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    金帶細魚肉蛋白酶解物水解度與其抗氧化性和功能特性間的相互關(guān)系

    2015-05-08 09:27:50王忠合
    食品工業(yè)科技 2015年7期
    關(guān)鍵詞:解物溶解性螯合

    盧 彬,王忠合,傅 力,王 軍,鄒 敏

    (1.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830052;2.韓山師范學院生物系,廣東潮州 521041)

    盧 彬1,王忠合2,*,傅 力2,王 軍2,鄒 敏1

    (1.新疆農(nóng)業(yè)大學食品科學與藥學學院,新疆烏魯木齊 830052;2.韓山師范學院生物系,廣東潮州 521041)

    采用胰蛋白酶水解金帶細鲹魚肉蛋白制備不同水解度(10.8%、14.9%、19.0%和21.7%)的酶解產(chǎn)物,研究水解度與酶解產(chǎn)物抗氧化性和功能特性的關(guān)系??寡趸苑治霰砻?低水解度處理顯著增大了酶解物清除羥基自由基的能力、清除DPPH自由基的能力和螯合亞鐵離子的能力(p<0.05),而高水解度處理則增強了酶解產(chǎn)物的金屬還原力(p<0.05)。功能特性結(jié)果表明:隨著水解度的增大,酶解產(chǎn)物的溶解度逐漸增大,而乳化活性和乳化穩(wěn)定性逐漸降低,起泡性和泡沫穩(wěn)定性也降低。同時,隨著pH的增加,酶解物的溶解性和乳化穩(wěn)定性呈先下降后上升的趨勢,而起泡性和泡沫穩(wěn)定性則隨著pH的增加而降低。上述分析表明,適當?shù)拿附馓幚韺Ω纳平饚Ъ汍擊~肉蛋白的功能特性及抗氧化活性具有一定的作用。

    金帶細鲹,蛋白水解物,水解度,功能特性,抗氧化性

    蛋白質(zhì)的功能特性,包括溶解性、乳化性、起泡性等,直接影響加工食品的品質(zhì),但是天然蛋白的功能特性無法滿足食品工業(yè)的需求,因而常采用酶解法進行修飾改性。研究表明,酶水解蛋白不僅可以改善蛋白質(zhì)的功能特性,如增大溶解性、提高熱穩(wěn)定性、增強乳化性或起泡性等,而且還可以改善其營養(yǎng)價值和生物活性[1-4]。另一方面,還可采用酶解蛋白制備生物活性肽,Ahn等[5]通過采用不同蛋白酶水解鮭魚加工副產(chǎn)物獲得具有較強抗氧化性的多肽。Eckert等[6]研究發(fā)現(xiàn)大麥蛋白酶解物可促進Ca2+等金屬離子的溶解性,并提高這些礦物質(zhì)的生物利用率。酶法水解蛋白的過程中,提高其功能特性和制備生物活性肽的關(guān)鍵是要控制水解度,一定程度的酶解可改變分子的大小和構(gòu)象,從而增強其功能性,但是水解度過高則會對產(chǎn)物產(chǎn)生不利的影響,甚至喪失功能性,因而深入探討水解度與酶解產(chǎn)物特性的關(guān)系至關(guān)重要。

    低值魚和小雜魚在海洋捕撈產(chǎn)量中歷年占有較大的比重,但主要用于生產(chǎn)一些低附加值產(chǎn)品,甚至作為廢物直接丟棄,不僅導(dǎo)致資源浪費,而且還造成海洋或陸地環(huán)境的污染。利用酶水解低值魚類及水產(chǎn)副產(chǎn)品來改善其功能特性及生物活性,獲得一系列高附加值的產(chǎn)品,是低值魚類深度開發(fā)利用的重要方向[7-9]。金帶細鲹(Selaroidesleptolepis)為鲹科細鲹屬的魚類,俗名木葉鲹,是一種未充分利用的低價魚,相關(guān)的研究報道較少。本文采用胰蛋白酶水解金帶細鲹魚肉蛋白,研究酶解物水解度與其抗氧化活性和功能特性的關(guān)系,旨在為金帶細鲹的高值化利用提供一定的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    材料:金帶細鲹購于當?shù)厥袌?去除魚頭和內(nèi)臟,洗凈瀝干后用攪碎機攪成肉糜,用保鮮袋分裝(每袋100g)后,貯存于-20℃冰箱備用。大豆色拉油,購于當?shù)厥袌觥?/p>

