肝臟缺血再灌注損傷機制的研究進(jìn)展

關(guān)連越，付佩堯（綜述），李 ?。▽徯＃?/p>

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院肝膽胰外科，長春130033）

肝臟缺血再灌注損傷機制的研究進(jìn)展

關(guān)連越，付佩堯（綜述），李 ?。ǎ獙徯＃?/p>

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院肝膽胰外科，長春130033）

組織經(jīng)歷一定時間的缺血后恢復(fù)血流灌注，不僅無法使組織器官功能得以迅速恢復(fù)正常，反而加重組織器官炎癥反應(yīng)、結(jié)構(gòu)破壞、甚至出現(xiàn)嚴(yán)重功能障礙，這一過程被稱為缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）。這種損傷常發(fā)生于醫(yī)療過程中，如器官移植、溶栓治療、動脈搭橋術(shù)、體外循環(huán)心臟手術(shù)、低血容量性休克等，進(jìn)而出現(xiàn)肝、腦、心、肺、腎、腸等多器官功能損傷，成為影響缺血治療效果的一個重要因素。其中肝臟IRI（HIRI）最為常見和嚴(yán)重，限制了肝切除術(shù)的適應(yīng)癥及邊緣性肝臟供體的應(yīng)用，在不同程度上阻礙了肝臟外科及肝移植的發(fā)展和普及。HIRI可分為熱缺血再灌注損傷及冷缺血再灌注損傷，二者發(fā)生的病理生理過程相似，其機制涉及諸多因素，與代謝障礙、氧化應(yīng)激、細(xì)胞活化、炎癥反應(yīng)等有關(guān)，各個因素形成相互制約、相互促進(jìn)的關(guān)系。近些年，蛋白酶抑制劑、自由基清除劑、鈣通道阻滯劑、某些激素或中藥等均已被證實可從多種途徑有效抑制HIRI。目前，新型免疫抑制的應(yīng)用及基因治療等也逐漸成為人們研究的焦點。本文綜合國內(nèi)外研究資料就HIRI發(fā)生發(fā)展的常見機制（見圖1）加以綜述。

圖1 肝臟缺血再灌注損傷機制

1 無氧代謝與酸中毒

肝臟缺血時，組織處于缺血、缺氧狀態(tài)，細(xì)胞正常的氧化還原過程受阻，細(xì)胞內(nèi)ATP被迅速消耗，依賴于ATP的各種細(xì)胞代謝活動也逐漸停止，無氧酵解增強引起乳酸、酮體等酸性代謝產(chǎn)物的蓄積，加上線粒體氧化磷酸化功能下降，致使組織細(xì)胞間pH值下降，出現(xiàn)代謝性酸中毒。復(fù)流后，pH值隨之恢復(fù)正常，大量pH值依賴性的蛋白酶、磷脂酶等活性增強，反而加重組織器官的損傷，造成HIRI［1］，此為HIRI最常見的機制之一。

2 線粒體損傷及膜滲透性的轉(zhuǎn)變

線粒體是機體氧化磷酸化的主要場所，其參與了HIRI的多個病理生理環(huán)節(jié)。缺血、缺氧狀態(tài)下活性氧及活性氮大量生成，破壞了細(xì)胞氧化磷酸化的過程，使ATP生成障礙，加上胞質(zhì)內(nèi)Ca2＋、Na＋、H＋等離子紊亂引起線粒體內(nèi)離子失衡，最后導(dǎo)致線粒體膜結(jié)構(gòu)及滲透性的改變（mitochondrial membrane permeability transition，MMPT）［2］。這種轉(zhuǎn)變主要表現(xiàn)在線粒體的腫脹及膜電位的下降，使分子量小于1 500kDa的溶質(zhì)可以自由通過線粒體內(nèi)膜［3］。引發(fā)MMPT有多種因素，包括線粒體內(nèi)calpain－like蛋白酶的存在、Ca2＋濃度的升高、氧化劑等。少量MMPT時，溶酶體溶解，氧自由基（ROS）產(chǎn)生加快，ATP消耗，進(jìn)而細(xì)胞色素C釋放至胞漿內(nèi)，引起細(xì)胞凋亡；大量線粒體損傷時，ATP耗竭，細(xì)胞壞死，從而造成HIRI。

