè)處理，瘦素濃度均為100 ng/mL，催乳素濃度分別為0、0.1、1.0、10.0 μg/mL，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。首先采用噻唑藍(lán)(MTT)法測定了催乳素和瘦素對奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響，然后采用實(shí)時(shí)定量PCR測定了主要乳蛋白[α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-乳球蛋白(β-LGB)]及Janus激酶2(JAK2)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子5(STAT5)、哺乳動物雷帕霉素靶分子(mTOR)信號分子基因表達(dá)量。結(jié)果表明，瘦素一定濃度(100 ng/mL)基礎(chǔ)上，與0 μg/mL催乳素處理相比：0.1和1.0 μg/mL催乳素對乳腺上皮細(xì)胞有顯著的促增殖作用(P<0.05)；0.1與10.0 μg/mL的催乳素均顯著降低了αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、β-LGB的基因表達(dá)量(P<0.05)；而1.0 μg/mL催乳素處理對αs1-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-LGB均有顯著的促進(jìn)表達(dá)效應(yīng)(P<0.05)；各催乳素添加處理均顯著促進(jìn)了JAK2基因的表達(dá)(P<0.05)，而對STAT5和mTOR基因表達(dá)只有1.0 μg/mL催乳素處理有顯著促進(jìn)效應(yīng)(P<0.05)。結(jié)果提示，培養(yǎng)液含瘦素100 ng/mL基礎(chǔ)上，催乳素對乳蛋白及信號通路關(guān)鍵因子基因表達(dá)有促進(jìn)作用，但濃度限制在一定范圍(0.1～1.0 μg/mL)，過高或過低都會呈現(xiàn)抑制效應(yīng)。瘦素100 ng/mL與催乳素1.0 μg/mL對部分乳蛋白基因及乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)有顯著的促進(jìn)作用，且通過調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子JAK2、STAT5與mTOR基因表達(dá)，從而影響乳蛋白基因的表達(dá)。

催乳素；瘦素；奶牛乳腺上皮細(xì)胞；乳蛋白基因；信號通路因子

牛乳蛋白作為人類膳食蛋白質(zhì)的重要來源以及原料奶質(zhì)量、收購定價(jià)的重要指標(biāo)，其重要性已受到生產(chǎn)者和研究者的廣泛關(guān)注。但是，目前我國奶業(yè)生產(chǎn)中乳蛋白水平整體偏低的問題特別突出，直接影響原料奶質(zhì)量和飼養(yǎng)者經(jīng)濟(jì)效益。因此，乳蛋白調(diào)控將成為我國奶業(yè)發(fā)展當(dāng)前和今后相當(dāng)長時(shí)間內(nèi)反芻動物營養(yǎng)學(xué)研究的重要課題。乳腺在自身發(fā)育過程中受到多種甾類和肽類激素等因子的調(diào)控[1]，其中催乳素(prolactin)在乳腺發(fā)育、啟動泌乳和維持泌乳中都起著至關(guān)重要的作用，并直接調(diào)控泌乳期乳腺的乳蛋白合成[2]。而脂肪細(xì)胞因子瘦素(leptin)在動物孕期和泌乳期有關(guān)營養(yǎng)物質(zhì)分配的能量代謝過程中發(fā)揮著重要調(diào)控功能[3]。但從目前已有的關(guān)于催乳素和瘦素對乳蛋白調(diào)控的文獻(xiàn)來看，就動物模型而言，大多數(shù)的研究集中在人類和嚙齒類動物的乳腺模型上[4-6]，反芻動物此類研究很少；就研究深度來看，催乳素對乳腺上皮細(xì)胞功能影響的研究逐漸深入，且越來越趨向于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與分子機(jī)制的研究[7]，而乳腺中瘦素的研究僅限于其組織分布、mRNA水平的表達(dá)和簡單的功能確定[8-10]。Feuermann等[11-12]、王春艷等[13]對奶牛乳腺瘦素及其受體的表達(dá)以及瘦素的劑量效應(yīng)進(jìn)行了初步研究。目前尚缺乏催乳素與瘦素對奶牛乳腺泌乳功能，特別是乳蛋白合成方面的互作調(diào)控研究。作為乳腺發(fā)育進(jìn)程中重要激素和細(xì)胞因子，催乳素和瘦素在奶牛的乳蛋白調(diào)控中究竟發(fā)揮怎樣的協(xié)同作用？為此，本研究進(jìn)行了催乳素和瘦素對奶牛乳蛋白基因及乳蛋白合成主要信號通路關(guān)鍵因子基因表達(dá)的影響研究，旨在為生產(chǎn)實(shí)踐中奶牛乳蛋白調(diào)控提供基礎(chǔ)研究支持。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

