響應(yīng)面法優(yōu)化堿液提取百蕊草多糖的工藝研究

李 奎,李雪玲

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院,安徽合肥 230036)

響應(yīng)面法優(yōu)化堿液提取百蕊草多糖的工藝研究

李 奎,李雪玲*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院,安徽合肥 230036)

為了提高百蕊草的利用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,以百蕊草為原料,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用了響應(yīng)面法對(duì)堿液提取百蕊草多糖工藝進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明,堿液提取百蕊草多糖的最佳工藝條件為:提取時(shí)間2h,提取溫度95℃,料液比1∶33,氫氧化鈉濃度為0.74mol/L。在此條件下,百蕊草多糖的得率為20.86%,與預(yù)測(cè)值20.66%擬合性較好。

響應(yīng)面,堿液提取,百蕊草,多糖

百蕊草是檀香科植物,多生長(zhǎng)于田野及山區(qū)沙地邊緣中,我國(guó)南北各地均有分布。百蕊草具有抑菌、鎮(zhèn)咳、消炎鎮(zhèn)痛、抗氧化等多種生物活性[1-2],是一種廣譜的抗菌中草藥。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于百蕊草的研究重點(diǎn)大多集中在其生物學(xué)特性、抑菌成分的提取與性質(zhì)研究及其開(kāi)發(fā)利用等幾個(gè)方面[3-4],而有關(guān)百蕊草多糖的提取分離工藝方面的研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。多糖的提取方法有熱水提取法、堿液提取法、超聲波提取法、酶解法提取法等,堿液提取操作簡(jiǎn)單而且多糖得率高,是多糖提取較常用的方法之一。因此,優(yōu)化百蕊草多糖的堿液提取工藝,將百蕊草中的多糖提取出來(lái)并添加到食品藥品中,將大大提高百蕊草的利用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

響應(yīng)面分析法(Response Surface Methodology,RSM)是利用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),采用多元二次方程來(lái)擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系,通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)確定最優(yōu)工藝的一種分析方法[5]。RSM現(xiàn)已廣泛的運(yùn)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、化學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域,在食品領(lǐng)域主要用于發(fā)酵工藝和提取工藝的優(yōu)化[6-7]。本文擬在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面分析法對(duì)百蕊草多糖的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

百蕊草 購(gòu)于合肥市安徽中醫(yī)學(xué)院,經(jīng)高速中藥粉碎機(jī)粉碎后,過(guò)40目篩;95%乙醇、重蒸酚、濃硫酸、氫氧化鈉等 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

DD-04四兩裝高速中藥粉碎機(jī) 溫嶺市大海藥材器械廠;GZX-9070MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 百蕊草的前處理 將百蕊草置于15倍體積石油醚中浸泡24h脫脂,再用10倍體積95%乙醇浸泡過(guò)夜去黃酮,最后置于烘箱中80℃烘干,將烘干后的百蕊草粉碎后過(guò)40目篩,得到百蕊草粉末備用。

1.2.2 多糖含量的測(cè)定 文章采用苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量[8]。

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取于105℃烘干至恒重的葡萄糖50mg,用蒸餾水溶解并定容到50mL,作為儲(chǔ)備液待用。精密量取葡萄糖儲(chǔ)備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL,分別置于50mL容量瓶中并定容,搖勻。分別量取上述各溶液2mL,各加入6%苯酚1.0mL,搖勻,迅速加入濃硫酸5.0mL,迅速搖勻,放置5min后置沸水浴加熱15min取出,冷水迅速冷卻至室溫;精密量取蒸餾水2.0mL,同樣操作,作為空白對(duì)照,按分光光度計(jì)法在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,測(cè)定三次,取其平均值。以吸光值(A)對(duì)濃度(C)作回歸計(jì)算,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 堿液提取百蕊草多糖的工藝流程 百蕊草粉末→堿液提取→離心取上清液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→乙醇沉淀多糖(三倍體積的95%乙醇浸泡過(guò)夜)→離心取沉淀→溶解、流水透析48h→冷凍干燥→百蕊草粗多糖。

1.2.2.3 百蕊草多糖含量計(jì)算 C=(A-0.0198)/11.894×B×F

式中:C-樣品濃度(mg/mL);A-樣品的吸光值;B-稀釋倍數(shù);F-換算因子(F=2.2889)[9]。

1.2.2.4 百蕊草多糖得率計(jì)算 百蕊草多糖得率(%)=(C×V/樣品質(zhì)量)×100

式中:C-樣品濃度(mg/mL);V-提取液體積(mL)。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取0.5g百蕊草粉末5份,分別置于50mL具塞刻度管中,考察料液比、提取溫度、提取時(shí)間、氫氧化鈉濃度對(duì)百蕊草多糖得率的影響。

