動物源性食品中β-腎上腺素受體興奮劑殘留研究

黎 俊 顧麗群 王明進 熊和琴 何 虎 李 雷 李宣敏

(畢節(jié)市動物產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗所，畢節(jié)551700)

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動物源性食品中β-腎上腺素受體興奮劑殘留研究

黎 俊 顧麗群*王明進*熊和琴 何 虎 李 雷 李宣敏

(畢節(jié)市動物產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗所，畢節(jié)551700)

β-腎上腺素受體興奮劑(簡稱β-興奮劑)具有降低動物體內(nèi)脂肪含量，促進蛋白質(zhì)合成和提高飼料轉(zhuǎn)化率的作用，常被用作飼料添加劑用于畜產(chǎn)品的生產(chǎn)，但由于其在動物體內(nèi)的殘留并通過食物鏈最終進入人體，給人類健康帶來潛在威脅，大多數(shù)國家已頒布一系列法律法規(guī)明令禁止在畜牧業(yè)中使用該類藥物。本文通過介紹β-興奮劑的作用機制、檢測標(biāo)準和檢測方法，為今后該類藥物殘留的研究提供參考。

β-興奮劑；β-腎上腺素受體；殘留；作用機制；檢測標(biāo)準；檢測方法

β-腎上腺素受體興奮劑(β-adrenoceptor agonists)，簡稱β-興奮劑或β-激動劑(β-agonists)，是一類化學(xué)結(jié)構(gòu)和生理功能類似2種天然β-激動劑[腎上腺素和去甲腎上腺素(norepinephrine)]的苯乙胺類(phenethylamines，PEAs)化學(xué)合成衍生物，因能選擇性地與動物體內(nèi)大多數(shù)組織細胞膜上的β-腎上腺素受體(β-adrenergic receptor，β-AR)結(jié)合而得名[1-2]。從結(jié)構(gòu)上看，β-興奮劑類藥物具有苯乙醇胺結(jié)構(gòu)母核(圖1)，苯環(huán)上連接堿性的β-羥胺側(cè)鏈，側(cè)鏈取代基通常有N-叔丁基、N-異丙基或N-烷基苯，能與大多數(shù)無機酸和有機酸成鹽[3]。早在1933年，Easson等[4]研究指出，β-興奮劑與受體結(jié)合的3個主要活性位點是β-羥基基團、脂肪氮和芳香環(huán)，其中芳香環(huán)是β-興奮劑與受體結(jié)合發(fā)生生物學(xué)效應(yīng)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，苯環(huán)上取代基通常有羥基、鹵素、氨基、羥甲基、氰基或它們的結(jié)合。根據(jù)苯環(huán)上取代基的差異，可將β-興奮劑分為苯胺型和苯酚型。苯胺型結(jié)構(gòu)中具有芳伯氨基，中等極性，典型藥物有克倫特羅(clenbuterol)、馬布特羅(mabuterol)、西馬特羅(cimaterol)和溴布特羅(brombuterol)等。苯酚型結(jié)構(gòu)一般在母核苯環(huán)上的C3～C5位含有1～2個酚羥基，極性高。根據(jù)母核苯環(huán)上羥基取代基的位置或數(shù)量，苯酚型結(jié)構(gòu)又可分為苯酚型、鄰或間苯二酚型和水楊醇型，其中具有苯酚型結(jié)構(gòu)的有萊克多巴胺(ractopamine)、苯氧丙酚胺(isoxsuprine)和利托君(ritodrine)等；鄰苯二酚型(兒茶酚型)結(jié)構(gòu)的有異丙腎上腺素(isoproterenol)、去甲腎上腺素和多巴酚丁胺(dobutamine)等；間苯二酚型(雷索酚型)結(jié)構(gòu)的有特布他林(terbutaline)、非諾特羅(fenoterol)和異丙喘寧(metaproterenol)等；水楊醇型結(jié)構(gòu)的有沙丁胺醇(salbutamol)、帕布特羅(pirbuterol)和沙美特羅(salmeterol)等。一些常見的β-興奮劑結(jié)構(gòu)如圖2。