    試劑:菲洛嗪(ferrozine,3-(2-吡啶基)-5,6-二苯基-1,2,4-三嗪-4′,4″-二磺酸一鈉鹽);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH);2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS) 購于美國sigma公司;胰蛋白酶(3000~3500NFU/mg) 生工生物工程(上海)有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    UV-2800型紫外可見分光光度計 尤尼科(上海)儀器有限公司;FD-1D-50冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;2-16P離心機 美國Sigma有限公司;IKA T18 basic高速分散器 德國ULTRA TURRAX公司;PHSJ-4A型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;B056028型電子恒溫水浴鍋 國華(深圳)儀器。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 金帶細鲹魚肉蛋白酶解工藝 取魚糜按質(zhì)量比1∶3的比例與水混合均質(zhì)后,調(diào)節(jié)溶液pH和溫度至胰蛋白酶的最適條件(pH為7.0,溫度為50℃),加入1%的胰蛋白酶(E/S=1∶100)酶解不同時間后取樣,在100℃滅酶10min,將酶解液在10000r/min下離心10min,取上清液冷凍干燥,備用。

    1.2.2 TNBS測定法水解度(DH) 取樣液125μL,加入2.0mL 0.2125mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 8.2)和1.0mL 0.01%的TNBS溶液,混勻,置于50℃水浴中暗處反應(yīng)30min。反應(yīng)后加入2.0mL 0.1mol/L的亞硫酸鈉終止反應(yīng),室溫下冷卻15min,于420nm處測定吸光度A2。以同樣條件下測定未水解樣品的吸光度A1。將魚肉用一定量的6mol/L HCl在120℃下完全水解24h后測定游離氨基的總吸光度Amax。以L-亮氨酸為標樣繪制標準曲線,分別求得氨基的含量,按照下式[10]計算水解度DH:

    式中:Lmax、L2、L1分別為總游離氨基酸含量、水解前和水解后樣液中游離氨基酸含量。

    1.2.3 功能特性測定

    1.2.3.1 溶解性測定 采用氮溶解指數(shù)(Nitrogen Solubility Index,NSI)來評價蛋白質(zhì)的溶解性,取0.2g樣品與20mL去離子水混合,用1mol/L HCl或1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為3~9,回旋振蕩0.5h后,6000r/min離心30min,采用微量凱氏定氮法[11]測定樣品和上清液中蛋白質(zhì)的含量。按照下式計算氮溶指數(shù)NSI。

    式中:A、B分別為上清液和水解樣品中蛋白的含量。

    1.2.3.2 乳化性測定 取3mL 1%樣品溶液,用1mol/L HCl或1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH為3、5、6、7、9。加入1mL大豆色拉油,高速分散器(15600r/min)中均質(zhì)1min,立即于容器底部取樣50μL,與5.0mL 0.1%SDS溶液混勻,在波長500nm處測定吸光度,以0.1% SDS溶液作空白。室溫放置10min后再取樣測定,分別按照下式[12]計算乳化活性(Emulsifying Activity Index,EAI)和乳化穩(wěn)定性(Emulsion Stability Index,ESI):

    式中:A0為初始乳化液的吸光度;A10為10min后的吸光度;m為蛋白質(zhì)量,g。

    1.2.3.3 起泡性測定 取20mL 0.5%樣品分別調(diào)整pH為3、5、6、7、9,然后用高速分散器(15600r/min)均質(zhì)2min,分別測定均質(zhì)操作停止時泡沫體積和液體體積之和V0以及分散操作停止10min后的泡沫和液體總體積V1。分別按照下式[7]計算起泡性(Foaming Capacity,FC)和泡沫穩(wěn)定性(Foaming Stability,FS):