CO2培養(yǎng)箱(Heal Force HF240)，倒置相差顯微鏡(Olympus LX71)，離心機(jī)(Eppendorf，5417R)，普通PCR儀(PTC-200，MJ，美國)，電泳儀(Bio-Rad)，凝膠成像儀(UVP)，定量PCR儀(IQ5，Bio-Rad)，多功能酶標(biāo)儀(BioTek Synergy H4)，-80 ℃冰箱(Thermo)。

DMEM/F12培養(yǎng)基(11330-032，Gibco)，胎牛血清(04-001-1A，BI)，磷酸鹽緩沖液(DPBS)(Hyclone SH30028-01B)，Ⅱ型膠原酶(17101-015，Gibco)，噻唑藍(lán)(MTT)(M2182，Sigma)，催乳素(L6520，Sigma)，瘦素(L4146，Sigma)，總RNA提取試劑盒(DP430，TIANGEN)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(DRR036A，TaKaRa)，實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(DRR081，TaKaRa)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)分為4個(gè)處理，瘦素濃度均為100 ng/mL，催乳素濃度分別為0、0.1、1.0、10.0 μg/mL，每個(gè)處理6個(gè)重復(fù)。

引物設(shè)計(jì)見表1。根據(jù)GenBank提供的序列設(shè)計(jì)引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為管家基因。將凍干粉狀態(tài)的引物離心后，用滅菌超純水配制成100 μmol/L貯備液和10 μmol/L工作液，-20 ℃保存。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)及處理

參照Miranda等[14]方法，無菌條件下采集泌乳期健康中國荷斯坦奶牛乳腺組織，75%酒精與DPBS交替沖洗并剪碎，Ⅱ型膠原酶消化后離心，棄去上清液，加入培養(yǎng)基接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 d左右，然后換液。以后每隔1 d換1次液，并觀察細(xì)胞生長狀況，根據(jù)細(xì)胞密度和生長情況來決定傳代時(shí)間。利用細(xì)胞對胰酶的敏感度進(jìn)行傳代并凍存。凍存的細(xì)胞復(fù)蘇后，加完全培養(yǎng)基(DMEM/F12培養(yǎng)基，含10%胎牛血清、10 μg/mL表皮生長因子、10 μg/mL胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒、1 μg/mL氫化可的松)制成5.0×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種到6孔板，每組6個(gè)重復(fù)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后鏡下觀察細(xì)胞是否匯合，完全匯合后，培養(yǎng)基換成催乳素和瘦素處理的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3.2 細(xì)胞生長曲線繪制

細(xì)胞分別以0.5×104、1.0×104、2.0×104、3.0×104個(gè)/mL的濃度接種于24孔培養(yǎng)板中，每天同一時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，考察細(xì)胞增殖規(guī)律。

1.3.3 MTT法檢測

復(fù)蘇好的細(xì)胞，加完全培養(yǎng)基制成濃度為5.0×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種96孔板，每組5個(gè)重復(fù)，每孔200 μL細(xì)胞懸液培養(yǎng)24 h后，換成催乳素和瘦素處理培養(yǎng)基，48 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，4 h后，倒掉培養(yǎng)液，每孔加入150 μL的二甲基亞砜(DMSO)，酶標(biāo)儀450 nm波長下測吸光度(OD)值。

1.3.4 總RNA提取

按照試劑盒說明進(jìn)行，處理細(xì)胞消化離心后提取總RNA，應(yīng)用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取RNA是否完整，并用多功能酶標(biāo)儀測定490 nm下RNA濃度及OD260 nm/OD280 nm。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

1.3.5 反轉(zhuǎn)錄

使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒把所提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系為10 μL(200 ng RNA)：無酶水6 μL，dNTP Mix 2 μL，RNA 2 μL。反應(yīng)條件為37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。

1.3.6 實(shí)時(shí)定量PCR

反應(yīng)體系為20 μL，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×)10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，cDNA 2 μL，無酶水7.2 μL。主要反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性30 s，退火20 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；70～95 ℃熔解曲線0.5 ℃每6 s。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

基因表達(dá)數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算，公式如下：

△Ct=Ct目的基因-Ct管家基因；

△△Ct=△Ct試驗(yàn)組-△Ct對照組；

基因表達(dá)=2-△△Ct。

數(shù)據(jù)采用SAS 9.0軟件包中的平衡試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析過程(ANOVA)，平均值的多重比較采用Duncan氏法進(jìn)行，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示，其中P<0.05表示處理間差異顯著，P<0.01表示處理間差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的建立