1.2.3.1 料液比對(duì)百蕊草多糖得率的影響 準(zhǔn)確稱取0.5g百蕊草粉末5份,分別置于50mL具塞刻度管中,在提取時(shí)間1.5h,氫氧化鈉濃度為0.7mol/L,提取溫度80℃,料液比分別為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40g/mL的條件下提取百蕊草多糖,測(cè)定多糖的得率。

1.2.3.2 提取溫度對(duì)百蕊草多糖得率的影響 準(zhǔn)確稱取0.5g百蕊草粉末5份,分別置于50mL具塞刻度管中,在提取時(shí)間1.5h,氫氧化鈉濃度為0.7mol/L,料液比為1∶30g/mL,提取溫度分別為60、70、80、90、100℃的條件下提取百蕊草多糖,測(cè)定多糖的得率。

1.2.3.3 提取時(shí)間對(duì)百蕊草多糖得率的影響 準(zhǔn)確稱取0.5g百蕊草粉末5份,分別置于50mL具塞刻度管中,在提取時(shí)間1.5h,氫氧化鈉濃度為0.7mol/L,料液比為1∶30g/mL,提取溫度80℃,提取時(shí)間分別為1、1.5、2、2.5、3h的條件下提取百蕊草多糖,測(cè)定多糖的得率。

1.2.3.4 氫氧化鈉濃度對(duì)百蕊草多糖得率的影響 準(zhǔn)確稱取0.5g百蕊草粉末5份,分別置于50mL具塞刻度管中,提取時(shí)間1.5h,料液比為1∶30g/mL,提取溫度80℃,氫氧化鈉濃度分別為0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mol/L的條件下提取百蕊草多糖,測(cè)定多糖的得率。

1.2.4 響應(yīng)面分析 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以料液比、提取溫度、提取時(shí)間、氫氧化鈉濃度為自變量,百蕊草多糖的得率為響應(yīng)值,利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化堿液提取百蕊草多糖的工藝條件。響應(yīng)面因素和水平選取見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 將得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果利用Excel、Design-Expert 8.0進(jìn)行直觀分析和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可以看出,在測(cè)定范圍內(nèi),葡萄糖濃度和吸光值之間呈良好線性關(guān)系,線性方程為y=11.894x+0.0198,相關(guān)系數(shù)R2=0.9956。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of glucose

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)百蕊草多糖得率的影響 對(duì)于提取工藝來(lái)說(shuō),料液比是考察的重點(diǎn)[10-11]。過(guò)低的料液比會(huì)導(dǎo)致浸提液與樣品接觸不徹底使多糖不能完全溶出,過(guò)高的料液比會(huì)造成浪費(fèi)而且給下一步的分離純化帶來(lái)麻煩。從圖2可以看出料液比增加到1∶30g/mL后多糖的得率沒(méi)有太大的變化,因此最佳料液比選擇1∶30g/mL。

圖2 料液比對(duì)得率的影響Fig.2 The effect of different ratio of alkaline liquor to raw material on the yields

2.2.2 提取溫度對(duì)百蕊草多糖得率的影響 從圖3可以看出,隨著溫度的升高,百蕊草多糖得率的變化也呈現(xiàn)先迅速增加后逐漸減緩的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)樵谶^(guò)高的溫度條件下,堿性溶液中的多糖易發(fā)生分解和碳鏈斷裂,故最佳溫度選擇90℃。

圖3 提取溫度對(duì)得率的影響Fig.3 The effect of different extraction temperature on the yields

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)百蕊草多糖得率的影響 從圖4可以看出,多糖得率在提取時(shí)間2h達(dá)到最高值,然后隨著進(jìn)一步延長(zhǎng)提取時(shí)間得率迅速下降。這說(shuō)明多糖溶于提取液是一個(gè)緩慢的過(guò)程,時(shí)間過(guò)短,多糖提取不徹底;而時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)引起多糖結(jié)構(gòu)的破壞,導(dǎo)致得率降低。因此最佳提取時(shí)間為2h。

圖4 提取時(shí)間對(duì)得率的影響Fig.4 The effect of different extraction time on the yields

2.2.4 氫氧化鈉濃度對(duì)百蕊草多糖得率的影響 從圖5可以看出,氫氧化鈉濃度為0.7mol/L是轉(zhuǎn)折點(diǎn)。當(dāng)氫氧化鈉濃度大于0.7mol/L后,百蕊草多糖的得率迅速降低。堿液浸泡能解除細(xì)胞壁聚合物之間的物理作用,有助于多糖從細(xì)胞內(nèi)溶出,從而提高多糖得率。但過(guò)高的堿液濃度會(huì)發(fā)生β-消去反應(yīng),引起多糖結(jié)構(gòu)的破壞,多糖得率也隨之降低[12]。

圖5 氫氧化鈉濃度對(duì)得率的影響Fig.5 The effect of different NaOH concentration on the yields