在醫(yī)學(xué)上，β-興奮劑屬擬交感神經(jīng)類作用藥，具有松弛平滑肌，擴張支氣管的作用，常用來治療支氣管哮喘類病癥[5]。20世紀80年代有研究表明，β-興奮劑能影響營養(yǎng)物質(zhì)在動物體內(nèi)的流向和重新分配，使動物體內(nèi)脂肪代謝增強，蛋白質(zhì)合成增加，可以明顯提高胴體瘦肉率和飼料利用率[6-7]。同時，大多數(shù)β-興奮劑具有口服活性和熱穩(wěn)定性，因而被非法作為飼料添加劑用于畜產(chǎn)品的生產(chǎn)，以促進動物生長和改善肉質(zhì)。但是，該類藥物殘留會聚集在動物可食用組織中，如果違法超量使用將會引起心悸、頭疼、目眩、惡心甚至損害肝臟和腎臟等毒副作用[8-9]，因而包括我國在內(nèi)的許多國家已明令禁止將此類藥物作為飼料添加劑用于畜產(chǎn)品的生產(chǎn)。世界上使用最廣泛的β-興奮劑有克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺等，近年來，由于世界范圍內(nèi)對其禁用，其他β-興奮劑如馬布特羅、溴布特羅和馬噴特羅等的使用也越來越多，而且當(dāng)一種藥物被禁用時，不斷有新的β-興奮劑作為替代品出現(xiàn)，嚴重影響人類健康，所以關(guān)于β-興奮劑的研究一直是動物營養(yǎng)領(lǐng)域中的熱點。本文就從β-興奮劑的作用機制、檢測標(biāo)準和檢測方法3個方面綜述了其研究進展。

圖1 β-興奮劑的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖2 常見β-興奮劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 β-興奮劑的作用機制

1.1 β-AR及亞型

β-AR幾乎存在于所有哺乳動物細胞膜上，是一種鑲嵌于細胞膜脂質(zhì)雙層中的整合糖蛋白，由1條氨基酸鏈，400多個氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量約64 ku[11-12]。β-AR包括7個疏水性α螺旋結(jié)構(gòu)的跨膜結(jié)構(gòu)域，受體分子通過該結(jié)構(gòu)被錨定于細胞膜上，并且在細胞質(zhì)膜內(nèi)外分別形成3個環(huán)狀親水性跨膜結(jié)構(gòu)域。β-AR與配體結(jié)合位點位于7個跨膜結(jié)構(gòu)域的中心，而與Gs蛋白反應(yīng)的位點位于細胞內(nèi)的3個環(huán)狀結(jié)構(gòu)上[12-13]。β-AR的結(jié)構(gòu)模型見圖3。

β-AR包括3個亞型：β1-AR、β2-AR和β3-AR。其中，β3-AR是人們在20世紀70年代中期研究脂肪組織時發(fā)現(xiàn)的，其與β1-AR和β2-AR不同的是幾種β1-AR、β2-AR的拮抗劑對β3-AR具有一定的興奮作用[14]。大多數(shù)動物細胞內(nèi)都存在β-AR，但其亞型分布和比例因動物種類和組織來源而異。β1-AR主要分布于心臟和脂肪細胞膜上，與提高心率和心臟輸出能力、脂肪細胞脂解和能量生成有關(guān)。β2-AR主要分布于骨骼肌、平滑肌和肝臟細胞膜上，與氣管和支氣管松弛、骨骼肌收縮以及血管平滑肌松弛有關(guān)。另外，在心臟中也存在少量β2-AR。在大鼠上研究發(fā)現(xiàn)，β3-AR主要存在于棕色脂肪和白色脂肪組織中，同時也存在于腸骨骼肌、心肌上，其藥理作用與β1-AR和β2-AR有明顯區(qū)別。研究表明，這3種β-AR亞型在同種動物體內(nèi)氨基酸序列的同源性接近50%，不同動物物種之間，同種受體的同源性可達75%或更高[15]。

