黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因xynZF-2在畢赤酵母中的高效表達(dá)

王丹丹,周晨妍,李同彪,張振群,王亞杰,梁真真,張 青,路丹榮

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003)

黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因xynZF-2在畢赤酵母中的高效表達(dá)

王丹丹1,2,周晨妍1,*,李同彪1,張振群1,王亞杰1,梁真真1,張 青1,路丹榮1

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003)

將黑曲霉XZ-3S木聚糖酶基因xynZF-2(成熟肽堿基)插入表達(dá)載體pPIC9K中,SalⅠ線性化后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,經(jīng)MD平板、G418梯度和搖瓶復(fù)篩篩選出多克隆陽性轉(zhuǎn)化子。選擇28h的種子,每隔24h補(bǔ)加1.5%的甲醇,發(fā)酵96h后,比酶活可達(dá)13210U/mg;SDS-PAGE分析表明,該蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為23.0ku;重組酶最適作用溫度為45℃,最適作用pH為5.0,在溫度35～40℃、pH5～7條件下有良好的穩(wěn)定性,Ca2+對(duì)酶的激活作用最明顯。

黑曲霉,木聚糖酶,畢赤酵母GS115,誘導(dǎo)表達(dá)

木聚糖酶(Xylanase)[EC3.2.1.8]是指將木聚糖降解為低聚糖和木糖的一類酶的總稱,是木聚糖降解酶系中最為關(guān)鍵的酶[1-3]。近年來該酶在食品、能源、飼料、造紙工業(yè)及環(huán)境等領(lǐng)域均有了廣泛的應(yīng)用,具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。產(chǎn)木聚糖酶的微生物分布很廣,包括放線菌、真菌、細(xì)菌和一些酵母等[4-6]。不同種類,不同來源的木聚糖酶顯示出不同的催化特性,使用各種手段來提高該酶的產(chǎn)量并降低其生產(chǎn)成本,挖掘出其潛力并應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中去是亟待解決的問題。

在前期的實(shí)驗(yàn)中我們已經(jīng)從黑曲霉(Aspergillusniger)XZ-3S中成功克隆出木聚糖酶基因xynZF-2,并且在大腸桿菌中進(jìn)行了可溶性表達(dá),但是表達(dá)量不高并且為胞內(nèi)表達(dá)[7]。本研究在此基礎(chǔ)上將xynZF-2克隆到真核表達(dá)載體上并在畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá),并對(duì)其所產(chǎn)重組木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

pET-28a-xynZF-2重組載體 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院酶與發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存;大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115、表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K 均購自Invitrogen公司;TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ、T4DNA連接酶、SalⅠ酶 均購自大連寶生物(TaKaRa)工程有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒 均購自上海生工生物有限公司;樺木木聚糖(Birch wood xylan) 購自Sigma公司;無氨基酸酵母氮源(YNB)、G418 購自Amresco公司;其他生化試劑 均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純;LB、YPD、MD、BMGY(富集培養(yǎng)基)、BMMY(誘導(dǎo)培養(yǎng)基)配制方法見參考文獻(xiàn)[8]。

HZQ-F160A恒溫振蕩器 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;梯度PCR擴(kuò)增儀 C1000 Bio-Rad Laboratory;DC-0506低溫恒溫槽() 上海比朗儀器有限公司;穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(DYY-2) 北京市六一儀器廠;高速冷凍離心機(jī)(Neofuge 23R) 上海力申科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PCR引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)xynZF-2基因的序列以及表達(dá)載體pPIC9K上多克隆位點(diǎn)的特征,設(shè)計(jì)并合成以下一對(duì)引物:P1:5′-CCGGAATTC GTTCCCCACGACTCTGTCG-3′(EcoRⅠ);P2:5′-ATAAGAATGCGGCCGCTTACTG AACAGTGATGGA-3′(NotⅠ)。

1.2.2 畢赤酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建 PCR擴(kuò)增得到的木聚糖酶基因xynZF-2,經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化,并與表達(dá)載體pPIC9K同時(shí)用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切?；厥詹⒓兓p酶切后的xynZF-2基因和pPIC9K載體片段,經(jīng)T4DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,用含卡那霉素LB平板篩選陽性克隆子。提取質(zhì)粒后,用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切并通過測序來驗(yàn)證插入基因片段是否正確,最后得到pPIC9K-xynZF-2。

