羅非魚低魚粉飼料中桑葉發(fā)酵蛋白替代魚粉的研究

陳文燕 陳擁軍 彭祥和 林仕梅* 黃先智 李 云

(1.西南大學動物科技學院，重慶400716；2.西南大學淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室，重慶400716；3.西南大學蠶學與系統(tǒng)生物學研究所，重慶400716)

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羅非魚低魚粉飼料中桑葉發(fā)酵蛋白替代魚粉的研究

陳文燕1,2陳擁軍1,2彭祥和1,2林仕梅1,2*黃先智3李 云1,2

(1.西南大學動物科技學院，重慶400716；2.西南大學淡水魚類資源與生殖發(fā)育教育部重點實驗室，重慶400716；3.西南大學蠶學與系統(tǒng)生物學研究所，重慶400716)

在實用飼料(含5%魚粉)的基礎(chǔ)上，用桑葉發(fā)酵蛋白分別替代0(對照)、40%和80%的魚粉，相應(yīng)的桑葉發(fā)酵蛋白添加水平為0、4%和8%，配制成3種等氮(粗蛋白質(zhì)含量32%)等能(總能15 MJ/kg)的試驗飼料，飼喂初重約為40 g的吉富羅非魚8周，以研究羅非魚低魚粉飼料中桑葉發(fā)酵蛋白替代魚粉的可行性。每種飼料設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)飼喂30尾魚。結(jié)果顯示：與對照組相比，40%替代水平不影響羅非魚的生長(P>0.05)，而80%替代水平顯著降低羅非魚的末重、特定生長率和蛋白質(zhì)效率(P<0.05)。各組飼料系數(shù)和攝食率均無顯著差異(P>0.05)。80%替代水平組羅非魚的臟體比、肝體比以及血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇和全血中葡萄糖(血糖)含量最低，血清高密度脂蛋白膽固醇含量及高密度脂蛋白膽固醇/總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇/低密度脂蛋白膽固醇最高，且與40%替代水平組和對照組均有顯著差異(P<0.05)。各組羅非魚肥滿度以及全魚水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量均無顯著差異(P>0.05)。由此可見，在低魚粉飼料(含5%魚粉)中，桑葉發(fā)酵蛋白替代40%的魚粉不會影響羅非魚的生長，替代80%魚粉會抑制羅非魚的生長，但可以降低羅非魚的血脂和血糖含量。

桑葉發(fā)酵蛋白；魚粉；羅非魚；生長

羅非魚因生長快、食性雜、抗病力強、肉質(zhì)鮮美、價格適中等特點，成為被聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)推薦向全世界推廣養(yǎng)殖的優(yōu)質(zhì)魚類，也是我國主導(dǎo)水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。2014年我國羅非魚產(chǎn)量達170萬t，居世界首位。但目前優(yōu)質(zhì)動、植物蛋白質(zhì)飼料原料的價格居高不下，致使羅非魚養(yǎng)殖成本上升，利潤空間減小，不利于羅非魚行業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。因此，以廉價蛋白質(zhì)源替代優(yōu)質(zhì)魚粉、豆粕等飼料原料的研究勢在必行。桑葉的蛋白質(zhì)含量較高，富含功能活性物質(zhì)[1-2]，且在我國有較大的資源優(yōu)勢。目前，桑葉已在畜禽飼料中廣泛應(yīng)用[3-4]。本課題組前期研究證實，飼料中添加10%的桑葉不會影響羅非魚的生長性能，還可以有效調(diào)節(jié)其脂質(zhì)代謝，改善肌肉品質(zhì)[5]。但桑葉的消化率較低[6]，影響其在水產(chǎn)飼料中的添加量。研究發(fā)現(xiàn)，桑葉發(fā)酵后可以提高其替代魚飼料中魚粉的量[7-8]。迄今，尚未見桑葉發(fā)酵蛋白在羅非魚上的相關(guān)研究。為此，本試驗以吉富羅非魚(GIFT,Oreochromisniloticus)為研究對象，研究桑葉發(fā)酵蛋白替代魚粉對其生長、代謝以及血液指標的影響，以期為桑葉在水產(chǎn)飼料中的合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