1.2 β-興奮劑的作用機制

β-AR的生理功能主要是由于β-興奮劑與β-AR結(jié)合，形成的復(fù)合物激活了Gs蛋白，從而使機體發(fā)生一系列生理生化反應(yīng)的過程。

當(dāng)β-興奮劑與β-AR的跨膜3、5、6功能區(qū)結(jié)合后將引起β-AR構(gòu)象的改變，激活Gs蛋白，然后Gs蛋白的α亞基與三磷酸鳥苷(GTP)結(jié)合并催化釋放二磷酸鳥苷(GDP)，Gs蛋白的α亞基結(jié)合GTP后從Gs蛋白上解離，從Gs蛋白解離下的α亞基進而激活腺苷酸環(huán)化酶并催化產(chǎn)生環(huán)磷酸腺苷(cAMP)，cAMP又作為第二信使與蛋白激酶A的調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，并使蛋白激酶A釋放其催化亞基，導(dǎo)致細胞內(nèi)多種酶被磷酸化，被磷酸化后的酶部分被激活(如激素敏感脂酶、脂肪細胞甘油三酯降解限速酶等)或抑制(如乙酰輔酶A羧化酶、長鏈脂肪酸生物合成限速酶等)[16-17]，被激活的酶促進脂肪分解，被抑制的酶抑制脂肪合成，最終降低脂肪沉積，β-興奮劑的作用機制見圖4。

H2N—：氨基amino；HO—：羥基hydroxy；COOH—：羧基carboxy；—S—S—：二硫鍵disulfide bond。

圖3β-AR的結(jié)構(gòu)模型

Fig.3 Projected structure ofβ-AR[16]

2 β-興奮劑殘留的檢測標(biāo)準和檢測方法

2.1 β-興奮劑殘留的檢測標(biāo)準

1999年9月13日，我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布了關(guān)于修訂《動物性食品中獸藥最高殘留限量》[18]的公告(農(nóng)牧發(fā)[1999]17號)，首次規(guī)定了克倫特羅在馬和牛肌肉、內(nèi)臟、腎臟及牛奶中的最高殘留限量(MRL)分別為0.1、0.5、0.5、0.05 μg/kg，而美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)和世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定的克倫特羅在動物體內(nèi)的MRL為：肌肉0.2 μg/kg、肝臟0.6 μg/kg、腎臟0.6 μg/kg、脂肪0.2 μg/kg、奶0.05 μg/kg。由此可見，我國政府規(guī)定的MRL略低于FDA和WHO的標(biāo)準。2002年12月，農(nóng)業(yè)部第235號公告修訂了《動物性食品中獸藥最高殘留限量》，同時廢除農(nóng)牧發(fā)[1999]17號。該規(guī)定指出，克倫特羅在所有動物性食品中不得檢出。

近年來，我國衛(wèi)生部、農(nóng)業(yè)部和國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局發(fā)布了關(guān)于檢測沙丁胺醇、鹽酸克倫特羅和萊克多巴胺等β-興奮劑殘留的國家標(biāo)準和行業(yè)標(biāo)準(表1)[19-22]，并且全國各省、自治區(qū)、直轄市以及地(州)縣均設(shè)立了質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督部門和產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗機構(gòu)，加大了對食品安全(特別是藥物殘留)監(jiān)管和檢測力度，建立了一套相對完善的β-興奮劑殘留檢測標(biāo)準，為β-興奮劑殘留的確證提供依據(jù)。

β-AR：β-腎上腺素受體β-adrenergic receptor；ATP：三磷酸腺苷 adenosine triphosphate；cAMP：環(huán)磷酸腺苷 cyclic adenosine monophosphate。

圖4β-興奮劑的作用機制

Fig.4 Acting mechanism ofβ-agonists[11]