1.2.3 重組畢赤酵母的構(gòu)建及高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選 用SalⅠ酶切重組質(zhì)粒pPIC9K-xynZF-2以及對(duì)照空載體pPIC9K,瓊脂糖凝膠回收純化目的片段并分別電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115中,電擊轉(zhuǎn)化方法參照Invitrogen公司操作手冊(cè)。利用MD平板篩選出陽性克隆子,并在含有不同G418濃度的(0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、6.0、8.0mg/mL)的YPD培養(yǎng)基平板上進(jìn)行高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選,最后搖瓶復(fù)篩得到一株木聚糖酶高產(chǎn)菌株(編號(hào)65#)。

1.2.4 重組畢赤酵母工程菌株的搖瓶培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá) 挑取編號(hào)為65#的菌株,接種于含有20mL BMGY培養(yǎng)基的250mL的三角瓶中,30℃,250r/min培養(yǎng)至A600為6.0左右,離心收集菌體,轉(zhuǎn)接至裝有20mL BMMY培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,相同條件下繼續(xù)培養(yǎng),每24h補(bǔ)加100%甲醇至終濃度為0.5%,誘導(dǎo)表達(dá)3～5d。

1.2.5 表達(dá)產(chǎn)物的純化和SDS-PAGE分析 重組轉(zhuǎn)化子GS115/pPIC9K-xynZF-2誘導(dǎo)培養(yǎng)96h,3000r/min離心10min,取發(fā)酵上清液聚乙二醇濃縮,透析純化后進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳,考馬斯亮藍(lán)染色,檢測目的蛋白的表達(dá)。

1.2.6 木聚糖比酶活的測定 采用改進(jìn)的DNS法[9]測定木聚糖酶活力。酶活單位的定義:在50℃和pH4.6條件下,以0.5%樺木木聚糖作為底物,以每分鐘產(chǎn)生1μmol木糖所需的酶量為1個(gè)酶活單位。

用Bradford法[10]測定蛋白質(zhì)濃度,以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

酶的比活(U/mg)=酶活性/蛋白濃度。

1.2.7 發(fā)酵條件優(yōu)化 將種子培養(yǎng)液按體積分?jǐn)?shù)1%接種量接種于30mL生長培養(yǎng)基BMGY中培養(yǎng)全部轉(zhuǎn)接發(fā)酵培養(yǎng)基BMMY中,同時(shí)按體積分?jǐn)?shù)0.5%添加甲醇,并每隔24h補(bǔ)加甲醇一次,在30℃的恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng),轉(zhuǎn)速為240r/min,分別調(diào)整發(fā)酵培養(yǎng)基接種時(shí)間、甲醇誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等因素進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2.8 酶學(xué)性質(zhì)的測定 酶的最適作用溫度和pH以及熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性的具體實(shí)驗(yàn)操作方法見參考文獻(xiàn)[7],反應(yīng)所用緩沖液濃度分別為0.05mol/mL的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH9.0),Tris-鹽酸緩沖液(pH8.0),磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH6.0～7.0)和磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH3.0～5.0)。

金屬離子對(duì)酶活性的影響:將酶在最適的pH體系下40℃保溫1h,然后進(jìn)行最終濃度為1mmol/L化合物和金屬離子對(duì)酶活性影響的實(shí)驗(yàn)。以標(biāo)準(zhǔn)方法測定酶活力,以不加金屬離子的酶活性為100%,計(jì)算相對(duì)酶活。

1.2.9 酶學(xué)動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定 在酶促反應(yīng)的最適條件下,以0.5%樺木木聚糖為底物,依次在酶促反應(yīng)的2、4、6、8、10、15、20、25、30min時(shí)終止反應(yīng),測定木聚糖酶活性,計(jì)算出酶促反應(yīng)的一級(jí)反應(yīng)時(shí)間,確定測定Km值及Vmax的反應(yīng)時(shí)間為20min。以濃度分別為1～10mg/mL的樺木木聚糖為底物,在最適條件下測定酶活活性,計(jì)算出相應(yīng)的反應(yīng)速度,并利用米氏方程雙倒數(shù)法求得Km值及Vmax。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用Excel辦公軟件和SPSS11.0軟件進(jìn)行處理,并繪制出相應(yīng)的變化曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 畢赤酵母重組表達(dá)載體的構(gòu)建

