生物合成量子點(diǎn)在化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用

崔 然

(武漢大學(xué) 化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院, 生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北 武漢 430072)

生物合成量子點(diǎn)在化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用

崔 然

(武漢大學(xué) 化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院, 生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北 武漢 430072)

如何通過(guò)生物體系來(lái)解決化學(xué)難題是化學(xué)生物學(xué)的新領(lǐng)域之一?；罴?xì)胞合成CdSe量子點(diǎn)是利用活酵母細(xì)胞作為反應(yīng)器,通過(guò)調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)周期來(lái)耦合細(xì)胞內(nèi)不相關(guān)的兩條生化反應(yīng)途徑,使其在活酵母細(xì)胞內(nèi)發(fā)生反應(yīng),通過(guò)將傳統(tǒng)的CdSe量子點(diǎn)合成方法中涉及到的繁瑣危險(xiǎn)的化學(xué)操作演變?yōu)閮H僅‘喂養(yǎng)’細(xì)胞,即可獲得閃閃發(fā)光的CdSe量子點(diǎn)。該方法成功地建立了一個(gè)通過(guò)生物體系來(lái)解決化學(xué)難題的范例,并且實(shí)驗(yàn)方法溫和安全,實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有展示性,適合于課堂教學(xué)。

活酵母細(xì)胞; 化學(xué)生物學(xué); 量子點(diǎn)

化學(xué)生物學(xué)是現(xiàn)代化學(xué)與生物化學(xué)在深層面交叉的學(xué)科,誕生于上世紀(jì)九十年代。世界上一些著名的大學(xué)如美國(guó)哈佛大學(xué)和康奈爾大學(xué)等都設(shè)立了化學(xué)生物學(xué)系,著名的美國(guó)Scripps研究所也于二十世紀(jì)九十年代中葉成立了化學(xué)生物學(xué)研究所。國(guó)內(nèi)一些大學(xué)和研究機(jī)構(gòu)也分別設(shè)立了化學(xué)生物學(xué)研究中心、重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、化學(xué)生物學(xué)系和化學(xué)生物學(xué)專(zhuān)業(yè)[1],武漢大學(xué)也是較早設(shè)立化學(xué)生物學(xué)專(zhuān)業(yè)的學(xué)校之一。但是到目前為止,化學(xué)生物學(xué)仍然是一個(gè)新的、定義不太明確的領(lǐng)域[2-3]。

對(duì)于化學(xué)生物學(xué)這樣一門(mén)新興專(zhuān)業(yè)的課程教學(xué),尤其是其相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)課程的教學(xué),不像其他學(xué)科的實(shí)驗(yàn)教學(xué)有成熟的體系。另外,生命系統(tǒng)的復(fù)雜性決定了生命本質(zhì)的研究是一個(gè)極其漫長(zhǎng)的過(guò)程,這就決定了化學(xué)生物學(xué)這門(mén)學(xué)科是一個(gè)不斷推陳出新的前沿性的學(xué)科。并且化學(xué)以及生物學(xué)都是以實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的學(xué)科,如何通過(guò)實(shí)驗(yàn)教學(xué)向?qū)W生展示前沿的化學(xué)生物學(xué)的研究進(jìn)展成為了一個(gè)緊迫而艱巨的任務(wù)。

量子點(diǎn)(quantum dot,即半徑小于或接近激子玻爾半徑的半導(dǎo)體納米晶粒)[4]作為一類(lèi)性能優(yōu)良的熒光標(biāo)記納米材料,在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的突出優(yōu)勢(shì)和巨大潛力[4-7],已經(jīng)得到國(guó)際上的高度認(rèn)可。活細(xì)胞合成量子點(diǎn)是納米材料的研究領(lǐng)域中具有我國(guó)原創(chuàng)性的研究。通過(guò)對(duì)活酵母細(xì)胞的培養(yǎng)條件的控制,就可以在顯微鏡下直觀地看到細(xì)胞自身合成的閃閃發(fā)光的量子點(diǎn)[8]。該研究將繁瑣危險(xiǎn)的化學(xué)操作演變?yōu)閮H僅培養(yǎng)細(xì)胞,既可以培養(yǎng)學(xué)生在生物實(shí)驗(yàn)方面的動(dòng)手能力,又可以向?qū)W生展示出化學(xué)領(lǐng)域在納米材料方面的最新進(jìn)展,因此非常適合作為學(xué)生實(shí)驗(yàn)。目前,我們?cè)谝延械难芯抗ぷ鞯幕A(chǔ)上,已經(jīng)將部分研究成果簡(jiǎn)化為一個(gè)簡(jiǎn)便、易行的化學(xué)生物學(xué)本科教學(xué)實(shí)驗(yàn),并收到了良好的效果。