2.2 β-興奮劑殘留的檢測方法

理想的β-興奮劑的檢測過程應(yīng)包括有效提取、分離凈化和高靈敏的檢測。β-興奮劑殘留的檢測分析方法包括色譜法，如高效液相色譜(HPLC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)和氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)等；免疫分析法(IA)，如酶聯(lián)免疫測定法[酶聯(lián)免疫分析法(enzyme-linked immunoassay,EIA)和酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)]、放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)、熒光免疫分析法(fluorescence immunoassay,FIA)等；生物技術(shù)測定法，如生物傳感器(biosensor,BS)技術(shù)、生物芯片(biochip)技術(shù)等。β-興奮劑殘留的檢測方法雖多，但各有其優(yōu)缺點。色譜法在檢測β-興奮劑中具有靈敏度高、檢測結(jié)果最為準確的特點，可作為最終的確證性檢測方法，但樣品前處理繁瑣、操作費時，并需要昂貴的儀器及專業(yè)的人員操作，不適合大批量樣品的檢測。然而，免疫分析法，尤其是ELISA卻能克服以上缺點，具有快速、靈敏、操作簡便等優(yōu)點，非常適合大批量樣品的檢測，檢測結(jié)果與HPLC、GC-MS具有較高的一致性，起到很好的檢測篩選作用，其缺點是容易出現(xiàn)假陽性。

2.2.1 色譜法

HPLC是近年來發(fā)展速度快，具有高效分離和檢測能力的方法，我國將其作為“瘦肉精”殘留檢測的半確證法，其最低檢出限為0.05 μg/kg。在技術(shù)上，HPLC設(shè)備采用高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，具有分離速度快、分離效率高、檢測結(jié)果準確和假陽性率低等優(yōu)點，但也存在檢測過程繁瑣、檢測時間長、不易操作等缺點[23]。HPLC檢測一般先將樣品中蛋白質(zhì)去除，然后再經(jīng)過柱凈化和富集，最后上機檢測分析[24]。

GC-MS是β-興奮劑殘留檢測中最常用的定量和確證方法。與HPLC類似，在檢測前需要將樣品進行去蛋白質(zhì)處理，然后再經(jīng)過提取和凈化，但由于β-興奮劑不易被氣化，因而樣品經(jīng)過提取和凈化后還需進行衍生化處理才能進行氣相色譜儀檢測[11]。與HPLC相比，GC-MS靈敏度更高，假陽性率更低，并且可以對多種殘留物進行定性和定量分析，我國已將其作為β-興奮劑殘留檢測的確證法。GC-MS的缺點與HPLC類似，儀器昂貴、操作較難，在實際檢測中，建議將該法與ELISA結(jié)合起來，先用ELISA進行初步篩選，再用GC-MS進行確證較為理想。

表1 β-興奮劑的檢測標(biāo)準

LC-MS/MS能提供更詳細的藥物結(jié)構(gòu)信息，受干擾少，比GC-MS具有更高的特異性和靈敏性。但LC-MS/MS設(shè)備價格昂貴，樣品前處理繁瑣，檢測速度慢[1]。

2.2.2 IA

IA是根據(jù)抗原與抗體的特異性免疫反應(yīng)原理而建立起來的檢測分析技術(shù)。按示蹤物及標(biāo)記種類差異，IA可分為RIA、FIA、EIA、化學(xué)發(fā)光免疫分析法(chemiluminescence immunoassay,CIA)、膠體金免疫分析法(colloidal gold immunoassay,CGIA)、時間分辨免疫熒光測定(time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)和毛細管電泳免疫分析(capillary electrophoresis based immunoassay,CEIA)等[11]，本文重點介紹EIA、CGIA、TRFIA、CEIA。

