硬皮病伴發(fā)肺間質(zhì)病變小鼠模型的建立及發(fā)病機制研究

張 立 李 正 曾海英 王 強

（1復旦大學附屬中山醫(yī)院皮膚科，2實驗研究中心，3病理科 上海 200032）

硬皮?。╯ystemic scleroderma，Ssc）是以局限性或彌漫性皮膚和內(nèi)臟器官結(jié)締組織的纖維化或硬化，最后發(fā)生萎縮為特點的疾病。是一種系統(tǒng)性或全身性自身免疫病，與系統(tǒng)性紅斑狼瘡和皮肌炎／多發(fā)性肌炎等都歸類于自身免疫病范疇。近年來發(fā)現(xiàn)，硬皮病伴發(fā)肺間質(zhì)病變（interstitial lung disease，ILD）發(fā)生率高達25%～90%[1］，且是Ssc致死的首要原因。然而，目前硬皮病伴發(fā)肺間質(zhì)病變（Ssc－ILD）發(fā)病機制仍不清楚，值得深入研究。本課題組通過不斷調(diào)整博來霉素（bleomycin，BLM）濃度來摸索建立Ssc－ILD小鼠模型的適宜條件，最終以C3H／He小鼠局部（背部皮膚）皮下注射0.4 mg／mL BLM成功建模，小鼠肺部可見典型的炎癥和纖維化。我們通過HE和Masson染色明確模型的可靠性，并通過檢測羥脯氨酸了解纖維化程度及免疫組化檢測CD8＋T細胞、CD68＋巨噬細胞、TGF－β1、IL－23、collagen－1、MMP－9和α－SMA 來初步探討Ssc－ILD的發(fā)病機制。

材料和方法

實驗動物 8只SPF級C3H／He小鼠由上海復旦大學附屬中山醫(yī)院動物中心提供，雌性，6周齡，體質(zhì)量（20±2）g，于清潔級動物實驗室飼養(yǎng)。飼養(yǎng)1周后進行實驗。每只小鼠背部中央?yún)^(qū)域去毛使皮膚裸露，便于注射和觀察。隨機等分為兩組，分別為造模組和對照組。

BLM局部皮下注射建模 鹽酸博來霉素粉劑（日本化學株式會社，規(guī)格15 mg／支）用PBS緩沖液（pH＝7.4）配制成濃度為3 mg／mL溶液，置于－20℃冰箱保存，臨用前稀釋成濃度為0.4 mg／mL的BLM。造模組在每天相同時間用0.4 mg／mL BLM背部皮膚皮下注射0.1 mL；對照組于相同部位皮下注射0.1 mL PBS，連續(xù)注射28天。

動物處理 觀察實驗過程中小鼠背部皮膚變化及被毛生長情況、活動度及健康狀況。于第29天處死小鼠取標本。首先取皮，于注射部位處取1 cm×1 cm皮膚標本，一部分置于液氮中待測羥脯氨酸，另一部分浸于4%中性甲醛溶液中，待測病理和免疫組化；接著取肺，左葉存于液氮中，右葉浸于4%中性甲醛溶液中。

組織病理學觀察 皮膚及肺組織標本予以4%中性甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，切片（厚度3 μm），行常規(guī)HE染色及Masson染色。HE染色切片用Leica病理圖像分析系統(tǒng)測定皮膚真皮厚度[2］，每張切片隨機取5個部位檢測真皮厚度（即表皮與皮下組織之間的真皮垂直距離），取均值進行統(tǒng)計，比較造模組與對照組的差異。Masson染色切片用Leica圖片定量分析系統(tǒng)測定其組織化學染色圖像[3］，每張切片隨機取3處視野（×200），以藍色為陽性，先選中視野范圍內(nèi)所有組織（除去空白部分）記錄組織總面積，再選中藍色部分記錄膠原面積，計算膠原面積百分比（膠原面積百分比＝膠原面積／組織總面積）。

