高血糖對6-OHDA誘導(dǎo)的PD模型大鼠行為學(xué)的影響

買爾哈巴 ，孫景蘭 ，楊新玲 ，賈玉敏 ，耿飛飛

1.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)科VIP1病區(qū)，新疆烏魯木齊 830054；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，新疆烏魯木齊 830054

帕金森病(PD)是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病之一，臨床癥狀包括靜止性震顫，肌強直和運動遲緩等[1]。除遺傳因素外，非遺傳因素的影響：如老齡化，接觸殺蟲劑，飲食，肥胖及糖尿病均與 PD的發(fā)生發(fā)展密且相關(guān)[2-3]。研究表明，糖尿病伴隨著更高的帕金森評定量表(UPDRS)運動功能評分[4],糖尿病發(fā)生肌肉強直和步態(tài)異常的比例顯著高于其他未患糖尿病的老年人[5]。

故該研究在高糖高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素建立糖尿病模型的基礎(chǔ)上，6-羥多巴胺（6-OHDA）單側(cè)毀損法建立高血糖-PD大鼠模型,探討高血糖對PD大鼠行為學(xué)的影響。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級健康雄性SD大鼠90只，體重（200±10）g，2~3 月齡,購于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心實驗動物科學(xué)研究部。在室溫18~22℃，濕度50%~60%，明暗周期12/12 h環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。實驗開始前適應(yīng)環(huán)境1周。

1.1.2 主要藥物及儀器 鏈脲佐菌素(Streptozotocin STZ)，6-羥多巴胺 (6-hydroxydopamine,6-OHDA),阿樸嗎啡(apomorphine,Apo)（均購于美國Sigma公司），大鼠腦立體定位儀，瑞特血糖儀。

1.2 大鼠模型的制備

90只SD大鼠隨機分為正常對照組(n=5)，假手術(shù)組(n=10)，糖尿病組(n=20)，PD 組(n=20)和高血糖-PD 組(n=35)。

1.2.1 糖尿病大鼠模型的制備 高脂高糖飲食聯(lián)合1次性腹腔注射鏈脲佐菌素的方法制備糖尿病大鼠模型[6]。基礎(chǔ)飼料：碳水化合物占 53%，脂肪占 5%，蛋白質(zhì)占23%。高糖高脂飼料：基礎(chǔ)飼料60%、蔗糖20%、豬油10%、蛋黃粉8%、膽固醇 2%。

糖尿病組，高血糖-PD組的55只大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周。4周后，一次性腹腔注射鏈脲佐菌素50 mg/kg，3 d后尾靜脈取血，用瑞特血糖儀測定大鼠隨機血糖，若隨機血糖≥16.7 mmol/L，確定為糖尿病成模大鼠。2周后再測血糖，血糖值居高不下證明模型穩(wěn)定，選入正式實驗。

1.2.2 PD模型的制備 對高血糖PD組中糖尿病模型成功的大鼠及PD組大鼠，采用6-OHDA單側(cè)毀損法建立實驗性PD大鼠模型[7-8]。

腹腔注射30 mg/kg水合氯醛將大鼠麻醉，固定于腦立體定向儀,參照包新民[9]等所著的大鼠腦立體定向圖譜，分別確定右側(cè)黑質(zhì)致密部(Substanianigta Parscompact，SNc) 和中腦腹側(cè)被蓋 (VentralTegmental，VTA)坐標(biāo)：SNc：前囟后(5.0±0.1)mm,矢狀縫右側(cè)(1.5±0.1)mm,硬膜下(7.8±0.1)mm；VTA：前囟后(4.6±0.1)mm,中線右側(cè)(0.9±0.1)mm,硬膜下(7.3±0.1)mm。 按確定坐標(biāo)的位置用牙科鉆小心鉆透顱骨,將10 uL的微量注射器連接于微量推進(jìn)器上，垂直入顱,緩慢進(jìn)針到預(yù)定深度,向SNc和VTA每點注射8 ug 6-OHDA(溶于4 uL含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%抗壞血酸的生理鹽水中),留針10 min緩慢退針(1 mm/min),骨蠟覆蓋鉆孔,常規(guī)縫合傷口。連續(xù)腹腔注射青霉素5萬單位3 d預(yù)防感染。手術(shù)后4周,腹腔注射0.5 mg/kg阿撲嗎啡注射液，人工記錄注射后10~40 min時段大鼠內(nèi)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。若大鼠恒定轉(zhuǎn)向左側(cè),旋轉(zhuǎn)圈數(shù)>7 r/min或者>210r/30 min,則視為成功PD模型。

1.2.3 假手術(shù)組 用PD模型制備的方法向右側(cè)SNc和VTA各注射4 uL生理鹽水(僅含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%抗壞血酸)。正常對照組:不注射任何藥物。

1.3 行為學(xué)分析

在模型成功后第七,十四,二十一,二十八天,固定時間1次/周分別行以下行為學(xué)測試。

1.3.1 自發(fā)行為不對稱分析 觀察大鼠 30 min的異常不自主行為，包括縮頭；拱背；尾巴僵硬、上翹；頭頸、軀干向?qū)?cè)側(cè)彎和扭轉(zhuǎn)，嚴(yán)重者出現(xiàn)姿勢不穩(wěn)；損毀對側(cè)上肢節(jié)律性不自主拍擊動作。將觀察結(jié)果評分，綜合評分等于各部評分之和，記錄數(shù)據(jù)。

