miR－133a對(duì)惡性黑色素瘤的膜突蛋白表達(dá)及侵襲能力的影響

Aparicio Avichacra Carlos Edgar Emilio 王繼綱，2 楊海萍 丁 笛 劉秀萍 許祖德

（1復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系 上海 200032；2青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科 青島 266003；3山東省淄博市臨淄區(qū)人民醫(yī)院病理科 淄博 255400）

惡性黑色素瘤（malignant melanoma，MM）是一種常見(jiàn)的皮膚惡性腫瘤，該腫瘤侵襲力強(qiáng)、對(duì)放化療不敏感、死亡率高。近年來(lái)MM的發(fā)病率明顯上升，在西方發(fā)達(dá)國(guó)家其發(fā)病率上升速度可能僅次于肺癌[1］。

MM預(yù)后不良的主要因素是其高侵襲轉(zhuǎn)移力[2－3］。早期發(fā)現(xiàn)和早期治療是目前臨床上改善MM患者生存率的唯一手段，進(jìn)一步深入研究MM侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制意義重大。近年來(lái)研究表明，F(xiàn)ERM蛋白家族成員的膜突蛋白（moesin）與哺乳動(dòng)物MM細(xì)胞浸潤(rùn)能力相關(guān)[4］。TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索結(jié)果提示微小 RNA－133a （microRNA－133a，miR－133a）可能是moesin的調(diào)節(jié)因子，其靶向結(jié)構(gòu)是其信使 RNA3′－UTR區(qū)域[5］。本研究目的是證實(shí)miR－133a對(duì)人類 MM細(xì)胞moesin表達(dá)及體外遷移侵襲能力的調(diào)節(jié)作用，探討miR－133a調(diào)控 MM細(xì)胞遷移侵襲的可能機(jī)制。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)材料 SK－mel－28細(xì)胞（美國(guó)ATCC公司，Cat＃HTB－72），該細(xì)胞株具有早期轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)；A375細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)）的侵襲能力相對(duì)較低；正常成人表皮色素細(xì)胞（美國(guó)ATCC公司，Cat＃PSC－200－013）。lipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)Invitrogen公司，Cat＃11668－027）。miR－133a全長(zhǎng)過(guò)表達(dá)質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P公司構(gòu)建。Meosin抗體（美國(guó) Cell Signaling公司，Cat＃3146），Actin（美國(guó) Santa Cruz公司，Cat＃ sc－8432），HRP兔二抗（美國(guó)Proteintech公司，Cat＃SA00001－2）。Western blot發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司（Cat＃34076）。Prime Script RT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連Takara公司，Cat＃DRR036A）。TaqMan?MicroRNA檢測(cè)試劑盒（美國(guó)ABI公司）。Meosin引物序列為Forward：3′－TGTAAACC－AGAGAGCTGCTGG－5′，

Reverse： 3′－GAAGAGCACACATGAGACAGAGAA－5′，由上海生工公司合成。

細(xì)胞培養(yǎng) SK－mel－28細(xì)胞培養(yǎng)于EMEM 培養(yǎng)基，A373培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，正常成人表皮色素細(xì)胞采用黑素細(xì)胞培養(yǎng)試劑盒配制的真皮細(xì)胞基底培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)加10%血清，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，達(dá)30%～50%匯合度時(shí)，根據(jù)Lipo2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24 h提取RNA，48 h收集蛋白進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)行侵襲遷移實(shí)驗(yàn)時(shí)，收集轉(zhuǎn)染后24 h的細(xì)胞進(jìn)行處理。

Western blot檢測(cè) 以細(xì)胞裂解液提取總蛋白，首先測(cè)定蛋白濃度以保證上樣量相同。SDSPAGE電泳后，65 V恒壓電轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，滴加一抗（1∶125）室溫孵育1 h，4℃過(guò)夜，TBS緩沖液漂洗后加HRP二抗，室溫孵育1 h后發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。表達(dá)相對(duì)定量采用Quantity One軟件。

定量RT－PCR（qRT－PCR）檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染24 h細(xì)胞，培養(yǎng)至80%匯合時(shí)收集細(xì)胞，Trizol提取總RNA后檢測(cè)RNA濃度，然后采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成逆轉(zhuǎn)錄cDNA（上樣量500 ng，37℃15 min），按TaqMan?MicroRNA Assays方案進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30 s，40個(gè)循環(huán)，95℃20 s，62℃40 s。相對(duì)表達(dá)率采用2－ΔΔCT法計(jì)算。

細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 2D細(xì)胞遷移能力檢測(cè)采用劃痕法，各組細(xì)胞接種于12孔板，待細(xì)胞達(dá)到100%匯合后用100μL槍頭劃痕，PBS清洗去除劃下的細(xì)胞，更換培液后繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24、48 h后取樣、拍照。