膠原含量分析 取大小約0.3 cm×0.3 cm的皮膚和肺組織，加生理鹽水用勻漿器研磨成10%的勻漿。用羥脯氨酸試劑盒（南京建成生物工程研究所）進行檢測，加設(shè)標準品管，與待測樣品管一同水浴消化，先后加Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 液，2000×g離心10 min。取上清液在分光光度計550 nm處（1 cm光徑）空白管調(diào)零后檢測各標本吸光度。各管羥脯氨酸含量的計算公式：羥脯氨酸含量＝（測定D值－空白D值）／（標準D值－空白D值）×標準品濃度÷樣本含量／所加勻漿介質(zhì)。根據(jù)羥脯氨酸在膠原蛋白中占13.4%換算成膠原蛋白含量。

免疫組化染色 皮膚和肺組織經(jīng)4%中性甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片，CD8＋、CD68＋、TGF－β1、IL－23、collagen－1、MMP－9、α－SMA 抗體（抗體工作濃度為1∶100，美國Abcam公司）孵育，用二步法EnVision（ChemMafeTMEnVision＋／HRP），DAB顯色[二步法抗兔／鼠通用型免疫組化檢測試劑盒，基因科技（上海）有限公司］，進行免疫組化染色。在組織細胞膜或細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒的為陽性，在200倍光學顯微鏡下隨機選取3個視野，用Image Pro－Plus 6.0分析軟件定量分析。

統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

小鼠形態(tài)觀察 造模組：背部皮膚注射部位出現(xiàn)皮膚顯著增厚、硬化，彈性變差，注射點有破潰和結(jié)痂現(xiàn)象，毛發(fā)未恢復生長，小鼠體型變??；對照組：注射部位皮膚無明顯變化，彈性較好，注射點無結(jié)痂，毛發(fā)恢復生長，小鼠體型無明顯變化（圖1）。

圖1 小鼠大體形態(tài)變化Fig1 The general changes of mice

皮膚組織病理學觀察 造模組小鼠相比對照組HE染色結(jié)果（圖2A）顯示真皮層顯著增厚[圖2D，（407.78±15.20）μmvs.（125.16±7.04）μm，P＜0.01］，膠原纖維束數(shù)量增多，形狀增粗，排列緊密，向深部擴展至部分替代皮下脂肪組織；在真皮深部看到典型的血管壁增厚纖維化（圖2C）。對照組小鼠皮膚組織無明顯病理改變。

皮膚纖維化程度 造模組和對照組小鼠皮膚膠原面積百分比分別為75.23%±0.98%和13.84%±3.87%（圖2B），皮膚膠原含量分別為（450.00±37.64）μg／g和（193.12±13.21）μg／g，造模組均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，圖2E、圖3）。同時發(fā)現(xiàn)，膠原以Ⅰ型膠原為主，并且造模組與對照組相比含量顯著增多（圖4A，63.45±5.90 vs.6.39±0.78，P＜0.01）。

圖2 小鼠皮膚組織學變化Fig2 Histological changes in the skins of mice

A：HE staining（×200）；B：Masson′s staining（×200）；C：Thickened wall of small blood vessel in dermis（×200）；D：Skin thickness；E：Collanen area rate.vs.Control group，（1）P＜0.01.

圖3 小鼠皮膚和肺膠原含量比較Fig3 Comparison of content of collagen in skin and lung of mice

圖4 小鼠皮膚和肺的Ⅰ型膠原含量比較Fig4 Comparison of collagenⅠin skin and lung fo mice

組織病理學觀察 造模組小鼠肺組織中可見肺泡間隔增寬伴有炎性細胞滲出及浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)破壞；對照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)正常（圖5A）。

肺部炎癥程度 造模組和對照組小鼠肺部組織炎性細胞滲出主要為CD8＋T細胞（圖6A，40.37±1.07 vs.10.36±0.66，）和CD68＋巨噬細胞（圖6B，32.06±0.43 vs.5.83±0.31），造模組均顯著高于對照組；造模組細胞因子IL－23也顯著高于對照組（圖6C，30.36±1.52 vs.6.87±0.41，P＜0.01）。