評分標(biāo)準(zhǔn)：①頭部運動靈活（0分）、縮頭時間<5 min（3 分）、縮頭時間>5 min（5 分）；②背部運動靈活（0 分）、拱背時間<10 min（3 分）、拱背時間>10min（5 分）；③尾巴柔軟運動靈活（0分）、尾巴僵硬離開地面（3分）、尾巴僵硬上翹彎向背部 （5分）；④頭頸軀干運動靈活（0分）、頭頸軀干向?qū)?cè)側(cè)彎和扭轉(zhuǎn)（3分）、姿勢不穩(wěn)（5分）；⑤四肢運動靈活無不自主運動（0分）、損毀對側(cè)上肢節(jié)律性不自主拍擊動作 1~3次（3分）、損毀對側(cè)上肢節(jié)律性不自主拍擊動作>3次（5分）。

1.3.2 姿勢不對稱性分析 提起鼠尾將大鼠懸空于實驗臺上方約10 cm處,觀察大鼠頭或身體轉(zhuǎn)動的方向,連續(xù)做20次,其中向未損傷側(cè)轉(zhuǎn)動所占的頻率作為評價指標(biāo)[10]。

1.3.3 僵直實驗 （Catalepsy test） 將大鼠的前肢置于9 cm高的橫桿上，秒表記錄前肢移動的潛伏時間，單位為 s[11]。

1.3.4 旋轉(zhuǎn)行為分析 腹腔注射0.5 mg/kg阿撲嗎啡注射液,人工記錄注射后10~40 min時段大鼠內(nèi)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動物模型成功率

在動物模型制備過程中，假手術(shù)組有1只大鼠死亡；糖尿病組有3只死亡，模型成功14只（70%）；PD組模型成功12只（60%）。高血糖-PD組模型成功18只（51.4%）。

2.2 行為學(xué)分析結(jié)果

行為學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PD組及高血糖-PD組自發(fā)行為不對稱分析評分明顯增加，且兩組評分隨時間延長逐漸增加（F=53.04，P<0.01）（如圖 1）；向未損傷側(cè)轉(zhuǎn)動所占的頻率明顯增加（F=54.30，P<0.01）（圖 2）；前肢潛伏時間明顯延長（F=53.04，P<0.01）（圖 3）。 與正常組,假手術(shù)組及糖尿病組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

2.3 組內(nèi)比較

高血糖-PD組自發(fā)行為不對稱分析評分較PD組明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。實驗第二周后，高血糖-PD組前肢潛伏時間較PD組明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

2.4 旋轉(zhuǎn)行為分析

PD組及高血糖-PD組注射 Apo可誘發(fā)異常旋轉(zhuǎn)行為,旋轉(zhuǎn)時多以右側(cè)后肢為支點身體向右側(cè)彎曲,呈頭尾相接狀態(tài)，以旋轉(zhuǎn)次數(shù)≥210次/30 min為陽性標(biāo)準(zhǔn)，隨時間延長，兩組旋轉(zhuǎn)圈數(shù)逐漸增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=44.04，P<0.01）（圖 4）。 但高血糖-PD 組及 PD 組旋轉(zhuǎn)圈數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.04，P>0.05）。

圖1：自發(fā)行為不對稱性分析

圖2：姿勢不對稱性分析

圖3：僵直時間分析

圖4：旋轉(zhuǎn)行為分析

3 討論

6-OHDA單側(cè)損毀模型是目前使用得最多的PD模型之一，這種模型最突出的優(yōu)點是藥物誘發(fā)的旋轉(zhuǎn)行為可被量化，因而一致公認(rèn)為是運動缺陷機制研究的優(yōu)良模型[12]。在此研究中，PD模型成功率為60%，其成功率與文獻(xiàn)[13]報道的 30%～70%相近，在后續(xù)的旋轉(zhuǎn)實驗中，大鼠旋轉(zhuǎn)行為穩(wěn)定，旋轉(zhuǎn)行為隨時間延長逐漸加重，與文獻(xiàn)報道相似。提示該實驗制備的模型是基本可靠的。而高血糖-PD模型成功率為50%，是否與高血糖有關(guān)，還有待于進(jìn)一步的研究證實。

在自發(fā)行為不對稱性研究中，大鼠行為評分在高血糖-PD組模型成功1周后就與PD組有顯著差異，且隨時間延長，運動評分逐漸增大。同時高血糖-PD組僵直時間從第二周開始較PD組明顯增加。上述結(jié)果提示，高血糖可能加重PD大鼠的運動不協(xié)調(diào)能力，隨時間延長，高血糖對PD大鼠行為學(xué)影響會逐漸加重；但高血糖對PD大鼠旋轉(zhuǎn)能力未見明顯影響。目前的研究表明，持續(xù)高血糖引起機體組織的代謝紊亂，可侵犯感覺神經(jīng)、運動神經(jīng)和自主神經(jīng)，累及運動神經(jīng)嚴(yán)重者可導(dǎo)致運動功能障礙；研究證實高血糖對軸性體征、強直及震顫均有加重作用[14]，其可能為PD的危險因素。該實驗證實，高血糖會加重PD大鼠自發(fā)行為不對稱及運動不協(xié)調(diào)性，從行為學(xué)角度證實高血糖可能會加重PD患者的臨床癥狀。

綜上所述，該文從行為學(xué)方面對高血糖與PD之間的關(guān)系進(jìn)行闡述，證實高血糖會加重PD大鼠的臨床癥狀，但是，對于高血糖與PD之間關(guān)系的具體機制目前尚未完全闡明，其有待與下一步的進(jìn)一步研究。

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