3 微循環(huán)衰竭

缺氧導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷破壞了微脈管系統(tǒng)的完整性，進(jìn)而導(dǎo)致血流量的減少，被稱為“無復(fù)流現(xiàn)象”［4］，可能的原因是縮血管物質(zhì)和擴(kuò)血管物質(zhì)的大量產(chǎn)生，以及疾病本身導(dǎo)致的血管反應(yīng)性的改變，造成這些物質(zhì)局部比例失衡并最終導(dǎo)致缺血性損傷［5］。大量的實驗研究也證明了這樣的觀點，首先，移除擴(kuò)血管物質(zhì)一氧化氮（NO）可加重再灌注損傷，而加入外源性NO可減輕損傷［6］，此外，加入左旋精氨酸刺激NO的生成可降低門靜脈壓力，減輕再灌注損傷［7］。另一方面，缺血再灌注期間竇狀內(nèi)皮細(xì)胞（SEC）和巨噬細(xì)胞可產(chǎn)生大量縮血管物質(zhì)，如內(nèi)皮素－1（ET－1），ET－1與肝臟星狀細(xì)胞表面受體結(jié)合通過收縮竇狀隙造成微循環(huán)障礙［8］。應(yīng)用抗ET－1血清、抗內(nèi)皮素單克隆抗體或ET受體拮抗劑可以有效改善再灌注后肝臟微血流，減輕組織損傷，提高細(xì)胞存活率［9，10］。

4 細(xì)胞內(nèi)鈣離子（Ca2＋）超載

在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞膜的選擇通過性維持細(xì)胞內(nèi)相對低鈣狀態(tài)，即鈣穩(wěn)態(tài)。缺血缺氧、氧化應(yīng)激、細(xì)胞膜毒性物質(zhì)等有害因素可引起鈣平衡系統(tǒng)功能失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載。目前研究認(rèn)為，鈣超載是造成肝細(xì)胞損傷的關(guān)鍵機制之一［11］。肝細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞缺氧或復(fù)氧化后可出現(xiàn)細(xì)胞Ca2＋增加，使Ca2＋依賴性酶類，如鈣激活酶、蛋白激酶－C（PKC）、磷脂酶－C、鈣調(diào)蛋白依賴性的蛋白激酶－Ⅱ（CAMkinaseⅡ）和鈣調(diào)磷酸酶（蛋白磷酸酶2B）等活化，在內(nèi)源性底物磷酸化、去磷酸化過程中起到重要作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡或凋亡。因此，胞內(nèi)Ca2＋超載后可引起線粒體內(nèi)氧化磷酸化過程障礙，線粒體膜電位降低，組織ATP含量下降，以及胞漿內(nèi)磷脂酶、蛋白酶等激活，導(dǎo)致細(xì)胞的不可逆性損傷。

5 氧化應(yīng)激

大量研究表明，氧化應(yīng)激過程在IRI中起到重要作用［11，12］。肝組織經(jīng)歷缺血再灌注后，產(chǎn)生大量高活性分子如活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS），前者包括超氧陰離子、羥自由基和過氧化氫等，后者包括一氧化氮、二氧化氮和過氧化亞硝酸鹽等，二者作用機制相似。ROS主要來源包括細(xì)胞溶質(zhì)內(nèi)黃嘌呤氧化酶、KC、黏附的多形核中性粒細(xì)胞，作用于蛋白、酶類、核酸、細(xì)胞骨架、包膜和脂類過氧化物，導(dǎo)致線粒體功能低下和脂類過氧化反應(yīng)；ROS可損傷內(nèi)皮細(xì)胞使微脈管系統(tǒng)的完整性遭到破壞。內(nèi)源性抗氧化物，如超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽、維生素E等都可以抑制ROS的破壞作用。應(yīng)用與腺病毒重組的超氧化物可有效減輕小鼠HIRI［13］。