圖5 小鼠肺部組織學變化Fig5 Histological changes in the lungs of mice

圖6 小鼠肺部組織炎癥變化Fig6 Changes of inflammation in the lungs of mice

纖維化程度 造模組和對照組小鼠肺組織膠原面積百分比分別為47.38%±5.01%和7.93%±3.97%（P＜0.01），兩組肺組織膠原含量分別為（314.93±23.96）μg／g和（142.62±9.36）μg／g，造模組均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（圖5C，P＜0.01）。造模組的Ⅰ型膠原表達顯著增高（圖4B，22.79±1.60 vs.12.58±0.51，P＜0.01）；TGF－β1表達顯著增多（圖7A，28.58±2.29 vs.5.17±0.74，P＜0.01）；MMP－9表達顯著增多（圖 7B，53.59±3.50 vs.5.27±1.8，P＜0.01）；標記肌成纖維細胞的α－SMA表達顯著增高（圖7C，50.64±1.19 vs.4.99±1.07，P＜0.01）。

圖7 小鼠肺組織纖維化指標變化Fig7 Changes of fibrosis in the lungs of mice

討 論

ILD是增加Ssc等結(jié)締組織病住院率和死亡率的首要原因，因此通過建立Ssc－ILD動物模型來探究其發(fā)病機制并尋找新的靶點，可為防治該組疾病提供新的思路。自Yamamoto等[4］成功誘導小鼠皮膚硬化以來，國內(nèi)外眾多學者嘗試建立Ssc動物模型。文獻報道，C3H／He等小鼠是對BLM十分敏感的動物品系[5］。BLM是一種廣泛運用于腫瘤治療的化療藥物，其不良反應包括肺纖維化或硬皮病樣改變[6］。本研究前期發(fā)現(xiàn)，給予濃度0.1 mg／mL BLM連續(xù)皮下注射28天，小鼠皮膚出現(xiàn)輕度增厚，但肺部并沒有炎性改變（圖8A）；而當調(diào)整濃度至0.2 mg／mL時，小鼠皮膚增厚明顯，而肺泡壁輕度增寬但不明顯（圖8B）；最終當濃度調(diào)整至0.4 mg／mL時，出現(xiàn)典型的皮膚硬化和肺部組織ILD改變，提示BLM的致肺部纖維化作用是呈濃度依賴性的，對臨床化療中用BLM的濃度有一定的提示意義。

本課題組在國內(nèi)首次成功建立Ssc－ILD動物模型：以濃度為0.4 mg／mL BLM對C3H／He小鼠進行連續(xù)28天局部皮下注射，成功建立Ssc－ILD模型；小鼠不僅皮膚產(chǎn)生與Ssc相似的組織病理學改變，并且肺部組織也出現(xiàn)顯著炎癥和纖維化。在此基礎(chǔ)上，本課題組初步探討Ssc－ILD的發(fā)病機制。

炎癥和纖維化是Ssc的特征性改變，由炎性細胞和細胞因子共同作用，導致成纖維細胞的活化和細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積[7］。其中，轉(zhuǎn)化生長因子－β（TGF－β）參與纖維化的全過程，在Ssc發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用[8］；尤其是TGF－β1，能促進成纖維細胞增殖分化為表達α－SMA的肌成纖維細胞，并分泌大量的ECM，啟動纖維化過程[9－10］。Yamamoto 等[11］研究發(fā)現(xiàn)抗TGF－β治療后，α－SMA表達顯著減少，進一步肯定了TGF－β對成纖維細胞的刺激作用。有學者發(fā)現(xiàn)TGF－β致肺纖維化是通過下調(diào)成纖維細胞和單核細胞中的小凹蛋白－1（caveolin－1）；因為Ssc患者成纖維細胞和單核細胞釋放TGF－β增多使caveolin－1表達減少，從而抑制Smad3磷酸化同時增加TGF－β配體的內(nèi)吞和降解，最終導致纖維化[12－13］。本研究結(jié)果表明，皮膚真皮顯著增厚，膠原纖維堆積，小血管壁增厚纖維化；其中，TGF－β－1、collagen1、α－SMA 在造模組中顯著增多，提示TGF－β1參與Ssc皮膚硬化過程，且可能是通過α－SMA導致真皮層collagen－1增多。

