高效液相色譜法測定骨疏靈顆粒中淫羊藿苷含量

俞 吉，朱裕林，桑 冉，屈 彪，陳衛(wèi)東*

0 引言

骨質疏松癥(Osteoporosis，OP)是以骨量減少、骨質量受損及骨強度降低，導致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身性骨?。?］。單味中藥淫羊藿煎服治療絕經后骨質疏松癥在緩解骨痛癥狀、改善骨代謝生化指標、提高松質骨密度等與性激素替代療法比較差異無統計學意義［2-3］。骨疏靈顆粒是安徽中醫(yī)藥大學方朝暉教授針對引起老年性骨質疏松癥的“氣虛、陽虛、血淤”的病機，以“益氣、溫陽、活血”為法，用淫羊藿、黃芪、牛膝、牡蠣4味中藥組方，該藥治療骨質疏松癥的作用是多方面的，既能抑制骨的吸收，又能刺激成骨，產生較多骨基質，使骨代謝轉為正態(tài)平衡，延緩衰老，是治療骨質疏松的良藥［4-7］。其中淫羊藿為君藥，而淫羊藿苷為淫羊藿的主要活性成分。為進一步完善骨疏靈顆粒的標準，更好地控制該制劑的質量，本文采用高效液相色譜法測定該藥中淫羊藿苷的含量。

1 儀器、試藥與樣品

日本島津1260高效液相色譜儀，二極管陣列檢測器(DAD);Cosmosil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);旋轉蒸發(fā)儀(金壇市華歐實驗儀器廠);減壓干燥箱(江蘇南京海汪制藥機械裝備有限公司);分析天平(上海市天平儀器廠);超聲波清洗機(上海市聲波儀器廠);抽濾瓶(GB-17);真空泵(SHB-Ⅲ);離心機(LC-4016)。

淫羊藿苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號:110737-200415)，乙腈(色譜純)，水為超純水，甲醇為分析純，其他試劑為分析純。骨疏靈顆粒(安徽中醫(yī)藥大學藥學實驗室自制，批號:141001、141002、141003)，淫羊藿、黃芪、牛膝、牡蠣(購自亳州市藥材大市場，經安徽中醫(yī)藥大學劉鶴齡教授鑒定均符合中國藥典2010年版規(guī)定)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件Cosmosil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫為室溫;流動相:乙腈 －水(3∶7);流速:1 mL/min;紫外檢測波長:270 nm。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密取淫羊藿苷對照品2.5 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，配成濃度為0.25 mg/mL的溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 按照發(fā)明專利處方配比，取淫羊藿飲片15 g，黃芪飲片20 g，牛膝飲片12 g，牡蠣飲片8 g。淫羊藿與牛膝，以8倍(第1次多加3倍)70%乙醇、回流提取3次，每次2 h;黃芪與牡蠣，以8倍(第1次多加1.5倍)水煎煮2次，每次1 h。將醇提取藥液回收乙醇后與水提取液合并揮干濃縮，在減壓干燥箱以55℃、－0.09～－0.1 Mpa條件下干燥至恒重后取出標記批號。上述操作重復操作 3次，得批號為 141001、141002、141003的骨疏靈顆粒3批。再精密稱取自制骨疏靈顆粒1.0 g，置于50 mL容量瓶中，精密加入稀乙醇定容，密塞，超聲處理20 min，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，取濾過液即得。取淫羊藿藥材粉末按《中國藥典》2010年版記載方法制得淫羊藿藥材溶液備用。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 取處方中除淫羊藿外的其余藥材，按骨疏靈顆粒的工藝制備不含淫羊藿的陰性對照制劑，按照“2.2.2”項下的方法制備陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗 精密量取上述對照品溶液、淫羊藿藥材供試品溶液、骨疏靈顆粒供試品溶液及陰性對照溶液注入液相色譜儀中，按照“2.1”項下色譜條件分別進樣，記錄色譜圖，在與對照品色譜圖主峰相同的保留時間上，供試品溶液有對應峰顯示，陰性對照溶液無對應峰。結果表明，陰性溶液對檢測結果無干擾，結果見圖1。

圖1 色譜圖注:A.淫羊藿苷對照品，B.淫羊藿藥材，C.骨疏靈顆粒，D.陰性對照品

2.4 標準曲線的繪制 取淫羊藿苷對照品適量，加甲醇分別制成每1 mL含淫羊藿苷10、50、80、100、200、250 μg 的溶液，分別精密吸取 20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以進樣濃度(mg/mL)為橫坐標(X)、峰面積為縱坐標(Y)，繪制淫羊藿苷的標準曲線，得回歸方程:Y=5×107X+102 087，r=0.999 9。結果表明，淫羊藿苷在0.01～0.25 mg/mL濃度范圍內線性關系良好。見圖2。