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化分析

Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2,通過(guò)軟件進(jìn)行非線性回歸的二次多項(xiàng)式的擬合,得出二次回歸方程如下:

Y=-294.43208+0.79207A+2.97038B+70.64933C+240.34833D-0.0059AB+0.34AC+2.325AD-0.163BC-0.1425BD+2.6CD-0.040423A2-0.012281B2-16.81733C2-207.93333D2。

由表3可以看出,模型的p值<0.0001,說(shuō)明該模型顯著,失擬項(xiàng)p值為0.6167>0.05不顯著。該模型的相關(guān)系數(shù)R2為93.18%,調(diào)整后為86.37%,說(shuō)明該模型能解釋86.37%的響應(yīng)值的變化[13],證明該模型與實(shí)際的擬合性較好。

表2 Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

方差分析可知,提取時(shí)間對(duì)得率的影響不顯著,料液比對(duì)得率的影響顯著,提取溫度和氫氧化鈉濃度對(duì)得率的影響極顯著;料液比與氫氧化鈉濃度之間交互作用顯著,其余各因素之間的交互作用均不顯著;料液比的二次項(xiàng)對(duì)得率的影響顯著,提取溫度、提取時(shí)間、氫氧化鈉濃度三者的二次項(xiàng)對(duì)得率的影響極顯著。由此可以看出,各因素對(duì)得率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

各因素的F值表示各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度,F值越大表示該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越大[14]。從表3可以看出各因素對(duì)得率的影響大小排列分別為提取溫度>氫氧化鈉濃度>料液比>提取時(shí)間。

表3 回歸方程方差分析表

注:**表示極顯著(p<0.01);*表示顯著(0.01

由回歸方程得出擬合的料液比與氫氧化鈉濃度對(duì)得率的影響的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖6。圖6表示了當(dāng)提取溫度和提取時(shí)間為零水平時(shí),料液比和氫氧化鈉濃度對(duì)百蕊草多糖得率的影響。響應(yīng)曲面的陡峭程度反映了因素對(duì)響應(yīng)值的影響力大小,也表明了因素間交互作用的強(qiáng)弱。由圖6可知,料液比與氫氧化鈉濃度之間的交互作用顯著。

圖6 料液比與氫氧化鈉濃度的響應(yīng)面立體圖Fig.6 Response surface plot showing the effects off the material ratio and NaOH concentration on dried osmund dietary fiber alkaline hydrolysis

2.4 最佳工藝條件的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證

根據(jù)該模型預(yù)測(cè)出理論條件下堿液提取百蕊草多糖的最佳工藝條件為:料液比1∶32.66g/mL,提取溫度95.35℃,提取時(shí)間2.03h,氫氧化鈉濃度0.74mol/L,百蕊草多糖的得率為20.66%?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)操作,將最優(yōu)工藝條件修正為:料液比1∶33g/mL,提取溫度95℃,提取時(shí)間2h,氫氧化鈉濃度0.74mol/L,經(jīng)驗(yàn)證此條件下百蕊草多糖的實(shí)際得率20.86%,與預(yù)測(cè)值的相對(duì)偏差小于1%。因此,基于響應(yīng)面法得到的優(yōu)化提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠,有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

文章在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)堿液提取百蕊草多糖的工藝進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果表明料液比、提取溫度、提取時(shí)間、氫氧化鈉濃度四個(gè)因素對(duì)百蕊草多糖得率的影響大小為:提取溫度>氫氧化鈉濃度>料液比>提取時(shí)間,最佳工藝條件為料液比1∶33g/mL,提取溫度95℃,提取時(shí)間2h,氫氧化鈉濃度0.74mol/L,此條件下百蕊草多糖的得率高達(dá)20.86%。本研究為百蕊草的開(kāi)發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù),具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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Study on response surface methodology for alkali extraction of polysaccharide from thesium

LI Kui,LI Xue-ling*

(College of Tea and Food Science and Technology,Anhui Agriculture University,Hefei 230036,China)

In order to improve the use value and economic value of Thesium,Thesium was used as raw materials.Based on the single factor experiment,the alkali extraction process of polysaccharide Thesium were optimized by response surface methodology. The results showed that the optimal extraction conditions were:extraction time 2h,extraction temperature 95℃,solid-liquid ratio 1∶33,the concentration of sodium hydroxide for 0.74mol/L. Under this condition,Thesium polysaccharide yield was 20.86%,which fits well with the predicted value 20.66% .

response surface;alkaline liquor extraction;thesium;polysaccharides

2014-07-10

李奎(1991-),男,碩士研究生,研究方向:食品加工與安全。

*通訊作者:李雪玲(1972-),女,碩士，副教授,研究方向:食品營(yíng)養(yǎng)與質(zhì)量安全。

TS211.9

B

1002-0306(2015)07-0204-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.035