2.1.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

如圖1所示，培養(yǎng)3 d的原代細(xì)胞，乳腺上皮細(xì)胞剛貼壁，多為橢圓形，而多角形的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)5 d的原代細(xì)胞，乳腺上皮細(xì)胞生長旺盛。培養(yǎng)24 h的經(jīng)純化的傳1代細(xì)胞，貼壁細(xì)胞基本上是呈鵝卵石樣的乳腺上皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞很少。培養(yǎng)24 h的傳2代細(xì)胞，此時(shí)乳腺上皮細(xì)胞較純，基本上看不到成纖維細(xì)胞。

2.1.2 生長曲線繪制

如圖2所示，細(xì)胞生長包括3個(gè)時(shí)期，即潛伏期、指數(shù)期和平臺期。正常的細(xì)胞生長曲線呈“S”形。摸索試驗(yàn)分別以0.5×104、1.0×104、2.0×104、3.0×104個(gè)/mL的濃度接種于24孔培養(yǎng)板中，每天同一時(shí)間進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，考察細(xì)胞增殖規(guī)律。結(jié)果顯示3.0×104個(gè)/mL最符合乳腺上皮細(xì)胞生長“S”形曲線，具有正常的分裂增殖特性。

A：3 d原代細(xì)胞；B：5 d原代細(xì)胞；C：24 h傳1代細(xì)胞；D：24 h傳2代細(xì)胞。

A： 3 d primary cell; B： 5 d primary cell; C： 24 h 1stpassage cell; D： 24 h 2ndpassage cell.

圖1 乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

Fig.1 The morphology of mammary epithelial cells (100×)

圖2 乳腺上皮細(xì)胞生長曲線

2.1.3 特異性乳蛋白基因表達(dá)

如圖3所示，檢測得到的目的基因α-酪蛋白(α-casein)、β-酪蛋白(β-casein)與β-乳球蛋白(β-LGB)基因片段大小分別與預(yù)期片段大小189、146和115 bp相符，且無非特異性條帶。

通過以上對所培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞生長曲線繪制及乳腺上皮細(xì)胞特有乳蛋白基因表達(dá)的檢測，確定從培養(yǎng)體系中能獲得大量純凈且有較好增殖分化潛能的乳腺上皮細(xì)胞，可用于后續(xù)的試驗(yàn)研究。

2.2 催乳素和瘦素互作對奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響

在相同的瘦素(100 ng/mL)處理濃度下，添加4個(gè)梯度濃度催乳素(0、0.1、1.0、10.0 μg/mL)，處理細(xì)胞48 h后MTT法測細(xì)胞增殖。由表2可知，0.1和1.0 μg/mL催乳素處理顯著高于0 μg/mL催乳素處理(P<0.05)，但0.1和1.0 μg/mL 2個(gè)處理之間無顯著差異(P>0.05)；由于10.0 μg/mL催乳素處理數(shù)據(jù)差異變動異常，所以剔除。由此推斷在瘦素一定濃度基礎(chǔ)上，催乳素濃度增加對乳腺上皮細(xì)胞有促增殖作用，但濃度的不斷增高并不會進(jìn)一步促進(jìn)增殖。

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) DNA molecular weight marker；1～2：α-酪蛋白 α-casein；3～4：β-乳球蛋白β-LGB；5～6：β-酪蛋白 β-casein。

圖3 主要乳蛋白基因表達(dá)PCR檢測結(jié)果

Fig.3 The results of gene expressions of main milk proteins detected by PCR

表2 催乳素和瘦素對奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響(以O(shè)D450 nm表示)

肩標(biāo)相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

In the same row, values with the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

2.3 催乳素和瘦素對乳蛋白基因與相關(guān)信號通路關(guān)鍵信號分子基因表達(dá)的影響

2.3.1 RNA電泳檢測

提取培養(yǎng)細(xì)胞總RNA，RNA濃度和純度檢測正常，各處理樣品濃度均保持在200～300 ng/μL的范圍，OD260 nm/OD280 nm測定值在1.8～2.0之間，沒有蛋白質(zhì)和DNA的污染，如圖4所示，可用于后續(xù)基因表達(dá)的分析。