以魚粉(秘魯直火烘干紅魚粉，粗蛋白質(zhì)含量為64.5%)、豆粕(預(yù)壓浸提，粗蛋白質(zhì)含量為46%)、菜籽粕(預(yù)壓浸提，粗蛋白質(zhì)含量為38%)和棉籽粕(預(yù)壓浸提，粗蛋白質(zhì)含量為46%)為主要蛋白質(zhì)源，以豆油為脂肪源配制基礎(chǔ)飼料(粗蛋白質(zhì)含量為32%，總能為15 MJ/kg)。在基礎(chǔ)飼料中用桑葉發(fā)酵蛋白(采用乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌和固氮菌進行固態(tài)發(fā)酵而成，粗蛋白質(zhì)含量為22.5%)，分別替代0(對照)、40%和80%的魚粉，相應(yīng)的桑葉發(fā)酵蛋白添加水平為0、4%和8%，調(diào)節(jié)豆粕和面粉的用量，配制成3種等氮等能的試驗飼料，其組成及營養(yǎng)水平見表1。各飼料原料粉碎過60目篩，采取逐級稀釋法混合均勻，制成粒徑分別為2.5和4.0 mm的硬顆粒飼料，風干后放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎(chǔ))

1)維生素預(yù)混料為每千克飼料提供Vitamin premix provided the following per kg of diets：VA 16.67 mg，VD33.33 mg，VE 26.67 mg，VC 333.33 mg，VB18 mg，VB64 mg，VB120.03 mg，VK33.33 mg，核黃素 riboflavin 3.33 mg，肌醇 inositol 66.67 mg，泛酸 pantothenic acid 20 mg，煙酸 niacin 23.33 mg，葉酸 folic acid 1.33 mg，生物素 biotin 0.04 mg，乙氧基喹啉 ethoxyquin 100 mg，次粉 wheat middling 9.39 g。

2)礦物質(zhì)預(yù)混料為每千克飼料提供Mineral premix provided the following per kg of diets：KCl 133.33 mg，KI 40 mg，CoCl2·6H2O 4.67 mg，CuSO4·5H2O 9.33 mg，F(xiàn)eSO4·H2O 266.67 mg，ZnSO4·H2O 133.33 mg，MnSO4·H2O 53.33 mg，Na2SeO3·5H2O 43.33 mg，MgSO4·7H2O 2 000 mg，Ca(H2PO4)2·H2O 13.33 g，NaCl 90.67 mg。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗魚選用當年培育的體質(zhì)健壯、規(guī)格整齊的雄性吉富羅非魚(平均體重約為40 g)270尾，隨機分成3個組，每個組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)30尾。在室內(nèi)淡水循環(huán)水族缸(有效體積為300 L)中飼養(yǎng)試驗魚8周，日投飼率為體重的3%～5%，每天08:00、12:30、17:00各投喂1次。水源為曝氣自來水，試驗期間水溫為(27.5±2.4) ℃，pH為7.6±0.5，溶解氧濃度>6.6 mg/L，氨氮濃度<0.52 mg/L，亞硝酸鹽氮濃度<0.08 mg/L。

1.3 樣品制備與分析

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，禁食24 h后稱重，每個重復(fù)隨機取3尾魚作為全魚樣品，用于體組成的測定；每個重復(fù)隨機取4尾魚，用MS-222進行麻醉，測體長、體高，分離出內(nèi)臟、肝胰臟，用于形體指標的測定；每個重復(fù)隨機取5尾魚于尾靜脈取血，一部分現(xiàn)場采用上海強生血糖儀測定全血中葡萄糖(血糖)含量，另一部分于4 000×g4 ℃條件下離心10 min，收集血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

飼料原料及全魚樣品均在105 ℃烘干至恒重，然后采用凱氏定氮法測定粗蛋白質(zhì)含量，索氏抽提法測定粗脂肪含量，高溫(550 ℃)灼燒法測定粗灰分含量，采用鉬黃分光光度法測定總磷含量，采用GR3500氧彈式熱量計測定飼料總能。