    1.2.4 抗氧化性測定

    1.2.4.1 亞鐵離子螯合力的測定 分別取不同濃度(2、3、4、5、6mg/mL)的樣品溶液各1mL,加入1.85mL去離子水和0.05mL 2mmol/L的FeCl2溶液,混合均勻,再加入0.1mL 5mmol/L的菲洛嗪溶液,室溫下靜置10min,3000r/min離心5min后于562nm處測定其吸光度As;以1mL去離子水代替樣液,其余操作同上,測定其在562nm處的吸光度值A(chǔ)b,按照下式[13]計算螯合力:

    1.2.4.2 清除DPPH自由基能力的測定 稱取一定量的DPPH,用無水乙醇配制成0.15mmol/L的DPPH溶液。分別取2mL不同濃度(1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mg/mL)的樣品溶液,加入2mL DPPH溶液,混合均勻,室溫放置30min后,5000r/min離心10min。取上清液于517nm處測定吸光度。樣品對DPPH自由基的清除率用下式[13]計算:

    式中:A0為對照溶液吸光度值;A1為樣品溶液吸光度值;A2為樣品溶液本底吸光度值。

    1.2.4.3 羥自由基清除能力的測定 分別取不同濃度(1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mg/mL)的樣品溶液1mL,加入0.25mL 9mmol/L FeSO4和0.25mL 9mmol/L水楊酸-乙醇溶液,然后加入1.5mL pH 7.4的磷酸鹽緩沖液。最后加1mL H2O2啟動反應(yīng),在37℃反應(yīng)30min,以蒸餾水為參比,510nm下測定各樣液的吸光度。按下式[14]計算羥自由基清除率:

    式中:A0為對照溶液吸光度值;A1為樣品溶液吸光度值;A2為樣品溶液本底的吸光度。

    1.2.4.4 總還原力的測定 在10mL離心管中分別加入0.2mol/L pH6.6的磷酸鹽緩沖液2mL和不同濃度(4、6、8、10、12mg/mL)的溶液2mL,加入2mL 1%鐵氰化鉀,混合均勻后于50℃反應(yīng)20min。取出后加入2mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng),5000r/min離心10min。取上清液2mL,加入2mL蒸餾水和0.5mL FeCl3,混勻后靜置10min,在700nm處檢測吸光度[15]。

    1.3 數(shù)據(jù)分析

    實驗重復(fù)測定3次,結(jié)果表示為平均值±標準偏差(SD)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0軟件進行一維方差分析(one-way ANOVA),差異顯著性采用Duncan(鄧肯)檢驗,檢驗水平p<0.05。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 組分分析及水解度測定

    金帶細鲹魚肉中粗蛋白的含量較高,占干物質(zhì)總量的68.4%±0.75%,是蛋白質(zhì)的良好來源,可作為制備蛋白酶解物和多肽的良好原料,是一種非常值得開發(fā)利用的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源。文中分別采用胰蛋白酶在最適pH 7.0和最適溫度50℃下分別水解0.5、1.5、2.8、8.0h后測定水解度分別為10.8%、14.9%、19.0%、21.7%。

    2.2 水解度對酶解物功能特性的影響

    2.2.1 水解度與pH對酶解物溶解性的影響 溶解性是蛋白質(zhì)主要的功能特性之一,也是蛋白質(zhì)生理功能特性及其他加工功能特性的前提和基礎(chǔ),圖1表示了不同水解度的酶解物在pH3~9的范圍內(nèi)的變化曲線。在整個pH變化范圍內(nèi),溶解性曲線呈先下降后上升的趨勢,并且隨著水解度的增大,樣品的溶解性也增大,水解度為21.7%的樣品NSI值最高達到了88.6%。這可能是蛋白質(zhì)在水解過程中斷裂成小分子肽和氨基酸,這些小分子肽含有較多的極性基團,能與水形成氫鍵,從而增加了溶解性[16]。pH顯著影響酶解物的溶解性(p<0.05),特別是當水解度較低時的樣品的溶解性受pH的影響較大。同時,酶解物的溶解性在pH為4時達到最低,這是因為在等電點附近時,蛋白質(zhì)或肽類分子以兩性離子形式存在,其分子凈電荷為零(即正負電荷相等),此時分子顆粒在溶液中因沒有相同電荷的相互排斥,分子相互之間的作用力減弱,其顆粒極易碰撞、凝聚而產(chǎn)生沉淀,所以在等電點時,其溶解度最小,最易形成沉淀物[17]。