圖4 奶牛乳腺上皮細(xì)胞總RNA電泳結(jié)果

2.3.2 催乳素和瘦素互作對酪蛋白與β-LGB基因表達(dá)的影響

如圖5所示，瘦素一定濃度(100 ng/mL)前提下，隨著催乳素濃度提高，αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、κ-酪蛋白和β-LGB基因表達(dá)呈先下降、上升再下降的動態(tài)。αs1-酪蛋白、β-酪蛋白、β-LGB基因表達(dá)先顯著下降、再顯著升高、再顯著下降(P<0.05)；αs2-酪蛋白基因表達(dá)0.1和10.0 μg/mL催乳素處理顯著低于0 μg/mL催乳素處理(P<0.05)；κ-酪蛋白基因表達(dá)1.0 μg/mL催乳素處理顯著高于其他處理(P<0.05)。

2.3.3 催乳素和瘦素互作對JAK2、STAT5與mTOR信號分子基因表達(dá)的影響

如圖6所示，JAK2基因表達(dá)隨著催乳素濃度的提高而顯著上升(P<0.05)；而STAT5基因表達(dá)則先顯著下降、再顯著上升、再顯著下降(P<0.05)，10.0 μg/mL催乳素處理與0 μg/mL催乳素處理相比沒有顯著變化(P>0.05)；mTOR基因表達(dá)1.0 μg/mL催乳素處理顯著高于其他處理(P<0.05)。

3 討 論

乳蛋白的合成與分泌受基因型和環(huán)境因素的雙重調(diào)控，乳蛋白含量的變化主要跟營養(yǎng)水平、內(nèi)分泌變化以及乳腺中眾多影響蛋白質(zhì)代謝的調(diào)控因子相關(guān)。這些調(diào)節(jié)因素共同作用，形成復(fù)雜而精密的乳蛋白合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從基因轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯和代謝水平等多個(gè)層次影響乳蛋白的合成[15]。同機(jī)體其他任何生理系統(tǒng)相比，內(nèi)分泌系統(tǒng)在調(diào)控乳腺發(fā)育、泌乳起始和維持泌乳過程中起主導(dǎo)作用。影響乳蛋白合成與分泌的激素主要有生長激素、胰島素、催乳素和雌激素等[16]。催乳素是由腦垂體的嗜酸細(xì)胞分泌的一類單鏈多肽類激素，是最重要的一種泌乳激素，它在懷孕期乳腺上皮細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生和分化中起著重要作用，并直接調(diào)控泌乳期乳腺的乳蛋白合成[2]。催乳素對奶牛泌乳的影響包括：刺激氨基酸和葡萄糖吸收，促進(jìn)乳腺發(fā)育、乳汁生成，發(fā)動和維持泌乳等[17]。而脂肪細(xì)胞因子瘦素主要是由白色脂肪組織分泌的一種肽類激素，其他組織內(nèi)也有少量分泌。瘦素在能量代謝的調(diào)控和協(xié)同中起著關(guān)鍵性的作用[18]，因此，瘦素可能在孕期和泌乳期的能量消耗過程中對有關(guān)營養(yǎng)物質(zhì)分配的能量代謝發(fā)揮著重要作用[3]。

數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖6同。

Value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as Fig 6.

圖5 催乳素和瘦素對αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β-LGB基因表達(dá)的影響

Fig.5 Effects of prolactin and leptin on αs1-casein, αs2-casein, β-casein, κ-casein andβ-LGBgene expressions