血清代謝指標均采用全自動生化分析儀(日立7100)測定，包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性以及總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量。血清超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒進行測定。蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍法測定。

1.4 計算公式

特定生長率(SGR,%/d)=100×

[ln末重(g)-ln初重(g)]/試驗天數(shù)(d)；

飼料系數(shù)(FCR)=總干物質(zhì)攝食量(g)/

魚體總增重(g)；

蛋白質(zhì)效率(PER,%)=100×體增重(g)/

蛋白質(zhì)攝取量(g)；

攝食率(FR,%/d)=100×干物質(zhì)攝食量(g)/

{試驗天數(shù)(d)×[末重(g)+初重(g)]/2}；

成活率(SR,%)=100×試驗?zāi)~尾數(shù)(尾)/

試驗初魚尾數(shù)(尾)；

肥滿度(CF,%)=100×體重(g)/體長(cm)3；

臟體比(VSI,%)=100×內(nèi)臟重(g)/體重(g)；

肝體比(HSI,%)=100×肝胰臟重(g)/體重(g)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 17.0對所得數(shù)據(jù)用單因素方差分析(one-way ANOVA)及Tukey’s 多重比較進行處理。試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤表示，顯著性水平設(shè)置為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉發(fā)酵蛋白對羅非魚生長性能的影響

由表2可知，桑葉發(fā)酵蛋白添加水平為4%(替代40%魚粉)時不影響羅非魚的生長(P>0.05)。而桑葉發(fā)酵蛋白添加水平為8%(替代80%魚粉)時顯著降低羅非魚的末重、特定生長率和蛋白質(zhì)效率(P<0.05)。各組羅非魚的成活率均為100%，飼料系數(shù)和攝食率均無顯著差異(P>0.05)。

表2 桑葉發(fā)酵蛋白對羅非魚生長性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩標無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

In the same row, values with no or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 桑葉發(fā)酵蛋白對羅非魚形體指標和體組成的影響

由表3可知，飼料中添加8%桑葉發(fā)酵蛋白顯著降低羅非魚的臟體比和肝體比(P<0.05)，而添加4%桑葉發(fā)酵蛋白則無顯著影響(P>0.05)。各組羅非魚的肥滿度以及全魚水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪和粗灰分含量均無顯著差異(P>0.05)。

表3 桑葉發(fā)酵蛋白對羅非魚形體指標和體組成的影響

2.3 桑葉發(fā)酵蛋白對羅非魚血清代謝指標和血糖含量的影響

由表4可知，飼料中添加高水平(8%)桑葉發(fā)酵蛋白顯著降低羅非魚血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇和血糖含量(P<0.05)，顯著增加血清高密度脂蛋白膽固醇含量(P<0.05)，提高高密度脂蛋白膽固醇/總膽固醇(P<0.05)。而上述這些指標在低水平(4%)桑葉發(fā)酵蛋白添加組與對照組間無顯著差異(P>0.05)。隨桑葉發(fā)酵蛋白替代魚粉水平的增加，羅非魚血清高密度脂蛋白膽固醇/低密度脂蛋白膽固醇顯著升高(P<0.05)。