6 KC和中性粒細(xì)胞的激活

肝臟缺血再灌注后誘發(fā)了體內(nèi)炎性介質(zhì)的復(fù)雜的級聯(lián)反應(yīng)，首先KC被激活，活化的KC釋放出大量促炎因子，包括腫瘤壞死因子（TNF－α），白細(xì)胞介素（IL－1β）［14］，作用于肝細(xì)胞周圍誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。進(jìn)一步使中性粒細(xì)胞聚集、旋轉(zhuǎn)、吸引并隨后從血管腔內(nèi)遷移至肝臟小間隙內(nèi)?；罨闹行粤＜?xì)胞及肝臟實質(zhì)細(xì)胞可通過釋放氧化劑和蛋白酶造成肝損傷。中性粒細(xì)胞生成氧化劑的主要途徑來源于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶，活化的NADPH氧化酶氧化NADPH，釋放出的電子降低氧分子電位，進(jìn)一步產(chǎn)生超氧化物陰離子O2－，過氧化氫H2O2，羥自由基HO·，還原成H2O，從中性粒細(xì)胞中釋放出的髓過氧化物酶（以鹵化物形式存在的如Cl－）可以使過氧化氫H2O2轉(zhuǎn)變成次氯酸HOCl（另一種強效氧化劑），上述氧化劑的產(chǎn)生可直接造成肝細(xì)胞的損傷和（或）通過滅活內(nèi)源性抗蛋白酶系統(tǒng)活性促進(jìn)蛋白酶介導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷。

7 細(xì)胞間黏附分子和內(nèi)毒素的作用

細(xì)胞間黏附分子（ICAM－1），即CD54，在正常肝組織的SEC、血管內(nèi)皮細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞中微弱表達(dá)，在實質(zhì)性細(xì)胞內(nèi)無表達(dá)。ICAM－1可通過與淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原（LFA－1）的結(jié)合介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞間，T、B淋巴細(xì)胞間，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞間的相互作用，促進(jìn)免疫系統(tǒng)的激活及免疫應(yīng)答的發(fā)生。再灌注期間，活化的KC釋放炎性介質(zhì)如TNF－α、IL－1等，可激活SEC和肝細(xì)胞，使ICAM－1的表達(dá)增加。ICAM－1可通過與其受體LFA－1的結(jié)合，促進(jìn)中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的粘附、遷移、趨化，活化后釋放蛋白酶、氧化劑等造成肝細(xì)胞的損傷。有研究表明內(nèi)毒素也參與了肝臟缺血再灌注損傷的過程［15］，肝臟缺血時一方面肝細(xì)胞功能下降，清除內(nèi)毒素能力減弱，另一方面，腸黏膜屏障受損，菌群移位，釋放內(nèi)毒素入血可經(jīng)門靜脈回流入肝，進(jìn)而激活KC，釋放促炎介質(zhì)，活化中性粒細(xì)胞，通過NADPH氧化酶生成大量氧自由基加重肝損傷。

8 細(xì)胞死亡

近些年，許多實驗性數(shù)據(jù)均證實細(xì)胞凋亡存在于肝臟缺血再灌注過程中。基于TUNEL分析法、DNA梯度法和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）活性的檢測，判定再灌注期間有50%－70%的內(nèi)皮細(xì)胞和40%－60%肝細(xì)胞發(fā)生凋亡［16］。然而仔細(xì)查閱這些數(shù)據(jù)，會發(fā)現(xiàn)一系列的疑問［17］，①單純應(yīng)用TUNEL分析法判定細(xì)胞凋亡并不合適，因為DNA鏈的瓦解同樣存在于細(xì)胞腫脹性壞死過程中；②最小含量的caspase的活化與所謂的大規(guī)模的細(xì)胞凋亡沒有明顯的關(guān)聯(lián)；③即刻細(xì)胞內(nèi)容物的釋放和炎癥反應(yīng)與認(rèn)為凋亡是細(xì)胞唯一死亡形式的看法不一致；④過度表達(dá)Bcl－2可同時抑制細(xì)胞的凋亡和壞死；⑤GUJRAL等人的研究結(jié)果基于形態(tài)學(xué)的判定標(biāo)準(zhǔn)，在熱缺血60分鐘后，發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞發(fā)生凋亡的比例從未超過1%－2%，因此推斷細(xì)胞腫脹性壞死是肝臟缺血再灌注期間細(xì)胞的主要損傷形式，而并非凋亡［18］。類似的結(jié)果也出現(xiàn)在冷保存再灌注的實驗研究中［19］。