1 活酵母細(xì)胞合成量子點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)原理

傳統(tǒng)的CdSe量子點(diǎn)的合成通常采用金屬化合物/元素有機(jī)物路線(xiàn),其合成通常都采用易燃易爆有毒的有機(jī)試劑,并且需要在無(wú)水無(wú)氧的300 ℃的高溫下進(jìn)行[7-10],合成需要的條件苛刻,操作方法難以控制。這種傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法無(wú)論對(duì)環(huán)境還是操作者都有很大的潛在的危險(xiǎn)。

本文嘗試通過(guò)生物與化學(xué)的交叉來(lái)解決化學(xué)領(lǐng)域內(nèi)這些棘手的問(wèn)題。眾所周知,在生物體內(nèi)存在著各種高效、專(zhuān)一、溫和的酶促生化反應(yīng),雖然發(fā)生在活細(xì)胞中的這些生化反應(yīng)十分復(fù)雜,但是其指導(dǎo)原理在所有生物中都是相通的。如果能夠針對(duì)生化反應(yīng)的特點(diǎn)有目的地對(duì)其加以調(diào)節(jié)和控制,甚至對(duì)多個(gè)不同反應(yīng)途徑進(jìn)行調(diào)控,就能夠?qū)⑦@些高效的生化反應(yīng)體系引入到化學(xué)合成領(lǐng)域中,實(shí)現(xiàn)我們所期望的、原本不可能發(fā)生的反應(yīng)。

酵母細(xì)胞是具有清楚研究背景的模式生物[11-12],是合成熒光納米材料CdSe量子點(diǎn)的理想的候選生物。釀酒酵母(eukaryoticSaccharomycescerevisiae)是一個(gè)非常精密的微小的真核細(xì)胞,在其體內(nèi)有成千上萬(wàn)個(gè)生化反應(yīng)精確地調(diào)控著細(xì)胞自身的各種代謝過(guò)程[13-14]。它可以通過(guò)自身錯(cuò)綜復(fù)雜的調(diào)控體系對(duì)環(huán)境中各種各樣的變化產(chǎn)生快速精準(zhǔn)的反應(yīng)13。因此這樣的一種生物體不僅僅是基礎(chǔ)科研的一個(gè)良好的平臺(tái),更是生物工程和生命科學(xué)當(dāng)中的一個(gè)有力的工具[12,14]。

正是由于酵母細(xì)胞內(nèi)這些精密的生化反應(yīng),使得其在特定的條件下,可以分別通過(guò)對(duì)Na2SeO3的代謝產(chǎn)生帶有—SeH基團(tuán)的有機(jī)硒[15]以及對(duì)CdCl2的解毒形成穩(wěn)定的[Cd·(GS)2]2+[16],得到的這些物質(zhì)恰好是合成CdSe量子點(diǎn)的原料。但是這兩條代謝途徑在正常的酵母細(xì)胞內(nèi)是互不相關(guān)的,只有通過(guò)控制酵母細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間,使酵母細(xì)胞在發(fā)生Se代謝的同時(shí)發(fā)生CdCl2的解毒,從而在酵母細(xì)胞內(nèi)同時(shí)產(chǎn)生合成CdSe量子點(diǎn)的原料,隨后通過(guò)控制酵母細(xì)胞的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時(shí)間,最終成功地在30 ℃下細(xì)胞內(nèi)合成出來(lái)多種熒光顏色的CdSe量子點(diǎn),避免了高溫(300 ℃)或高壓，以及所有易燃、易爆、有毒的有機(jī)試劑。活酵母細(xì)胞合成CdSe量子點(diǎn)原理示意見(jiàn)圖1。