    圖1 水解度對酶解物溶解性的影響Fig.1 Effect of degree of hydrolysis on solubility of hydrolysates

    圖2 不同水解度的酶解物的乳化活性(A)和乳化穩(wěn)定性(B)Fig.2 Effect of degree of hydrolysis on emulsifying activity index(A)and emulsion stability index(B)of hydrolysates

    2.2.2 乳化活性及乳化穩(wěn)定性 由圖2可知,隨著水解度的增大,酶解物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢,這主要是因為蛋白質(zhì)經(jīng)輕度水解后,蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,原來包裹在蛋白質(zhì)分子中的疏水基團暴露出來,蛋白質(zhì)在油/水界面和吸附的能力增強,界面張力降低,增強了蛋白質(zhì)的乳化能力,但是當水解程度過大時,蛋白質(zhì)分子被水解的程度大,形成的小分子肽和氨基酸增多,而小分子肽鏈和氨基酸降低表面張力的效率很低,不能像大分子肽那樣能在油-水界面展開,親水/親油性不足以體現(xiàn)較好的乳化性。

    在整個pH變化范圍內(nèi),酶解物乳化活性呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢,在pH為9時,乳化活性和乳化穩(wěn)定性達到最高值,在pH為3~5處于酶解物的等電點附近,乳化活性和乳化穩(wěn)定性均達到最低,這可能是因為在等電點處酶解物溶解性低,表面靜電荷為零,影響了肽到達油-水界面的速度,肽的吸附、擴散能力減弱,從而影響乳化活性和乳化穩(wěn)定性[12]。

    表1 水解度對酶解物起泡性的影響

    注:表中數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示;同一列中標記不同小寫字母表示差異顯著,p<0.05,表2同。

    表2 水解度對酶解物泡沫穩(wěn)定性(%)的影響

    2.2.3 起泡性及泡沫穩(wěn)定性 由表1和表2可知,在相同的pH下,不同水解度樣品的起泡性和泡沫穩(wěn)定性差異顯著(p<0.05)。隨著pH的逐漸增大,各個水解度樣品的起泡性和泡沫穩(wěn)定性逐漸減弱,這說明水解度和pH是影響酶解物起泡性和泡沫穩(wěn)定性的主要因素。適度的水解處理有利于疏水基團的暴露和多肽鏈的交聯(lián),可形成足夠強度的黏層,使泡沫的穩(wěn)定性增加。但進一步的水解會降低泡沫穩(wěn)定性,這是由于小分子肽沒有能力控制泡沫的穩(wěn)定性[1,10]。同時,在較高的pH下可能由于肽類通過離子排斥的斥力降低了泡沫穩(wěn)定性,因而不同水解度的樣品在不同pH下的泡沫穩(wěn)定性變化無明顯規(guī)律。

    2.3 水解度對抗氧化活性的影響

    2.3.1 亞鐵離子螯合力 金屬離子如亞鐵離子和銅離子能夠參與人體內(nèi)許多氧化反應(yīng),通過催化各種活性氧產(chǎn)生自由基,如羥自由基和超氧陰離子自由基等,尤其是亞鐵離子通過Fenton反應(yīng)生成羥自由基,從而加速脂質(zhì)過氧化鏈式反應(yīng)。此外,亞鐵離子還能催化分解脂質(zhì)過氧化物,導(dǎo)致反應(yīng)生成烷氧自由基和揮發(fā)性氧化產(chǎn)物[18]。因此,金屬離子的螯合作用往往有助于減少脂質(zhì)氧化。不同水解度的酶解物對亞鐵離子的螯合能力如圖3所示。