ELISA是在酶免疫技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型的免疫測定技術(shù)，也是目前應(yīng)用最多的一種免疫分析技術(shù)，其基本原理是采用抗原與抗體的特異性免疫反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，進行定量測定。該方法具有操作方便、檢測迅速等優(yōu)點，歐盟已將其作為β-興奮劑殘留檢測的首選篩檢方法，但該技術(shù)檢測結(jié)果可能存在假陽性，不能實現(xiàn)在線檢測等缺點[1]，結(jié)合其他定性定量檢測最為理想。近年來，一些新的免疫技術(shù)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)成為有效的研究手段，如CGIA，樣品無需預(yù)處理，可進行在線檢測。張慧嫦等[25]用CGIA快速檢測動物組織中鹽酸克倫特羅殘留，分析過程僅需5 min，檢出限達0.5 ng/mL。姜金慶等[26]利用膠體金作為示蹤物，采用抗體標(biāo)記模式，成功研制出同時檢測克倫特羅和萊克多巴胺的多殘留膠體金免疫層析試紙條，整個實驗過程可在5～8 min內(nèi)憑肉眼觀察結(jié)果，操作簡單，非常適合現(xiàn)場檢測。

TRFIA技術(shù)是一種新型的超微量非放射性標(biāo)記免疫分析技術(shù)，它常用三價稀土離子及其螯合物作為示蹤物，以代替放射性同位素、熒光物質(zhì)、酶和化學(xué)發(fā)光物質(zhì)來標(biāo)記抗原、抗體、核酸探針等物質(zhì)[27]。當(dāng)免疫反應(yīng)發(fā)生后，用時間分辨熒光儀測定最后產(chǎn)物中的熒光強度，根據(jù)熒光強度和相對熒光強度比值，判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，以達到定量檢測的目的[28]。該方法具有高精度、自動化、示蹤物穩(wěn)定、大樣本快速檢測(1～2 h就能出結(jié)果)等優(yōu)點，已逐步成為生物醫(yī)學(xué)研究和臨床超微量生化檢驗中一項最有發(fā)展前景的分析手段[29]，但在β-興奮劑類殘留檢測方面的報道很少。何明祥[27]采用銪離子(Eu3+)標(biāo)記的Sal-OVA抗原為示蹤物，利用TRFIA建立起快速、高靈敏度的豬尿液中沙丁胺醇全自動檢測方法，檢測靈敏度為0.04 ng/mL，平均回收率達106.5%。

CEIA是將免疫反應(yīng)基本原理與毛細管電泳分離檢測方法相結(jié)合的一種分析新技術(shù)，該技術(shù)利用抗原抗體復(fù)合物與游離抗原、抗體在電泳上的行為差異，將毛細管電泳作為分離分析手段[30]。CEIA技術(shù)最早可追溯到1986年Hurrell利用毛細管電泳進行抗原、抗體和半抗原的分離開始，此后，隨著儀器自動化的發(fā)展，到2013年底，據(jù)不完全統(tǒng)計，發(fā)表在國內(nèi)外期刊上關(guān)于毛細管電泳的文章已達7 000余篇，但大多數(shù)都是關(guān)于臨床和藥物分析方面，而關(guān)于β-興奮劑檢測的文獻很少。

IA一般作為篩選方法，由于樣品中待測物結(jié)構(gòu)信息少，易出現(xiàn)假陽性，故該方法需結(jié)合其他定性定量檢測技術(shù)進行最終確證。

2.2.3 生物技術(shù)測定法

BS技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一項用于檢測β-興奮劑類藥物的新技術(shù)，BS是由固定化的生物敏感材料作為識別元件，再結(jié)合適當(dāng)?shù)睦砘瘬Q能器及信號輸出顯示裝置所構(gòu)成的分析工具或系統(tǒng)。BS的基本原理是當(dāng)傳感器的分子識別元件與被檢測物接觸后，通過引發(fā)化學(xué)變化、光變化和熱變化產(chǎn)生電信號，再經(jīng)過信號輸出裝置將電信號輸出顯示進行檢測的方法。Traynor等[31]和Lu等[32]利用表面等離子體共振BS技術(shù)分別檢測了肝臟組織中β-興奮劑和豬肌肉組織中萊克多巴胺殘留量均取得很好效果。BS與計算機緊密結(jié)合，實現(xiàn)采樣、進樣、顯示、分析等的自動化是未來BS技術(shù)檢測β-興奮劑殘留發(fā)展的方向。