圖1 活酵母細(xì)胞合成CdSe量子點(diǎn)原理示意圖

2 活酵母細(xì)胞合成CdSe量子點(diǎn)技術(shù)在化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用

活酵母細(xì)胞合成CdSe量子點(diǎn)技術(shù)在化學(xué)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的應(yīng)用,具體來(lái)說(shuō)需要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行。

(1) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模孩倭私饨湍讣?xì)胞合成CdSe量子點(diǎn)的原理；②掌握酵母細(xì)胞的培養(yǎng)；③掌握酵母細(xì)胞合成CdSe量子點(diǎn)技術(shù)；(4)學(xué)習(xí)酵母細(xì)胞合成CdSe量子點(diǎn)的表征。

(2) 實(shí)驗(yàn)藥品及儀器：蛋白胨、葡萄糖、酵母提取物、水、0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液、0.1 mol/L的Na2SeO3溶液、0.1 mol/LCdCl2溶液、超純水；無(wú)菌操作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋、分析天平、超聲儀、無(wú)菌操作箱、搖床、離心機(jī)、倒置熒光顯微鏡。

3 實(shí)驗(yàn)步驟

(1) YPD培養(yǎng)基的配制。在無(wú)菌操作臺(tái)(見(jiàn)圖2)中進(jìn)行以下操作：先在燒杯中放入一半水量,然后按配方比例分別準(zhǔn)確稱(chēng)取葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物(葡萄糖20 g,蛋白胨20 g,酵母提取物10 g,水1000 mL),依次放入燒杯中,用玻璃棒攪拌使溶化后,補(bǔ)充水分到所需的總體積；隨后用0.1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH,直至pH值在7.2～7.6之間；將配好的培養(yǎng)基分裝到錐形瓶中,錐形瓶中液體培養(yǎng)基體積應(yīng)為1/5左右。錐形瓶口用專(zhuān)用封口膜封口,防止污染,同時(shí)保證有良好的通氣性能。三角燒瓶的封口膜外包一層牛皮紙,以防止滅菌時(shí)冷凝水潤(rùn)濕封口膜。注明培養(yǎng)基名稱(chēng)、配制日期等。培養(yǎng)基分裝好后立即用高壓蒸氣滅菌(0.56 kg/cm2,112.6 ℃,30 min),以防止雜菌生長(zhǎng)。

圖2 無(wú)菌操作臺(tái)

(2) 活酵母細(xì)胞合成CdSe量子點(diǎn)。

① 酵母細(xì)胞培養(yǎng)至生長(zhǎng)曲線(xiàn)的穩(wěn)定期。在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)的酒精燈附近,左手托住已培養(yǎng)出單菌落的酵母平板,用拇指和食指將平板打開(kāi)一定角度,用無(wú)菌竹簽從中挑取一個(gè)單菌落,放入20 mL的YPD培養(yǎng)基中,輕輕混勻,注意避免竹簽碰在燒瓶瓶口,封上封口膜,蓋好平板；將加有酵母單菌落的20 mL的YPD培養(yǎng)基放入搖床中,在30 ℃、170 r/min培養(yǎng)24 h至酵母細(xì)胞生長(zhǎng)穩(wěn)定期。

② 酵母細(xì)胞的硒化培養(yǎng)。在無(wú)菌操作臺(tái)中將生長(zhǎng)至穩(wěn)定期的酵母細(xì)胞用移液槍吸取1%(200 μL)移至20 mL新鮮的YPD培養(yǎng)基中,共取4份,封上封口膜,做好標(biāo)記；將此新鮮的YPD培養(yǎng)基放入搖床中,在30 ℃、170 r/min培養(yǎng)24 h； 向其中2份分別加入0.1 mol/L的Na2SeO3溶液(終濃度為5 mmol/L),封上封口膜,放入搖床中,在30 ℃、170 r/min培養(yǎng)24 h,分別標(biāo)記為1號(hào)和2號(hào)。另外2份不加0.1 mol/L的Na2SeO3溶液,繼續(xù)放在搖床中,分別標(biāo)記為3號(hào)和4號(hào)。將此4管放入搖床,在30 ℃、170 r/min培養(yǎng)24 h。