以pET-28a-xynZF-2為模板,以P1/P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到xynZF-2基因(圖1)。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳分析Fig.1 Gel electrophoresis analysis of PCR product注:M:DL2000 DNA Marker;1:xynZF-2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

將xynZF-2以正確的閱讀框架插入到酵母表達(dá)載體pPIC9K的α-因子信號(hào)肽的下游,得到重組表達(dá)載體pPIC9K-xynZF-2。經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定(圖2),并測序正確后確定重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖2 重組質(zhì)粒pPIC9K-xynZF-2的雙酶切驗(yàn)證Fig.2 The restriction analysis of recombinant plasmid pPIC9K-xynZF-2注:M:DL2000 DNA Marker;1:xynZF-2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;2:EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切pPIC9K-xynZF-2。

2.2 重組畢赤酵母的構(gòu)建及高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選

重組表達(dá)載體pPIC9K-xynZF-2經(jīng)SalⅠ線性化以后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞GS115中,將轉(zhuǎn)化液體涂布MD平板篩選出陽性克隆子。另外,表達(dá)載體pPIC9K上含有卡那霉素G418藥物的抗性基因,并且相關(guān)研究認(rèn)為G418抗性與重組轉(zhuǎn)化子的拷貝數(shù)呈正相關(guān)關(guān)系。因此,可以直接用含有高濃度G418的YPD快捷方便的篩選出含重組載體pPIC9K-xynZF-2多拷貝的重組菌株。

將在MD平板上篩選的陽性轉(zhuǎn)化子在含有不同濃度G418的YPD平板上進(jìn)一步篩選出高拷貝轉(zhuǎn)化子,最終在8.00mg/mL G418的YPD平板上篩選得到四十多個(gè)高拷貝轉(zhuǎn)化子。搖瓶復(fù)篩,得到一株高產(chǎn)木聚糖酶的重組畢赤酵母菌株(PichiapastorisGS115/pPIC9K-xynZF-2 65#)。

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和條件優(yōu)化

2.3.1 接種時(shí)間的優(yōu)化 將P.pastorisGS115/pPIC9K-xynZF-2 65#進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá),并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。在發(fā)酵過程中,種子的選擇非常關(guān)鍵,種齡太短,發(fā)酵過程會(huì)出現(xiàn)前期生長緩慢,致使周期延長,甚至造成異常發(fā)酵;種齡過長,會(huì)引起菌體過早自溶,導(dǎo)致生產(chǎn)能力下降。圖3結(jié)果顯示接種時(shí)間選擇在對(duì)數(shù)生長期的28h(A600=16.0)時(shí),比酶活最高。

圖3 接種時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of inoculation time on xylanase production

2.3.2 甲醇誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化 圖4結(jié)果表明,誘導(dǎo)表達(dá)前期隨著時(shí)間的延長,表達(dá)量增大,在誘導(dǎo)96h時(shí)達(dá)到最大,接著隨著時(shí)間的進(jìn)一步增加,產(chǎn)酶量依次遞減。

圖4 甲醇誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of induction time on xylanase production

2.3.3 甲醇誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化 甲醇能夠誘導(dǎo)重組畢赤酵母表達(dá),但是并不是隨著甲醇濃度的增加表達(dá)量就隨之增加,圖5結(jié)果表明,甲醇濃度在1.5%時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)量最大,濃度過大對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)反而起抑制作用。

圖5 甲醇濃度對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of methanol concentration on xylanase production

2.4 重組木聚糖酶的SDS-PAGE

將P.pastorisGS115/pPIC9K-xynZF-2 65#誘導(dǎo)表達(dá)發(fā)酵液上清與上樣緩沖液煮沸10min后3000r/min離心5min,然后SDS-PAGE電泳,結(jié)果(圖6)顯示,重組菌株在23.0ku左右處有一明顯條帶,并且大小與預(yù)測蛋白分子量相符,除目的蛋白外,基本上無雜帶,能夠滿足后期酶學(xué)性質(zhì)分析。