3D細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)采用具有聚碳酸酯微孔濾膜（孔徑8μm）的Transwell小室（Cat＃342）來(lái)評(píng)定，每孔種植1×105細(xì)胞，用200μL無(wú)血清培液重懸，下室內(nèi)置含30%血清的培液作為化學(xué)趨化物。培養(yǎng)3、6、9、12 h后取出小室，仔細(xì)去除未穿透細(xì)胞后結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍，取其均數(shù)表示，采用t檢驗(yàn)比較各組間相對(duì)表達(dá)水平差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

miR－133a對(duì)MM細(xì)胞中moesin表達(dá)的影響qRT－PCR結(jié)果顯示 MM細(xì)胞系中miR－133a的表達(dá)量要低于正常色素細(xì)胞，其中SK－mel－28細(xì)胞尤為明顯，轉(zhuǎn)染后MM細(xì)胞miR－133a的表達(dá)明顯增強(qiáng)（圖1A）。

qRT－PCR和Western blot結(jié)果顯示兩種MM細(xì)胞系中moesin RNA以及蛋白的表達(dá)水平要高于正常色素細(xì)胞，這種差別在SK－mel－28細(xì)胞尤為明顯尤為明顯（圖1B）。而miR－133a轉(zhuǎn)染后，MM細(xì)胞系的moesin RNA和蛋白表達(dá)水平有明顯下降，其中SK－mel－28細(xì)胞變化更為顯著；兩種MM細(xì)胞之間的表達(dá)差異也不復(fù)存在（圖1C）。

圖1 SK－mel－28和A375細(xì)胞中miR－133a對(duì)meosin表達(dá)水平的影響Fig1 The regulating effect of miR－133aon the expression of meosin in SK－mel－28and A375cell lines

細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測(cè) 劃痕法檢測(cè)MM細(xì)胞遷移能力結(jié)果顯示，MM細(xì)胞系SK－mel－28和A375在miR－133a轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)12～48 h的細(xì)胞遷移匯合能力較相應(yīng)對(duì)照組均有明顯的下降。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果同樣顯示，SK－mel－28和A375在miR－133a轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)3～24 h，細(xì)胞穿膜能力較相應(yīng)對(duì)照組均有明顯的下降（圖2）。

討 論

圖2 Sk－mel－28和A375細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR－133a后的侵襲轉(zhuǎn)移能力 （×400）Fig2 The migration and infiltration abilities of Sk－mel－28and A375cell lines after miR－133atransfection（×400）

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟過(guò)程，其中腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和遷移能力是主要的影響因素[6］。而細(xì)胞的遷移過(guò)程中肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架起著關(guān)鍵作用，已知許多內(nèi)在因素可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的聚合和解聚，其中廣受重視的是FERM蛋白家族[7］。FERM蛋白家族已發(fā)現(xiàn)有50多個(gè)成員。moesin是FERM家族一個(gè)成員，相對(duì)分子質(zhì)量為75000，其可以通過(guò)調(diào)節(jié)分子內(nèi)N端FERM與C末端結(jié)構(gòu)域結(jié)合而阻止F－肌動(dòng)蛋白和膜蛋白的結(jié)合。有文獻(xiàn)顯示MM[7］和其他腫瘤[8］細(xì)胞中 moesin高表達(dá)，頭頸部鱗癌中 moesin高表達(dá)其預(yù)后差[9－11］，提示 moesin對(duì)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)具有重要的意義。

本研究采用qRT－PCR和Western blot觀察了兩種不同侵襲能力的MM細(xì)胞系中moesin的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常色素細(xì)胞相比，MM細(xì)胞中moesin均呈高表達(dá)，這不僅表現(xiàn)為基因轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)，也表現(xiàn)為蛋白表達(dá)的增加，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[4，10］。而 MM細(xì)胞間moesin的表達(dá)也有顯著的差異，SK－mel－28的moesin表達(dá)量明顯高于A375，這種差異也與兩種細(xì)胞侵襲能力的不同一致。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果再次提示moesin影響了MM細(xì)胞的遷移和侵襲，對(duì)moesin進(jìn)行檢測(cè)可以有助于了解MM的生物學(xué)行為。

miRNAs是一類19～22個(gè)核苷酸構(gòu)成的非編碼小分子RNA，其在個(gè)體發(fā)生、分化、凋亡、細(xì)胞增生和衰老等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[13］。miR－133a正常表達(dá)于骨骼肌和心肌細(xì)胞，許多研究顯示miR－133a重建和高表達(dá)對(duì)具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲的作用[5，14－16］。TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)檢索顯示miR－133a可能是moesin的調(diào)節(jié)因子，其靶向結(jié)構(gòu)是信使RNA3′－UTR 區(qū)域[5］。