③ 酵母細(xì)胞合成CdSe量子點(diǎn)。將步驟②中4份酵母細(xì)胞分別轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管中,在轉(zhuǎn)速為2 000r/min的離心機(jī)中離心5 min,取出,傾去上清液后,將收集離心得到的酵母分別轉(zhuǎn)入4份20 mL新鮮的YPD培養(yǎng)基中,標(biāo)記為對(duì)應(yīng)的記號(hào)；在1號(hào)和3號(hào)新鮮的YPD培養(yǎng)基中加入0.1 mol/L的CdCl2溶液(終濃度為1 mmol/L),2號(hào)和4號(hào)不加CdCl2溶液,封上封口膜；放入搖床中,在30℃、170 r/min培養(yǎng)24 h。1號(hào)為樣品,2號(hào)—4號(hào)為對(duì)照。

(3) 酵母細(xì)胞合成的CdSe量子點(diǎn)的表征。將培養(yǎng)的4管細(xì)胞在轉(zhuǎn)速為2000 r/min的離心機(jī)中離心5 min,取出,傾去上層培養(yǎng)基；取3 mL、pH為8.0的Tris-HCl緩沖液加入離心管中,重懸后,在同樣條件下離心洗滌,重復(fù)3次；將洗干凈的酵母用3 mL、pH為8.0的Tris-HCl緩沖液重懸；從樣品中取5 μL細(xì)胞懸浮液滴于載玻片上,蓋上蓋玻片制樣；在倒置熒光顯微鏡下用100×油鏡進(jìn)行觀察，將倒置熒光顯微鏡的汞燈強(qiáng)度調(diào)到最強(qiáng),并將物鏡下的光圈調(diào)至UV,觀察酵母細(xì)胞的熒光(見(jiàn)圖3)。比較合成了CdSe量子點(diǎn)的酵母細(xì)胞與對(duì)照酵母細(xì)胞的熒光區(qū)別。

圖3 合成CdSe量子點(diǎn)后酵母細(xì)胞的熒光顯微鏡圖片

4 教學(xué)建議

(1) 本實(shí)驗(yàn)需要的時(shí)間周期為4 d,因此需要給學(xué)生較長(zhǎng)的時(shí)間來(lái)學(xué)習(xí)。建議將本實(shí)驗(yàn)作為學(xué)生的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。

(2) 在進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)前,要求學(xué)生查閱《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》,學(xué)習(xí)微生物培養(yǎng)的基本操作和知識(shí)。

(3) 實(shí)驗(yàn)完成后進(jìn)行課堂討論與總結(jié),集體討論以下2個(gè)問(wèn)題:①為什么最終得到樣品中的酵母細(xì)胞與對(duì)照的酵母細(xì)胞的熒光有區(qū)別,其區(qū)別說(shuō)明了什么？②酵母細(xì)胞為什么要培養(yǎng)至生長(zhǎng)曲線(xiàn)的穩(wěn)定期？指導(dǎo)教師可借此機(jī)會(huì)向?qū)W生介紹微生物生長(zhǎng)的特性以及CdSe熒光量子點(diǎn)的特性。

5 結(jié)束語(yǔ)

實(shí)踐表明,活酵母細(xì)胞合成CdSe量子點(diǎn)實(shí)驗(yàn)具有生動(dòng)、效果直觀、便于操作等優(yōu)點(diǎn),既有利于學(xué)生理解和掌握微生物生長(zhǎng)的特性等生物學(xué)方面的知識(shí),也有利于學(xué)生掌握熒光納米材料的特性等化學(xué)方面的前沿動(dòng)態(tài),同時(shí)也有利于激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)積極性以及創(chuàng)新精神。

References)

[1] 張臣.淺析化學(xué)生物學(xué)復(fù)合型人才培養(yǎng)[J].華南師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2010(增刊1):52-54.