圖8 0.1和0.2mg／mL BLM注射小鼠皮膚和肺變化（×200）Fig8 Changes of skin and lung after injection of BLM at concentration of 0.1and 0.2mg／mL（×200）

在Ssc－ILD中，成纖維細胞是肺纖維化啟動和維持的主要細胞類型，并通過TGF－β介導，釋放大量Ⅰ型膠原蛋白[14］。TGF－β1是炎癥進展為纖維化的重要中間介質(zhì)[15］。Ssc－ILD引起肺部炎癥微環(huán)境發(fā)生變化，TGF－β、單核細胞趨化因子－1、巨噬細胞炎性蛋白等上調(diào)，導致淋巴細胞聚集和膠原纖維的沉積[16］。炎性細胞如T細胞、巨噬細胞等參與Ssc的發(fā)病進程，產(chǎn)生大量細胞因子導致ECM增多和血管損傷[17］。進一步研究明確是CD8＋T淋巴細胞[18］和 CD68＋巨噬細胞[19］參與發(fā)病過程。最新的基因芯片技術(shù)表明巨噬細胞的聚集活化和TGF－β基因上調(diào)與Ssc－ILD中肺纖維化進展密切相關(guān)[20］。目前認為TGF－β主要通過Samd和非Smad通路引起纖維化的發(fā)生，而近期亦有研究表明其作用同時與 Toll樣受體4（TLR－4）有關(guān)。TLR－4能識別脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），增加成纖維細胞對 TGF－β1的敏感性，引起由 TGF－β1介導的前Ⅰ型膠原α1鏈（COL1A1）mRNA和Ⅰ型膠原蛋白表達增多。在TLR－4基因敲除鼠中，α－SMA表達顯著減少。TLR－4對正常成纖維細胞的刺激作用參與ECM重建和組織修復，協(xié)同增加TGF－β1調(diào)節(jié)的纖維化進程[21］。

MMP－9是近年來發(fā)現(xiàn)與肺纖維化相關(guān)的金屬基質(zhì)蛋白酶。纖維化早期病變的發(fā)生是由炎性反應（iNOS和 COX－2）、凋亡（p53和caspase－3）以及基質(zhì)損傷（MMP－9、MMP－2和 COL1A1）引起[22］。在肺纖維化中，Thy－1陰性的成纖維細胞內(nèi) MMP和TGF－β1增多[23］。生長因子如 TGF－β在基因 水 平調(diào)控 MMP[24］。MMP－9在 BLM 引起的肺纖維化的支氣管肺泡灌洗液中增高，而用 MMP抑制劑batimastat后能改善肺纖維化[25］，提示 MMP－9參與肺纖維化進程。在硬皮病肺動脈高壓中，MMP－9和血管內(nèi)皮生長因子含量顯著增多，其中 MMP－9通過膠原重建而刺激血管生成同時也控制血管過度形成[26］。

IL－23參與硬斑病（局限性硬皮?。┌l(fā)病。IL－17是許多炎癥和自身免疫疾病的重要炎性因子，而IL－23是刺激IL－17合成的主要細胞因子[27］。

本實驗結(jié)果表明，在模型組小鼠肺組織中，TGF－β1顯著增多伴隨著與纖維化密切相關(guān)的α－SMA、collagen－1、MMP－9 升高，而與炎癥相關(guān)的CD8＋T細胞、CD68＋巨噬細胞以及炎性因子IL－23顯著增多，上述觀察性的現(xiàn)象和最新相關(guān)文獻報道提示Ssc－ILD的發(fā)生極可能是通過上調(diào)TGF－β1，導致肌成纖維細胞活化和增生，由巨噬細胞提呈和CD8＋T細胞協(xié)助，產(chǎn)生IL－23和TGF－β1，從而引起MMP－9增多，最終致ECM 增多，形成肺纖維化。目前，我們在動物模型上發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象僅初步探索了可能參與Ssc－ILD的因素，對于其發(fā)病機制還需結(jié)合體內(nèi)體外試驗作進一步深入研究。

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