生物芯片技術(shù)是生命科學(xué)領(lǐng)域中迅速崛起的一項高新技術(shù)，被喻為21世紀生命科學(xué)的支撐技術(shù)，是自20世紀90年代中期以來影響最深遠的重大科技進展之一。其基本原理是通過在玻璃片、硅片等材料上固定樣本，通過微加工技術(shù)以實現(xiàn)對核酸、蛋白質(zhì)、化合物等準確、快速、高通量的檢測分析[33]。與其他方法相比，生物芯片技術(shù)的突出優(yōu)點是能夠在短時間內(nèi)檢測大量的分子，如飼料中β-興奮劑類添加劑和獸藥殘留等的檢測[34]。李琴等[35]利用生物芯片技術(shù)同時測定乳和乳粉中β-興奮劑類殘留量，得出其最低檢出限為0.1 μg/kg，回收率達99%以上。

3 小 結(jié)

近年來，盡管國內(nèi)外都加大了對β-興奮劑類藥物的監(jiān)管和檢測力度，但仍然存在將其作為飼料添加劑應(yīng)用于畜產(chǎn)品生產(chǎn)的情況，引起食品安全的事件時有發(fā)生。因此，盡快建立一套完善的、快速的β-興奮劑類藥物殘留的檢測方法，對進一步健全和完善我國食品安全保障體系，保護人類健康，促進經(jīng)濟社會發(fā)展具有重要意義。一套完善快速的檢測體系應(yīng)著重從以下方面展開研究：縮短樣品預(yù)處理時間，增加樣品預(yù)處理效率；擴大樣品殘留的檢測范圍；深入開展儀器操作的簡便化和自動化。

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[22] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.農(nóng)業(yè)部1629號公告-1-2011 飼料中16種β-受體激動劑的檢測 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[OL].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2011,

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*Corresponding authors: GU Liqun, senior livestock engineer, E-mail: 30986428@qq.com; WANG Mingjin, senior livestock engineer, E-mail: wangmj1967@163.com

(責(zé)任編輯 陳 燕)

Research ofβ-Adrenoceptor Agonists Residues in Foodstuffs of Animal Origin

LI Jun GU Liqun*WANG Mingjin*XIONG Huoqin HE Hu LI Lei LI Xuanmin

(BijieAnimalProductsQualitySecuritySupervisionandInspectionCenter,Bijie551700,China)

β-adrenoceptor agonists (β-agonists for short) possess the capacity to regulate nutrient metabolism in an animal body, such as decreasing fat content, promoting protein synthesis and increasing feed efficiency. A lot of profit-oriented illegal users often use it as feed additive for animal products, but its residues in animal products eventually enter human body through food chain, which may pose potential risks to human health, so many countries have passed a series of laws and regulations to prohibit the use ofβ-agonists in animal husbandry. This article reviewed the mechanisms of action, standards and methods of detection ofβ-agonists, which would provide the reference in the study ofβ-agonists residues.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2015, 27(12)：3663-3670]

β-agonists；β-adrenoceptor； residues； mechanisms of action; standards of detection; methods of detection

10.3969/j.issn.1006-267x.2015.12.003

2015-07-02

國家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目(2012GB2F200408)；國家絨毛用羊產(chǎn)業(yè)體系建設(shè)項目(CARS-40-30，CARS-40-461)

黎 俊(1986—)，男，貴州遵義人，畜牧師，碩士，主要從事動物營養(yǎng)與農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測方面的研究。E-mail： lijun8776@163.com

*通信作者：顧麗群，高級畜牧師，E-mail： 30986428@qq.com；王明進，高級畜牧師，E-mail： wangmj1967@163.com

S816.79

A

1006-267X(2015)12-3663-08