2.5 精密度試驗 取線性關系項下0.01 mg/mL的對照品溶液連續(xù)進樣5次，以峰面積計算，平均值為561 724.2，計算精密度，RSD為0.06%(n=5)，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 以對照品溶液中淫羊藿苷的吸收峰面積變化，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。取對照品溶液，分別在 0、2、4、6、8、12 h 測定對照品溶液的峰面積，得RSD為1.6%，結果表明，該成分在12 h內穩(wěn)定。

圖2 淫羊藿苷標準曲線

2.7 重復性試驗 取同一批骨疏靈顆粒，精密稱取適量(約1 g)，平行操作5份，按“2.2.2”項下供試品溶液的處理方法制備供試品溶液，進樣測定，計算淫羊藿苷的含量，結果RSD為1.8%，表明方法重復性良好。

2.8 回收率試驗 精密稱取已知含量的同一批本品顆粒(批號:141003，淫羊藿苷含量:2.23 mg/g)6份，每份約900 mg，分別置于25 mL容量瓶中，精密加入稀乙醇定容，密塞，超聲處理20 min，搖勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，取過濾液分別進樣。再精密加入淫羊藿苷對照品溶液(0.081 mg/mL)1 mL，制備供試品溶液，再次進樣測算峰面積，計算加樣回收率。見表1。

表1 加樣回收率實驗測定結果(n=6)

2.9 含量測定 取3批本品顆粒，每批稱取1.0 g，精密稱定，按照藥材含量處理方法制備樣品溶液，精密量取20 μL注入HPLC色譜儀中，測定峰面積，根據淫羊藿苷標準曲線計算含量，結果批號為141001、141002、141003的骨疏靈顆粒中淫羊藿苷含量分別為2.16、2.24、2.13 mg/g，平均2.17 mg/g。

3 討論

目前，文獻報道中關于淫羊藿苷的含量檢測有紫外分光光度法、導數光譜法、室溫燐光法、薄層掃描法、高效液相色譜法、毛細管膠束電動色譜法［8］，但最為常見的是 HPLC法，后者具有方便、快捷等特點。淫羊藿苷具有可溶解于乙醇、乙酸乙酯的性質，筆者在試驗中曾嘗試使用30%、50%、70%的乙醇分別回流醇提，分別醇提2次、3次、4次，并分別進行含量比較。結果顯示，醇提3次和4次的淫羊藿苷含量明顯較醇提2次高，但醇提3次和4次之間淫羊藿苷含量差異無統計學意義。所以在淫羊藿苷醇提中，選擇70%乙醇回流醇提3次的工藝。

經全波長掃描，淫羊藿苷在270 nm處吸收較大，結果與中國藥典2010版記載一致，因此確定淫羊藿苷的檢測波長為270 nm。在流動相選擇上，有報道乙腈－水有拖尾影響［9］。筆者嘗試使用甲醇－水、甲醇－0.1%冰醇酸、乙腈－3.8%冰醇酸(28∶72)為流動相進行試驗，發(fā)現乙腈－水(30∶70)出峰良好，且分離度高，經試驗，陰性樣品對測定無干擾，淫羊藿苷的保留時間約為9 min，保留時間、分離度及淫羊藿苷理論板數均符合實驗要求。綜上所述，本文采用的測定方法簡單易行，結果準確，重現性好，可有效控制該復方制劑的質量。

［1］ 張智海，劉忠厚，李娜，等.中國人骨質疏松癥診斷標準專家共識(第三稿·2014版)［J］.中國骨質疏松雜志，2014，(9):1007-1010.

［2］ 曾炎輝，張澤玫，林永城，等.絕經后骨質疏松癥患者骨代謝生化指標檢測及淫羊藿作用初探［J］.國際醫(yī)藥衛(wèi)生導報，2005，11(6):24-26.

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［4］ 徐曉東，鄭洪新.腎虛與骨質疏松癥［J］.遼寧中醫(yī)藥大學學報，2007，9(4):45-46.

［5］ 方朝暉，劉健，章小平，等.骨疏靈改善維甲酸誘導的骨質疏松癥大鼠骨質代謝作用的研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2000，6(5):40-42.

［6］ 方朝暉，劉健，章小平，等.骨疏靈對維甲酸誘導的實驗性骨質疏松癥的影響［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2001，8(1):36-37.

［7］ 方朝暉，耿家金，張有志，等.186例老年性骨質疏松癥的中醫(yī)證候調查對照研究［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2004，11(7):614-615.

［8］ 尹志峰，劉敬閃，張?zhí)m桐.淫羊藿苷的含量測定方法［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2003，(8):47-49.

［9］ 崔曉紅，袁志芳，張?zhí)m桐.益腎強身片中淫羊藿苷的含量測定［J］.中國新藥雜志，2005，(11):78-80.