目前，瘦素和催乳素對乳腺泌乳功能的作用研究大多數(shù)集中在人類和嚙齒類動物(大鼠、小鼠)的乳腺模型上[4-6]；催乳素對乳腺上皮細(xì)胞功能影響的研究逐漸深入，且越來越趨向于泌乳信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與分子機(jī)制的研究[7]，而乳腺中瘦素的研究相對薄弱，多數(shù)限于組織分布、mRNA水平表達(dá)和簡單的功能確定等[8-10]。Chebel等[19]研究認(rèn)為瘦素基因型與荷斯坦奶牛的泌乳性能和健康狀況緊密相關(guān)，而關(guān)于二者的交互作用報(bào)道很少。本研究選取的瘦素濃度為100 ng/mL，是基于我們前期的試驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)研究的基礎(chǔ)上確定的。Feuermann等[11]利用泌乳奶牛和犢牛乳腺組織塊培養(yǎng)研究了不同梯度濃度瘦素(0、10、100 ng/mL)在催乳素添加和不添加(0、1 μg/mL)情況下對乳腺泌乳特性的影響，結(jié)果表明，催乳素顯著誘導(dǎo)β-LGB和α-酪蛋白基因表達(dá)，瘦素添加情況下，更進(jìn)一步促進(jìn)了這2個(gè)乳蛋白的基因表達(dá)，是單純添加催乳素基因表達(dá)的3倍之多，瘦素濃度增加沒有劑量效應(yīng)。王春艷等[13]也在催乳素添加和不添加條件下，研究了不同濃度瘦素對奶牛乳腺上皮細(xì)胞中主要乳蛋白基因表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，在無催乳素條件下，瘦素未促進(jìn)、甚至抑制α-酪蛋白、β-酪蛋白基因的表達(dá)，而在有催乳素條件下，瘦素極顯著促進(jìn)α-酪蛋白、β-酪蛋白基因的表達(dá)，其中100 ng/mL處理效果最顯著。另外不論有、無催乳素，瘦素均促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中β-LGB基因的表達(dá)。我們的結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了前人的研究，本研究中，瘦素固定濃度(100 ng/mL)下不同梯度濃度催乳素處理后，1.0 μg/mL的催乳素處理對αs1-酪蛋白、κ-酪蛋白和β-LGB基因表達(dá)有顯著的促進(jìn)作用，低于或高于這個(gè)濃度都顯著降低或無顯著影響，規(guī)律較一致。這樣的結(jié)果說明催乳素的影響有劑量范圍。瘦素本身也受到催乳素的調(diào)節(jié)，F(xiàn)euermann等[11]的研究還表明泌乳乳腺組織中催乳素誘導(dǎo)瘦素及其受體基因顯著表達(dá)，但對犢牛乳腺組織的瘦素及其受體表達(dá)無顯著影響。瘦素的表達(dá)和分泌也受其他各種因子的調(diào)控，例如胰島素、糖皮質(zhì)激素、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、雌激素和CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白可以提高瘦素的表達(dá)和分泌，雄激素、游離脂肪酸、生長激素和過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)激動劑可以減少瘦素的表達(dá)和分泌[20]。對乳腺上皮細(xì)胞增殖的作用，本研究瘦素存在基礎(chǔ)上，催乳素濃度呈現(xiàn)了和對乳蛋白基因表達(dá)影響較為一致的規(guī)律，即1.0 μg/mL催乳素處理顯著促進(jìn)乳腺上皮增殖，濃度增大并不會提高促進(jìn)作用，Silva等[21]對青春期前的小母牛經(jīng)乳頭管進(jìn)行了高劑量瘦素灌注(100 μg/d)，同時(shí)灌注0、10 μg/d胰島素樣生長因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)，結(jié)果表明，瘦素顯著降低了乳腺上皮細(xì)胞的增殖，且對IGF-Ⅰ有抑制作用。王春艷等[22]研究表明適宜濃度的瘦素可促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖，并呈現(xiàn)一定的濃度和時(shí)間依賴性，在無催乳素的情況下，促增殖效果更明顯，但是高濃度的瘦素對乳腺上皮細(xì)胞的增殖表現(xiàn)為顯著的抑制作用，這也和Silva等[21]的體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)論一致。此方面研究人和嚙齒類動物及反芻動物的報(bào)道結(jié)果各有差異，究其原因，動物品種、培養(yǎng)體系、使用劑量等都可能造成結(jié)論的不同。

圖6 催乳素和瘦素對Janus激酶2、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子5、哺乳動物雷帕霉素靶分子基因表達(dá)的影響

前人研究認(rèn)為，乳腺的發(fā)育和泌乳由激素及由乳腺上皮細(xì)胞本身或乳腺脂肪墊中產(chǎn)生的細(xì)胞因子協(xié)同作用得以調(diào)控[23]。脂肪細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子可以調(diào)節(jié)脂肪-上皮細(xì)胞間的相互作用，以及改變一些類固醇和肽類激素的活性[24]。足夠大的脂肪墊是乳腺成功發(fā)育的必需條件，而且乳腺脂肪-上皮細(xì)胞間的相互作用對導(dǎo)管的生長和乳腺的形態(tài)發(fā)生起著關(guān)鍵作用[25]。Feuermann等[26]采用奶牛乳腺脂肪墊脂肪組織塊與乳腺上皮細(xì)胞共培養(yǎng)體系研究認(rèn)為，脂肪組織分泌的瘦素受到催乳素的調(diào)節(jié)，共培養(yǎng)體系中α-酪蛋白基因表達(dá)顯著高于上皮細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)體系，并認(rèn)為瘦素和催乳素正是經(jīng)由乳腺脂肪墊才發(fā)揮了互作作用。所以，我們的結(jié)果和相關(guān)研究中關(guān)于催乳素和瘦素的互作也進(jìn)一步說明了乳腺脂肪墊和乳腺上皮細(xì)胞之間的分子對話聯(lián)系。