圖6 重組表達(dá)木聚糖酶SDS-PAGE分析Fig.6 Analysis of recombinant expressed xylanase by SDS-PAGE注:M:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn);1:GS115/pPIC9K-xynZF-2 65#誘導(dǎo)純化。

2.5 重組木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)

2.5.1 重組木聚糖酶最適作用溫度和溫度穩(wěn)定性 由圖7可以看出,該重組木聚糖酶作用最適溫度為45℃,溫度過高或者過低對(duì)重組酶活性都有不同程度的影響。圖8結(jié)果顯示,重組酶在35℃和40℃條件下穩(wěn)定性良好,在此溫度下保溫1h以后相對(duì)酶活性仍然能夠保持在70%以上;隨著溫度的升高,重組酶的穩(wěn)定性越來越差,45℃和50℃條件下保溫30min以后,相對(duì)酶活性降到10%以下,說明該重組酶的耐熱性不好,有待進(jìn)一步提高。

圖7 溫度對(duì)重組木聚糖酶酶活性的影響Fig.7 The effect of temperature on xylanase activity

圖8 重組木聚糖酶的溫度穩(wěn)定性Fig.8 The thermostability of the xylanase

2.5.2 重組木聚糖酶最適作用pH和pH穩(wěn)定性 圖9結(jié)果顯示該重組酶的最適作用pH為5.0,作用環(huán)境偏酸,過酸或者偏堿對(duì)酶活性都有強(qiáng)烈的抑制作用。將該重組酶在不同的pH條件下保溫1h以后,在pH5.0～7.0之間,相對(duì)酶活性仍然能夠保持在60%以上,過酸或者偏堿都有可能影響重組酶蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象,進(jìn)而來影響酶的活性,相對(duì)酶活性降到30%以下。

圖9 pH對(duì)重組酶活性的影響及重組木聚糖酶的pH穩(wěn)定性Fig.9 The effect of pH on activity and stability of the recombinant xylanase

2.5.3 金屬離子對(duì)酶活性的影響 將重組木聚糖酶與不同的金屬離子保溫一段時(shí)間以后,酶活性均有不同程度的改變,圖10結(jié)果顯示,Zn2+、Ca2+、Fe2+、EDTA對(duì)該重組酶有不同程度的激活作用,其中Ca2+激活作用最強(qiáng),其余常見離子對(duì)重組酶活性有不同程度的抑制作用,尤其是與Cu2+保溫之后,相對(duì)酶活性僅僅保留在50%左右,與原核細(xì)胞中表達(dá)的酶性質(zhì)大有不同[7],其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

圖10 金屬離子對(duì)重組酶活性的影響Fig.10 The effect of metal ions on recombinant xylanase

2.6 重組酶酶學(xué)動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定

在酶促反應(yīng)的最適條件下,以0.5%樺木木聚糖為底物,依次在酶促反應(yīng)的2、4、6、8、10、15、20、25、30min時(shí)終止反應(yīng),測定木聚糖酶活性,計(jì)算出酶促反應(yīng)的一級(jí)反應(yīng)時(shí)間,確定測定Km值及Vmax的反應(yīng)時(shí)間為20min。以濃度分別為1～10mg/mL的樺木木聚糖為底物,在最適條件下測定酶活活性,計(jì)算出相應(yīng)的反應(yīng)速度,并利用米氏方程雙倒數(shù)法求得Km值及Vmax。該重組木聚糖酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測定結(jié)果為Vmax=2500μmol/mL/min,Km=1.5mg/L。

3 討論

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近年來國內(nèi)外公認(rèn)的最有效的新型外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一,該表達(dá)系統(tǒng)具有高效表達(dá)、高穩(wěn)定性、高效分泌、高密度發(fā)酵以及很容易被用于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn),已有多種外源蛋白在畢赤酵母中獲得了成功的表達(dá)[11-14]。