9 細(xì)胞因子的作用

細(xì)胞因子在HIRI過程中起著抗炎、促炎反應(yīng)的雙重作用，TNF－α是促進(jìn)炎癥級聯(lián)反應(yīng)的主要因素，它由KC活化后分泌，可通過旁分泌和內(nèi)分泌途徑作用于周圍組織和遠(yuǎn)隔器官，是HIRI后繼發(fā)遠(yuǎn)隔器官損傷的關(guān)鍵因素［20］。TNF－α的上調(diào)將直接導(dǎo)致肝臟的損傷，TNF－α與肝細(xì)胞表面受體結(jié)合后，使上皮中性粒細(xì)胞活化肽78（ENA－78）和ROS生成增多，同時激活核因子kB（NF－kB）和絲裂源活化蛋白激酶（MAPK）c－Jun氨基端激酶（JNK）［21］。此外，TNF－α還能上調(diào)ICAM－1、血管細(xì)胞黏附分子－1（VCAM－1）和P－選擇素的表達(dá)［20，22］。上述這些介質(zhì)可通過各種途徑，使白細(xì)胞聚集、活化并進(jìn)入缺血后的肝臟，而且，JNK和ROS可以直接作用于細(xì)胞造成肝臟損傷。其它一些重要的細(xì)胞因子還包括γ干擾素（IFN－γ）、肝細(xì)胞生長因子、IL－1β、IL－6、IL－10、IL－23、IL－13、IL－18血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）［2330］。這些細(xì)胞因子的表達(dá)受到大量可變的上游調(diào)控者的控制，下游方面，這些因子影響多種分子的表達(dá)，在缺血損傷過程中要么起到保護(hù)作用，要么起到破壞作用。

小結(jié)：IRI的病理生理機制是一個多組織器官、多種因素、多種學(xué)科交叉關(guān)聯(lián)并相互制約的復(fù)雜過程，氧化應(yīng)激反應(yīng)、代謝障礙、細(xì)胞凋亡、活化細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)等被認(rèn)為參與其主要過程，但仍存在許多未知因素；肝臟是體內(nèi)產(chǎn)生細(xì)胞因子的主要器官，也是諸多細(xì)胞因子作用的靶器官之一，HIRI可嚴(yán)重影響肝臟術(shù)后功能，甚至出現(xiàn)不可逆的損傷，進(jìn)而出現(xiàn)多器官功能障礙的級聯(lián)反應(yīng)；針對HIRI的防治方法多種多樣，如自由基清除劑、蛋白酶抑制劑、NO、鈣通道阻滯劑、中醫(yī)中藥、缺血預(yù)處理等，但尚無一種完備的措施，目前多種防治措施的聯(lián)合應(yīng)用已經(jīng)在臨床實驗中取得了良好的保護(hù)效果。因此，進(jìn)一步探尋IRI的發(fā)生機制及并據(jù)此研制出更有針對性的防治措施將對未來肝臟外科的發(fā)展起到至關(guān)重要的作用。

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2015－03－28）

1007－4287（2015）09－1602－04

國家自然科學(xué)基金（81170416）；天普研究基金（01201046）；吉林省科技廳國際合作研究基金（2011742）；吉林省自然科學(xué)基金（201015178）

＊通訊作者