    圖3 水解度對酶解物螯合Fe2+能力的影響Fig.3 Influence of degree of hydrolysis on Fe2+-chelating ability of hydrolysates

    由圖3可知,酶解物螯合Fe2+的能力隨著濃度的升高而增強(p<0.05),這是因為酶解物濃度越高,就有越多的氨基和羧基螯合Fe2+。而水解度對其螯合Fe2+的能力有不利的影響,較低水解度的樣品表現(xiàn)出較強的Fe2+螯合力,水解度為14.9%的樣品Fe2+螯合率最高達到50.2%±1.20%。水解度為10.8%、14.9%和19.0%的樣品,螯合Fe2+能力顯著大于水解度為21.7%樣品螯合Fe2+能力,且不同水解度的樣品間螯合Fe2+能力差異顯著(p<0.05)。酸性或堿性氨基酸殘基對酶解物的螯合力影響至關(guān)重要,主要是由于這些氨基酸的羧基和氨基參與了螯合金屬離子,所以隨著水解度的增加,酶解產(chǎn)物中游離的具有Fe2+螯合能力的氨基酸含量增加,與亞鐵離子配位,從而減少了游離態(tài)的亞鐵離子的含量[6]。具體的螯合機理和螯合部位還有待進一步的研究。

    2.3.2 DPPH自由基清除能力 由圖4可知,酶解物對DPPH自由基的清除率隨著濃度的升高而增強(p<0.05),水解度為10.8%的樣品在濃度為3.5mg/mL時表現(xiàn)出了最強的清除能力(p<0.05),達到了61.2%±0.62%。但是隨著水解度的增大,酶解物清除DPPH自由基的能力不斷減弱,而在相同濃度下水解度分別為14.9%、19.0%和21.7%的樣品清除DPPH自由基的能力無顯著差異(p>0.05)。從實驗的結(jié)果來看,金帶細鲹魚肉酶解物能作為良好的電子供體,與自由基反應(yīng)終止對人體造成傷害的自由基鏈式反應(yīng)。

    圖4 水解度對酶解物清除DPPH自由基能力的影響Fig.4 Influence of degree of hydrolysis on DPPH radical-scavenging ability of hydrolysates

    2.3.3 羥自由基清除能力 在主要的活性氧自由基中,羥基的反應(yīng)活性是最強的,幾乎能與細胞內(nèi)的所有物質(zhì)發(fā)生反應(yīng),對細胞造成巨大的生物損傷。針對人體的各種疾病,去除羥自由基是最有效的防御機制之一。不同水解度的酶解物對羥自由基的清除能力如圖5所示。

    圖5 水解度對酶解物清除羥自由基的影響Fig.5 Influence of degree of hydrolysis on hydroxyl radical-scavenging activity of hydrolysates

    由圖5可知,不同水解度的酶解物具有較強的清除羥自由基的活性,并且隨著濃度的升高而增強(p<0.05),水解度為10.8%的樣品在濃度為3.5mg/mL表現(xiàn)出了最強的清除能力(p<0.05),清除率達到了62.9%±0.26%,這是因為具有抗氧化作用的活性肽段酶解后不斷的暴露出來,抗氧化作用增強。但是隨著水解度增加其清除率逐漸減弱,這可能是由于隨著水解度的增大活性肽被進一步水解,抗氧化作用逐漸減弱[7,14]。

    2.3.4 還原力 還原力的測定通常被用來評價天然抗氧化劑的供電子或氫的能力,樣品如果具有較高的還原能力則說明具有較強的供電子或氫的能力[15]。由圖6可知,不同水解度的酶解物都具有一定的供電子或氫的能力,并且隨著濃度的增大樣品的還原力也增加。水解度為21.7%的樣品在濃度為12.0mg/mL時表現(xiàn)出了較強的還原能力(p<0.05),吸光度為0.54±0.04。同時,隨著水解度的增加,酶解物的還原力呈現(xiàn)增大的趨勢,這表明在適當?shù)乃舛认?可能有較多的活性氨基酸或肽類被釋放,具有較強的供氫或供電子的能力。