本研究將從黑曲霉XZ-3S中克隆得到的木聚糖酶基因xynZF-2插入到真核表達(dá)載體pPIC9K上,在α-因子分泌信號(hào)的下游,利用AOX1高效啟動(dòng)子的作用使目的基因在畢赤酵母中得到了高效的外分泌表達(dá)。抗生素G418篩選得到高拷貝轉(zhuǎn)化子以后,對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,得到重組菌P.pastorisGS115/pPIC9K-xynZF-2 65#并且表達(dá)木聚糖酶產(chǎn)量可達(dá)13210U/mg,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于原始出發(fā)菌株和大腸桿菌原核表達(dá)菌株。該菌株表達(dá)的目的蛋白具有很好的生物學(xué)活性,為木聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了良好的出發(fā)菌株,在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中需要對(duì)該菌株在發(fā)酵罐中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明,該重組木聚糖酶的最適作用溫度為45℃,較大腸桿菌原核表達(dá)稍有一定的提高;最適的作用pH為5.0,與原核表達(dá)相比差別不大;在溫度35～40℃、pH5～7條件下穩(wěn)定性良好,在保溫1h以后酶活仍能保留在60%以上,熱穩(wěn)定性和耐酸性比原核表達(dá)均有了一定程度的提高;Ca2+對(duì)該酶的作用有很強(qiáng)的促進(jìn)作用,Cu2+抑制作用最強(qiáng),大腸桿菌表達(dá)過程中Fe3+激活作用最明顯,二者差別的機(jī)制有待進(jìn)一步研究[7]。木聚糖酶在飼料、漂白等行業(yè)應(yīng)用廣泛,但是在這些行業(yè)的應(yīng)用過程中對(duì)溫度和pH等環(huán)境都有不同嚴(yán)格要求,該重組酶在畢赤酵母中表達(dá)良好,但是此酶的最適作用pH環(huán)境偏酸,并且耐熱性不好,離工業(yè)化生產(chǎn)使用仍然有一定的差距[4,15]。故下一步的工作將對(duì)該重組酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性進(jìn)行改造來擴(kuò)大該重組木聚糖酶的應(yīng)用范圍,為其工業(yè)化應(yīng)用開發(fā)奠定良好的基礎(chǔ)。

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Efficient expression of the xylanase genexynZF-2 fromAspergillusnigerXZ-3S inPichiapastoris

WANG Dan-dan1,2,ZHOU Chen-yan1,*,LI Tong-biao1,ZHANG Zhen-qun1,WANG Ya-jie1,LIANG Zhen-zhen1,ZHANG Qing1,LU Dan-rong1

(1. School of Life Science and Technology,Xinxiang Medical University,Xinxiang 453003,China;2. San Quan Medlcal College,Xinxiang Medical University,Xinxiang 453003,China)

In this study,a recombinant plasmid pPIC9K-xynZF-2was constructed by inserting genexynZF-2 mature peptide)fromAspergillusnigerintoPichiapastorissecretary vector pPIC9K. The pPIC9K-xynZF-2 linearized bySalⅠwas transformed intoPichiapastorisGS115 by electroporation. The positive recombinant strain was identified by MD medium,G418 and shake bottle selection. The SDS-PAGE analysis showed that the protein molecular weight was about 23.0ku. Under the condition of the vaccination time 28h,1.5% methanol every 24h added,and the methanol induced time 96h,the enzyme production can be achieved 13210U/mg. The optimal temperature and pH of the enzyme activity was 45℃ and 5.0,respectively. The enzyme activity was stable at the conditions of temperature 35～40℃ and pH 5～7. Ca2+had an active effect on the enzyme obviously.

Aspergillusniger;xylanase;PichiapastorisGS115;induction expression

2014-05-19

王丹丹(1988-)，女，碩士，助教，主要從事微生物酶工程研究。

*通訊作者:周晨妍(1979-)，女，博士，副教授，主要從事微生物酶工程研究。

河南省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目資助(2011A180026)；河南省教育廳科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(13A180861)；河南省科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目(112102210299)；河南省高等學(xué)校青年骨干教師資助計(jì)劃項(xiàng)目(2011GGJS-125)；新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院科研項(xiàng)目培育基金(2013ZD113)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)07-0200-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.034