表4 桑葉發(fā)酵蛋白對羅非魚血清代謝指標和血糖含量的影響

3 討 論

3.1 桑葉發(fā)酵蛋白對羅非魚生長性能的影響

從本試驗結(jié)果可以看出，飼料中添加高水平(8%)桑葉發(fā)酵蛋白會降低羅非魚的生長效果。這與在蛋雞上的研究結(jié)果一致[4]。而研究表明飼料中添加10%桑葉不會影響羅非魚的生長性能[5]。這表明飼料中桑葉的添加水平因動物種類、飼料配方不同而存在差異。研究表明，桑葉發(fā)酵蛋白是印度囊鰓鯰(Heteropneustesfossilis)較好的飼料蛋白質(zhì)源，與魚下腳料配合使用能替代75%魚粉[7]。隨后在巴塔野鯪(L.bata)[9]研究中發(fā)現(xiàn)飼料中粗纖維含量低于5.63%時，桑葉發(fā)酵蛋白可以替代50%的魚粉(基礎(chǔ)飼料中魚粉的比例為20%)。Kaviraj等[8]的研究進一步證實，桑葉發(fā)酵蛋白是南亞野鯪(Labeorohita)的優(yōu)質(zhì)飼料蛋白質(zhì)源，與魚類下腳料配合使用可替代飼料中80%的魚粉。本試驗結(jié)果也證實，桑葉發(fā)酵蛋白替代40%的魚粉不會影響羅非魚的生長。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，飼料中添加高水平桑葉發(fā)酵蛋白可以顯著降低羅非魚的肝體比、臟體比，改善肝臟健康，提高胴體率，符合肉食品消費發(fā)展趨勢。這些結(jié)果表明，桑葉發(fā)酵后在水產(chǎn)飼料中的合理利用是可行的，其替代魚粉的比例因魚種或試驗?zāi)康牟煌兴町?。盡管發(fā)酵工藝可以降低或去除桑葉中丹寧和植酸等抗營養(yǎng)因子的含量[10]，但桑葉中粗纖維含量仍然較高，影響消化酶的活性，降低飼料中營養(yǎng)成分的消化率[11-12]。這可能是飼料中添加高水平(8%)桑葉發(fā)酵蛋白替代80%魚粉不能改善羅非魚生長性能的原因。

飼料中植物蛋白質(zhì)源替代魚粉往往因飼料適口性差導(dǎo)致試驗動物攝食率降低，進而影響動物的生長性能[13]。本研究中，飼料中添加桑葉發(fā)酵蛋白并沒有影響羅非魚的攝食量，與之前本課題組在羅非魚[7]上的研究結(jié)果一致。這表明桑葉發(fā)酵前后均未影響羅非魚飼料的適口性。同樣，在印度囊鰓鯰[7]、南亞野鯪[8]和巴塔野鯪[10]上的研究也未發(fā)現(xiàn)飼料中添加桑葉發(fā)酵蛋白影響?zhàn)B殖魚類攝食量的現(xiàn)象。

3.2 桑葉發(fā)酵蛋白對羅非魚糖脂代謝的影響

研究表明，桑葉因富含黃酮、多糖、生物堿等功能活性成分實現(xiàn)多種途徑降糖降脂功效[1,14]。目前，桑葉已在畜禽飼料中廣泛應(yīng)用，不僅能夠改善動物的生長性能，還可以通過調(diào)節(jié)糖脂代謝來改善肉、蛋品質(zhì)[3-4]。本試驗結(jié)果表明，飼料中添加桑葉發(fā)酵蛋白顯著降低羅非魚血脂含量，而且具有劑量依賴性，與本課題組之前關(guān)于桑葉在羅非魚上的研究結(jié)果[7]一致。這進一步闡明桑葉可調(diào)節(jié)羅非魚體脂的轉(zhuǎn)化和代謝。一些黃酮類成分被證明可以激活卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶[15]，或抑制腸道內(nèi)膽固醇的吸收，提高血清高密度脂蛋白膽固醇/低密度脂蛋白膽固醇[16]，從而加速膽固醇轉(zhuǎn)運和代謝。Park等[1]從分子水平證實桑葉提取物通過調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖劑激活受體(PPARs)和脂蛋白脂酶(LPL)mRNA表達來調(diào)節(jié)機體的脂質(zhì)代謝。本試驗中，飼料添加高水平(8%)桑葉發(fā)酵蛋白可提高羅非魚血清高密度脂蛋白膽固醇/總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇/低密度脂蛋白膽固醇，因此推測桑葉可能通過這些途徑抑制血脂含量的升高。