    圖6 水解度對酶解物還原力的影響Fig.6 Influence of degree of hydrolysis on reducing power of hydrolysates

    3 結(jié)論

    金帶細鲹魚肉酶解物的功能特性及抗氧化活性,受到水解度、pH和溶液濃度等因素的影響。具體結(jié)果如下:

    隨著水解度的增大,樣品的溶解性增大,而酶解物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性逐漸降低,起泡性和泡沫穩(wěn)定性也在降低,水解度為10.8%樣品的起泡性顯著高于其他水解度樣品的起泡性(p<0.05)。

    在整個實驗pH范圍內(nèi),酶解物的溶解性和乳化穩(wěn)定性呈先下降后上升的趨勢,且在等電點附近酶解物的溶解性和乳化穩(wěn)定性均達到最低。酶解物的乳化活性隨著pH的增加逐漸增大,而起泡性和泡沫穩(wěn)定性則降低。

    酶解物的抗氧化性隨著溶液濃度的增大而變強,且水解度對其抗氧化性的影響差異較大。水解度為10.8%的酶解物對DPPH自由基和羥自由基的清除率最好,分別達到了61.2%±0.62%和62.9%±0.26%。而水解度為14.9%的酶解物螯合亞鐵離子能力最高,達到了50.2%±1.20%。水解度為21.7%的酶解物表現(xiàn)出最強的還原能力。

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    [18]Moon J-K,Shibamoto T. Antioxidant assays for plant and food components[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2009,57(5):1655-1666.

    Correlation between degree of hydrolysis and antioxidative activity or functional properties of Yellow Stripe Trevally meat protein hydrolysates

    LU Bin1,WANG Zhong-he2,*,FU Li2,WANG Jun2,ZOU Min1

    (1.College of Food Science and Pharmaceutical Sciences,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China;2.Department of Biology,Hanshan Normal University,Chaozhou 521041,China)

    Antioxidative activity and functional properties of hydrolysates from Yellow Stripe Trevally(Selaroidesleptolepis)meat protein,hydrolyzed by trypsin with different degree of hydrolysis(DH,10.8%,14.9%,19.0% and 21.7%),were investigated. Results showed that hydrolysis at lower DH significantly improved the hydroxyl radical-scavenging activity,Fe2+-chelating ability and DPPH radical-scavenging activity(p<0.05). However,hydrolysates at higher DH showed better metal reducing power(p<0.05). Hydrolysis treatment improved the solubility of the hydrolysates,while emulsifying activity and foaming capacity of the hydrolysates decreased as degree of hydrolysis increased. Moreover,solubility and emulsifying properties of the hydrolysates firstly declined then rised as pH increased. However,foaming capacity and foaming stability of the hydrolysates decreased as pH increased. Thus,the above results revealed that appropriate hydrolysis provided an approach to significantly enhance functional properties and antioxidant activity of Yellow Stripe Trevally meat proteins.

    yellow stripe trevally;protein hydrolsate;degree of hydrolysis;functional properties;antioxidant activity

    2014-06-13

    盧彬(1989- ), 男, 碩士, 研究方向:食品加工技術(shù)。

    廣東省自然科學基金項目(S2013040015478);廣東省高校優(yōu)秀青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃項目(2013LYM0056);韓山師范學院青年基金項目(LQ201202);韓山師范學院博士啟動項目(QD20130516 & QD20140324);韓山師范學院一般項目(LY201306);潮州市科技計劃項目(2013X05 & 2013X06)資助。

    TS254.1

    A

    1002-0306(2015)07-0088-06

    10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.009

    *通訊作者:王忠合(1980- ), 男, 博士, 講師, 研究方向:食品加工與安全控制。

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