催乳素、瘦素與受體結(jié)合后都可以通過Janus激酶(JAK)/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子(STAT)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控乳蛋白的合成[7,16]。當(dāng)前，最為人們關(guān)注的乳蛋白合成的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控就是JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與乳蛋白合成的主要是JAK2/STAT5信號通路，該途徑可以發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)錄活化子蛋白的雙重作用，介導(dǎo)多種細(xì)胞因子和生長因子的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，并活化相應(yīng)靶基因，從而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)[27]。由催乳素介導(dǎo)的JAK2/STAT5信號途徑的機(jī)制研究已經(jīng)比較透徹，乳蛋白的合成過程中，催乳素等激素及IGF、表皮生長因子等細(xì)胞因子與其受體結(jié)合后，通過JAK2激活STAT5，STAT5進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與靶基因結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄[28]。本研究中，催乳素的不同梯度對JAK2、STAT5 2個(gè)因子基因表達(dá)的影響不盡一致，但1.0 μg/mL催乳素處理均顯著促進(jìn)了2個(gè)因子的基因表達(dá)。另外，這些激素和細(xì)胞因子也可能通過mTOR信號途徑調(diào)控乳蛋白合成[29]，mTOR信號通路是乳蛋白合成的重要調(diào)控途徑。mTOR是雷帕霉素(rapamycin)的靶分子，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，mTOR不僅是氨基酸驅(qū)動蛋白合成的信號通路，同時(shí)也是生長激素、胰島素等激素調(diào)節(jié)乳蛋白合成的關(guān)鍵分子[30]。我們的研究表明，100 ng/mL瘦素和1.0 μg/mL催乳素處理顯著提高了mTOR的基因表達(dá)。以上這些結(jié)果也從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑解釋了催乳素和瘦素對乳蛋白基因表達(dá)的影響機(jī)制，即催乳素和瘦素很可能通過調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子JAK2/STAT5和mTOR因子的表達(dá)從而影響乳蛋白基因的表達(dá)，見圖7，但催乳素的濃度須控制在一定范圍，過高或過低劑量都會呈現(xiàn)反向抑制效應(yīng)。

P：磷酸化 phosphorylation。

圖7 催乳素和瘦素調(diào)控乳蛋白合成的分子機(jī)制

Fig.7 Molecular mechanism of protein synthesis regulated by prolactin and leptin

激素對乳品質(zhì)形成的影響機(jī)制十分復(fù)雜，除直接調(diào)節(jié)乳腺中乳蛋白基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程以外，還可以通過調(diào)節(jié)乳腺血流量、通過調(diào)節(jié)機(jī)體能量平衡和物質(zhì)代謝過程對流經(jīng)乳腺的乳成分前體物的構(gòu)成進(jìn)行調(diào)節(jié)，間接影響乳蛋白的合成[31]。關(guān)于激素對乳蛋白合成的影響還需要更多橫向和縱向的深入研究?？偠灾?，通過營養(yǎng)調(diào)控等手段維持機(jī)體能量平衡，發(fā)揮激素促進(jìn)乳蛋白合成的正向作用，減少異常代謝或病理變化引發(fā)的負(fù)調(diào)控作用，將對提高牛奶營養(yǎng)品質(zhì)和促進(jìn)我國奶業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[32]。

4 結(jié) 論

① 乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)液含瘦素100 ng/mL基礎(chǔ)上，催乳素對乳蛋白及信號通路關(guān)鍵因子基因表達(dá)有促進(jìn)作用，但濃度限制在一定范圍(0.1～1.0 μg/mL)，過高或過低都會呈現(xiàn)抑制效應(yīng)。

② 瘦素100 ng/mL與催乳素1.0 μg/mL對部分乳蛋白基因及乳蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)有顯著的促進(jìn)作用，且通過調(diào)控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子JAK2、STAT5與mTOR基因表達(dá)，從而影響乳蛋白基因的表達(dá)。

[1] FRIEDMAN J M,HALAAS J L.Leptin and the regulation of body weight in mammals[J].Nature,1998,395(6704):763-770.

[2] GRONER B.Transcription factor regulation in mammary epithelial cells[J].Domestic Animal Endocrinology,2002,23(1/2):25-32.

[3] MOSCHOS S,CHAN J L,MANTZOROS C S.Leptin and reproduction:a review[J].Fertility and Sterility,2002,77(3):433-444.

[4] ROH S G,BAIK M G,CHOI Y J,et al.The effect of lactogenic hormones on protein synthesis and amino acid uptake in rat mammary acinar cell culture at various physiological stages[J].International Journal of Biochemistry,1994,26(4):479-485.

[5] JANSSON N,GREENWOOD S L,JOHANSSON B R,et al.Leptin stimulates the activity of the system A amino acid transporter in human placental villous fragments[J].The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism,2003,88(3):1205-1211.