桑葉中含有的生物堿1-脫氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin，DNJ)[17]和黃酮類物質(zhì)[11]能夠抑制動物腸道刷狀緣膜上二糖酶活性，減緩腸道對碳水化合物的消化和吸收，同時具有調(diào)控肝臟中糖代謝過程關(guān)鍵酶活性的作用，從而調(diào)控機體中糖、脂肪、蛋白質(zhì)的代謝和轉(zhuǎn)化[18]。本試驗結(jié)果顯示，飼料中添加高水平(8%)桑葉發(fā)酵蛋白顯著降低羅非魚血糖含量，與本課題組相關(guān)研究結(jié)果[7]一致。也有研究指出，桑葉中黃酮是通過提高機體抗氧化能力，促進胰島素分泌，加快葡萄糖氧化分解這種途徑來達到降低血糖含量的作用[19]。桑葉中不同有效成分降血糖的機制不一，桑葉的降血糖作用涉及到了c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路[20]。由此可見，桑葉降血糖的機制是比較復(fù)雜的，桑葉究竟通過何種途徑起到降血糖的作用，有待于深入研究。眾所周知，魚類對碳水化合物的利用能力較低，與哺乳動物的Ⅱ型糖尿病癥狀相似。因此，弄清桑葉在水產(chǎn)動物上的降糖機制，提升魚類對飼料糖的耐受能力，尤其是對于像羅非魚這種典型的雜食性魚類，具有重要的實踐意義。

4 結(jié) 論

低魚粉飼料(含5%魚粉)中，桑葉發(fā)酵蛋白替代40%的魚粉不會影響羅非魚的生長，替代80%的魚粉會顯著抑制羅非魚的生長，但可以降低羅非魚的血脂和血糖含量。

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*Corresponding author, associate professor, E-mail: linsm198@163.com

(責任編輯 菅景穎)

Replacement of Fish Meal with Fermented Mulberry Leaves Protein in Low Fish Meal Diets for Tilapia (Oreochromisniloticus)

CHEN Wenyan1,2CHEN Yongjun1,2PENG Xianghe1,2LIN Shimei1,2*HUANG Xianzhi3LI Yun1,2

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China;2.KeyLaboratoryofFreshwaterFishReproductionandDevelopmentofMinistryofEducation,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China; 3.InstituteofSericultureandSystemsBiology,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China)

In order to study the feasibility of replacement of fish meal with fermented mulberry leaves protein in low fish meal diets for tilapia (Oreochromisniloticus), three isonitrogenous (crude protein content was 32%) and isoenergetic (gross energy was 15 MJ/kg) experimental diets were formulated by replacing 0 (control), 40% and 80% fish meal with fermented mulberry leaves protein on basis of a practical diet (fish meal content was 5%), and the corresponding supplemental levels of fermented mulberry leaves protein were 0, 4% and 8%, respectively. Each diet was randomly assigned to 3 replicates of 30 genetically improved farmed tilapia (average body weight about 40 g). The experiment lasted for 8 weeks. The results showed as follows: the final body weight, specific growth rate (SGR) and protein efficiency ratio (PER) in the 80% replacement level group were significantly lower than those in the control group (P<0.05), but there were no significant differences between the 40% replacement level group and the control group (P>0.05). No significant differences were found in feed conversion ratio (FCR) and feeding rate (FR). The fish in the 80% replacement level group had the lowest values of viscera somatic index (VSI), hepatopancreas somatic index (HSI) and serum total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and blood glucose contents and the highest values of high density lipoprotein cholesterol (HDL-C) content, HDL-C/CHO and HDL-C/LDL-C, and the differences in those indices reached significance level between 80% replacement level group and 40% replacement level group or control group (P<0.05). There were no significant differences in condition factor (CF), and the contents of moisture, crude protein, ether extract and ash in whole body among all groups (P>0.05). In conclusion, the growth is not affected when 40% fish meal replacement with fermented mulberry leaves protein in the low fish meal diet (fish meal content is 5%), and 80% replacement level can inhibit growth, but effectively reduce blood glucose and lipid contents.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2015, 27(12)：3968-3974]

fermented mulberry leaves protein; fish meal; tilapia; growth

10.3969/j.issn.1006-267x.2015.12.039

2015-06-12

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303053);重慶市特色效益水產(chǎn)業(yè)關(guān)鍵技術(shù)集成示范項目(40808513)

陳文燕(1990—),女,重慶人,碩士研究生,從事水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料研究。E-mail: 610602643@qq.com

*通信作者：林仕梅，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail: linsm198@163.com

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