本研究采用miR－133a轉(zhuǎn)染技術(shù)探討miR－133a對(duì)MM細(xì)胞moesin表達(dá)的影響作用，進(jìn)而探討MM細(xì)胞遷移和侵襲的內(nèi)在機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MM細(xì)胞miR－133a的表達(dá)量較正常色素細(xì)胞低，這種現(xiàn)象在 SK－mel－28尤為明顯。轉(zhuǎn)染 miR－133a 后MM細(xì)胞的moesin的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)均有明顯下降，這與在食道癌中的研究結(jié)果一致[17］。劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)則發(fā)現(xiàn)miR－133a轉(zhuǎn)染后MM細(xì)胞隨著moesin表達(dá)下降，其體外遷移和侵襲能力也顯著下降。本研究發(fā)現(xiàn)miR－133a轉(zhuǎn)染后兩種MM細(xì)胞系間原本存在的moesin表達(dá)、遷移和侵襲能力方面的差異不復(fù)存在。這些結(jié)果強(qiáng)烈提示miR－133a可以下調(diào)MM細(xì)胞的moesin表達(dá)，進(jìn)而抑制MM細(xì)胞的遷移和侵襲。

綜上所述，本研究的結(jié)果證明了miR－133a是moesin的上游調(diào)節(jié)因子之一，其能夠通過(guò)對(duì)MM細(xì)胞moesin的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響MM細(xì)胞的生物學(xué)行為。進(jìn)一步深入研究?jī)烧叩年P(guān)系，有助于深入了解MM的發(fā)生和轉(zhuǎn)移機(jī)制，對(duì)改善MM預(yù)后以及新的治療方案的研究具有重要意義。

[1]Rastrelli M，Alaibac M，Stramare R，et al.Melanoma m（zero）：diagnosis and therapy[J］.ISRN Dermatol，2013，2013：616170.

[2]Perlis C，Herlyn M.Recent advancesin melanoma biology[J］.Oncologist，2004，9（2）：182－187.

[3]Chudnovsky Y，Khavari PA，Amy E.Adams Melanoma genetics and the development of rational therapeutics[J］.J Clin Invest，2005，115（4）：813－824.

[4]Estecha A，Sánchez－Martín L，Puig－Kr?ger A，et al.Moesin orchestrates cortical polarity of melanoma tumour cells to initiate 3D invasion[J］.J Cell Sci，2009，122（Pt19）：3492－3501.

[5]Kinoshita T，Nohata N，F(xiàn)use M，et al.Tumor suppressive microRNA－133a regulates novel targets： moesin contributes to cancer cell proliferation and invasion in head and neck squamous cell carcinoma[J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，418（2）：378－383.

[6]Geiger TR，Peeper DS.Metastasis mechanisms [J］.Biochim Biophys Acta，2009，1796（2）：293－308.

[7]Lallemand D，Arpin M.Pigment Cell MelanomaMoesin／ezrin：a specific role in cell metastasis？[J］.Pigment Cell Melanoma Res，2010，23（1）：6－7.

[8]Li Q，Gao H，Xu H，et al.Expression of ezrin correlates with malignant phenotype of lung cancer，and in vitro knockdown of ezrin reverses the aggressive biological behavior of lung cancer cells[J］.Tumour Biol，2012，33（5）：1493－1504.

[9]Saito S，Yamamoto H，Mukaisho K，et al.Mechanisms underlying cancer progression caused by ezrin overexpression in tongue squamous cell carcinoma[J］.PLoS One，2013，8（1）：e54881.

[10]Fischer CA，Jung M，Zlobec I，et al.Co－overexpression of p21 and Ki－67 in head and neck squamous cell carcinoma relative to a significantly poor prognosis[J］.Head Neck，2011，33（2）：267－273.

[11]Madan R，Brandwein－Gensler M，Schlecht NF，et al.Differential tissue and subcellular expression of ERM proteins in normal and malignant tissues：cytoplasmic ezrin expression has prognostic significance for head and neck squamous cell carcinoma[J］.Head Neck，2006，28 （11）：1018－1027.

[12]Xie JJ，Xu LY，Xie YM，et al.Roles of ezrin in the growth and invasiveness of esophageal squamous carcinoma cells[J］.Int J Cancer，2009，124（11）：2549－2558.

[13]Nohata N，Hanazawa T，Enokida H，et al.microRNA－1／133a and microRNA－206／133b clusters：dysregulation and functional roles in human cancers[J］.Oncotarget，2012，3（1）：9－21.

[14]Kano M，Seki N，Kikkawa N，et al.MiR－145，miR－133a and miR－133b：tumor－suppressive miRNAs target FSCN1 in esophageal squamous cell carcinoma [J］Int J Cancer，2010，127（12）：2804－2814.

[15]Nohata N，Hanazawa T，Kikkawa N，et al.Caveolin－1 mediates tumor cell migration and invasion and its regulation by miR－133a in head and neck squamous cell carcinoma[J］.Int J Oncol，2011，38 （1）：209－217.

[16]Nohata N，Hanazawa T，Kikkawa N，et al.Identification of novel molecular targets regulated by tumor suppressive miR－1／miR－133a in maxillary sinus squamous cell carcinoma[J］.Int J Oncol，2011，39 （5）：1099－1107.

[17]Sakai NS，Samia－Aly E，Barbera M，et al.A review of the current understanding and clinical utility of miRNAs in esophageal cancer[J］.Semin Cancer Biol，2013，23（6 Pt B）：512－521.