[6] QIAN L,LOPEZ V,SEO Y A,et al.Prolactin regulatesZNT2 expression through the JAK2/STAT5 signaling pathway in mammary cells[J].American Journal of Physiology:Cell Physiology,2009,297(2):C369-C377.

[7] BROCKMAN J L,SCHROEDER M D,SCHULER L A.PRL activates the cyclin D1 promoter via the JAK2/STAT pathway [J].Molecular Endocrinology,2002,16(4):774-784.

[8] ZHANG Y,PROENCA R,MAFFEI M,et al.Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue[J].Nature,1994,372(6505):425-432.

[9] YANAGIHARA N,UTSUNOMIYA K,CHEAH T B,et al.Characterization and functional role of leptin receptor in bovine adrenal medullary cells[J].Biochemical Pharmacology,2000,59(9):1141-1145.

[10] CHELIKANI P K,GLIMM D R,KENNELLY J J.Short Communication:tissue distribution of leptin and leptin receptor mRNA in the bovine[J].Journal of Dairy Science,2003,86(7):2369-2372.

[11] FEUERMANN Y,MABJEESH S J,SHAMAY A.Leptin affects prolactin action on milk protein and fat synthesis in the bovine mammary gland[J].Journal of Dairy Science,2004,87(9):2941-2946.

[12] FEUERMANN Y,MABJEESH S J,SHAMAY A.Mammary fat can adjust prolactin effect on mammary epithelial cells via leptin and estrogen[J].International Journal of Endocrinology,2009,2009:427260.

[13] 王春艷,杜瑞平,高民,等.Leptin對奶牛乳腺上皮細(xì)胞主要乳蛋白基因表達(dá)的影響[J].中國畜牧雜志,2013,49(15):58-61.

[14] MIRANDA S G,WANG Y J,PURDIE N G,et al.Selenomethionine stimulates expression of glutathione peroxidase 1 and 3 and growth of bovine mammary epithelial cells in primary culture[J].Journal of Dairy Science,2009,92(6):2670-2683.

[15] BIONAZ M,LOOR J J.Gene networks driving bovine mammary protein synthesis during the lactation cycle[J].Bioinformatics and Biology Insights,2011,5:83-98.

[16] AKERS R M.Major advances associated with hormone and growth factor regulation of mammary growth and lactation in dairy cows[J].Journal of Dairy Science,2006,89(4):1222-1234.

[17] FREEMAN M E,KANYICSKA B,LERANT A,et al.Prolactin:structure,function,and regulation of secretion[J].Physiology Review,2000,80(4):1523-1631.

[18] BANKS A S,DAVIS S M,BATES S H,et al.Activation of downstream signals by the long form of the leptin receptor[J].The Journal of Biological Chemistry,2000,275:14563-14572.

[19] CHEBEL R C,SUSCA F,SANTOS J E P.Leptin genotype is associated with lactation performance and health of Holstein cows[J].Journal of Dairy Science,2008,91(7):2893-2900.

[20] MARGETIC S,GAZZOLA C,PEGG G G,et al.Leptin:a review of its peripheral actions and interactions[J].International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders,2002,26(11):1407-1433.

[21] SILVA L F P,ETCHEBARNE B E,WEBER MIELSEN M S,et al.Intramammary infusion of leptin decreases proliferation of mammary epithelial cells in prepubertal heifers[J].Journal of Dairy Science,2008,91(8):3034-3044.

[22] 王春艷.瘦素對奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳蛋白合成的調(diào)控作用研究[D].碩士學(xué)位論文.呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[23] NEVILLE M C,MEDINA D,MONKS J,et al.The mammary fat pad[J].Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia,1998,3(2):109-116.

[24] ZANGANI D,DARCY K M,SHOEMAKER S,et al.Adipocyte-epithelial interactions regulate theinvitrodevelopment of normal mammary epithelial cells[J].Experimental Cell Research,1999,247(2):399-409.

[25] HOVEY R C,MCFADDEN T B,AKERS R M.Regulation of mammary gland growth and morphogenesis by the mammary fat pad:a species comparison[J].Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia,1999,4(1):53-68.

[26] FEUERMANN Y,MABJEESH S J,NIV-SPECTOR L,et al.Prolactin affects leptin action in the bovine mammary gland via the mammary fat pad[J].Journal of Endocrinology,2006,191:407-413.

[27] SHILLINGFORD J M,HENNIGHAUSEN L.Experimental mouse genetics—answering fundamental questions about mammary gland biology[J].Trends in Endocrinology & Metabolism,2001,12(9):402-408.