[2] 王世敏,宋功武,李玲.化學(xué)生物學(xué)的科學(xué)內(nèi)涵及其發(fā)展[J].湖北化工,2002(4):1-3.

[3] 吳厚銘.化學(xué)生物學(xué)：新興的交叉前沿學(xué)科領(lǐng)域[J].化學(xué)進(jìn)展,2000,12(4):423-430.

[4] Alivisatos A P.Perspectives on the physical chemistry of semiconductor nanocrystals[J].J Phy Chem，1996,100(31),13226-13239.

[5] Chan W C,Nie S.Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection[J].Science，1998,281：2016-2018.

[6] Jr Bruchez M,Moronne M,Gin P,et al.Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels[J].Science， 1998,281：2013-2016.

[7] Murray C B,Norris D J,Bawendi M G.Synthesis and characterization of nearly monodisperse CdE(E = S,Se,Te) semiconductor nanocrystallites[J]. J Am Chem Soc， 1993,115(19)：8706-8715.

[8] Cui R,Liu H H,Xie H Y, et al. Living yeast cells as a controllable biosynthesizer for fluorescent quantum dots[J]. Adv Funct Mater，2009,19：2359-2364.

[9] Qu Lianhua,Peng Z A,Peng Xiaogang.Alternative routes toward high quality CdSe nanocrystals[J]. Nano Lett，2001,1(6)：333-337.

[10] Qu Lianhua, Peng Xiaogang. Control of photoluminescence properties of CdSe nanocrystals in growth[J]. J Am Chem Soc, 2002,124(9)：2049-2055.

[11] Simon J A,Bedalov A.Yeast as a model system for anticancer drug discovery[J].Nat Rev Cancer,2004,4：481-487.

[12] Botstein D,Chervitz S A,Cherry J M.Yeast as a model organism[J]. Science， 1997,277：1259-1260.

[13] Gray J V, Petsko G A, Johnston G C, et al.“Sleeping beauty”:Quiescence in Saccharomyces cerevisiae[J].Microbiol Mol Biol Rev， 2004,68,(2)：187-206.

[14] Ross-Macdonald P,Coelho P S ,Roemer T,et al.Large-scale analysis of the yeast genome by transposon tagging and gene disruption[J]. Nature，1999,402：413-418

[15] Kessi J,Hanselmann K W.Similarities between the abiotic reduction of selenite with glutathione and the dissimilatory reaction mediated by Rhodospirillum rubrum and Escherichia coli[J].J Biol Chem， 2004,279,(49)：50662-50669.

[16] Li Z S,Lu Y P,Zhen R G,et al.A new Pathway for vacuolar cadmium sequestration in Saccharomyces cerevisiae:YCF1-catalyzed transport of bis(glutathionato)cadmium[J].Proc Natl Acad Sci U S A， 1997,94：42-47.

Application of quantum dots biosynthesis technology in teaching of chemical biology experiments

Cui Ran

(Key Laboratory of Analytical Chemistry for Biology and Medicine(Ministry of Education),College of Chemistry and Molecular Sciences, Wuhan University,Wuhan 430072, China)

Utilizing biosystems to solve the problems of chemistry is one of the new courses in chemical biology.By contriving to couple unrelated intracellular biochemical reactions in an appropriate space and time sequence,the controllable biosythesis of fluorescent CdSe QDs at mild condition has been realized just by incubating yeast cells at 30°C.This strategy is a good example of how the biological systems can address some of the problems associated with traditional methods of chemical synthesis.This controllable and mild strategy is suitable for the chemical biology teaching.

living yeast cells; chemical biology; quantum dots

2014- 12- 08

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目“以活細(xì)胞為平臺(tái)可控制備生物檢測(cè)標(biāo)記納米材料”(21105075);中國(guó)博士后科學(xué)基金特別資助項(xiàng)目“調(diào)控生化反應(yīng)制備面向活體成像的近紅外納米生物探針”(2012T50663)

崔然(1981—),女,河南焦作,博士,講師,研究方向?yàn)榧{米生物醫(yī)學(xué)分析.

E-mail：cuiran@whu.edu.cn

Q-33

B

1002-4956(2015)7- 0071- 04