[28] BROCKMAN J L,SCHULER L A.Prolactin signals via STAT5 and Oct-1 to the proximal cyclin D1 promoter[J].Molecular and Cellular Endocrinology,2005,239(1/2):45-53.

[29] BURGOS S A,DAI M,CANT J P.Nutrient availability and lactogenic hormones regulate mammary protein synthesis through the mammalian target of rapamycin signaling pathway[J].Journal of Dairy Science,2010,93(1):153-161.

[30] BEUGNET A,TEE A R,TAYLOR P M,et al.Regulation of targets of mTOR (mammalian target of rapamycin) signalling by intracellular amino acid availability[J].Biochemical Journal,2003,372(Pt 2):555-566.

[31] 文靜.兩種典型日糧模式對奶牛泌乳量、乳品質(zhì)及泌乳相關(guān)激素的影響[D].碩士學(xué)位論文.長春:吉林大學(xué),2013.

[32] 王建發(fā).乳脂肪和乳蛋白主要前體物對DCAPCs中GH和PRL的影響及機(jī)制研究[D].博士學(xué)位論文.長春:吉林大學(xué),2013.

*Corresponding author, professor, E-mail: gmyh1588@126.com

(責(zé)任編輯 王智航)

Effects of Prolactin and Leptin on Gene Expressions of Milk Proteins and Key Factors Related to Milk Protein Synthesis of Bovine Mammary Epithelial Cells

DU Ruiping WANG Chunyan ZHANG Xingfu GAO Min*

(AnimalNutritionInstituteofAgricultureandAnimalHusbandryAcademyofInnerMongolia,Huhhot010031,China)

This experiment was conducted to investigate the effects of prolactin and leptin on gene expressions of milk proteins and key factors related to milk protein synthesis of bovine mammary epithelial cells under primary culture condition. The primary bovine mammary epithelial cells (pBMECs) were cultured by collagenase digestion. The epithelial origin of pBMECs was identified by morphological observation, growth curve assay and specific milk protein gene expressions detection. There were four treatments with four concentrations of prolactin (0， 0.1， 1.0 and 10.0 μg/mL, respectively), leptin concentration was the same (100 ng/mL), and each treatment had six replicates. Thiazole blue (MTT) assay was used to detected the effects of prolactin and leptin on cells proliferation, and real time PCR was used to assay the effects of prolactin and leptin on gene expressions of main milk proteins [α-casein, β-casein, κ-casein and β-lactoglobulin (β-LGB)], Janus kinase 2 (JAK2), signal transduction and transcription activator 5 (STAT5) and mammalian target of rapamycin (mTOR). The results showed that based on certain concentration of leptin (100 ng/mL), compared with 0 μg/mL prolactin treatment: the treatments of 0.1 and 1.0 μg/mL prolactin significantly promoted pBMECs proliferation (P<0.05); the treatments of 0.1 and 10.0 μg/mL prolactin significantly decreased the gene expressions of αs1-casein, αs2-casein, β-casein andβ-LGB(P<0.05); the treatment of 1.0 μg/mL prolactin significantly increased the gene expressions of αs1-casein, κ-casein,β-LGB(P<0.05); all supplemental treatments of prolactin exerted promotion effects onJAK2 gene expression(P<0.05); only the treatment of 1.0 μg/mL prolactin significantly increasedSTAT5 andmTORgene expressions (P<0.05). In conclusion, based on 100 ng/mL leptin in culture medium, positive effects of prolactin on gene expressions of milk proteins and key factors related to milk protein synthesis are observed, but the concentration should be limited in a certain range (0.1 to 1.0 μg/mL), and reverse inhibition effects emerge with high or low concentration. Our finding suggests that 100 ng/mL leptin and 1.0 μg/mL prolactin show significant promotion effects on gene expressions of milk proteins and key factors related to milk protein synthesis by regulating the gene expressions of signal factors ofJAK2,STAT5 andmTOR.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2015, 27(12)：3920-3930]

prolactin; leptin; bovine mammary epithelial cell; milk protein gene; signal pathway factor

10.3969/j.issn.1006-267x.2015.12.034

2015-06-26

國家自然科學(xué)基金(31060136)；內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院青年創(chuàng)新基金(2011QNJJM04)

杜瑞平(1979—)，女，內(nèi)蒙古包頭人，副研究員，博士，研究方向?yàn)榉雌c動物營養(yǎng)調(diào)控理論與技術(shù)。E-mail: duruiping1989@163.com

*通信作者：高 民，研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail: gmyh1588@126.com

S852.2；S826

A

1006-267X(2015)12-3920-11