羅哌卡因乳酸羥基乙酸共聚物納米粒的制備及體外釋藥研究

楊建藤，陳國(guó)忠，黃愛(ài)文，宋洪濤，王麗萍

0 引 言

局部麻醉藥是一類能在局部可逆性地阻斷感覺(jué)神經(jīng)的沖動(dòng)與傳導(dǎo)，使患者在意識(shí)清醒條件下局部組織溫、痛、觸、壓甚至本體感覺(jué)等暫時(shí)消失，以便順利實(shí)施手術(shù)的藥物［1］。但該類藥物體內(nèi)生物半衰期短，且局部組織的高濃度極易造成藥物經(jīng)血管吸收入血產(chǎn)生中樞神經(jīng)和心血管毒性反應(yīng)。羅哌卡因(Ropivacaine，RVC)是一類新型的、含單一異構(gòu)體的長(zhǎng)效酰胺類局麻藥，具有毒性低、麻醉時(shí)間長(zhǎng)和感覺(jué)-運(yùn)動(dòng)神經(jīng)分離阻滯等優(yōu)點(diǎn)，其在臨床麻醉及急、慢性疼痛的治療方面有明顯的優(yōu)勢(shì)［2－3］，但單次最大注射劑量的作用時(shí)間不超過(guò)6～12 h，難以滿足臨床長(zhǎng)效鎮(zhèn)痛需要。因此，研制一個(gè)不良反應(yīng)低的緩釋劑型具有良好的臨床應(yīng)用前景。納米粒載藥系統(tǒng)具有緩控藥物的釋放，提高藥物的組織滯留時(shí)間，增加藥物療效及降低毒副作用的優(yōu)點(diǎn)［4］，而乳酸羥基乙酸共聚物(lactic-glycolic acid polymer，PLGA)材料在人體內(nèi)的代謝終產(chǎn)物為水和CO2，已被食品和藥物管理局批準(zhǔn)為藥用輔料［5］。本試驗(yàn)以PLGA 為載體材料，以RVC 為主藥，采用O/W 乳劑擴(kuò)散溶劑揮發(fā)法制備RVC-PLGA-NPS，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化處方，考察其體外釋放行為。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料 TU-1901 雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)，超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，Nicomp 380 納米激光粒度及電位儀(美國(guó)庫(kù)爾特電子儀器公司)，鹽酸羅哌卡因(恒瑞醫(yī)藥有限公司，批號(hào)110502，純度99.6%)，PLGA(50/50，濟(jì)南岱罡生物科技有限公司，MW:60000，批號(hào):20130411)，聚乙烯醇(PVA，廣州醫(yī)藥化學(xué)試劑公司分裝，批號(hào):870827，MW:22000，純度:88%)，透析袋(MW:8000-12000，上海綠鳥科技發(fā)展有限公司)，二氯甲烷、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀等均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 體外檢測(cè)方法的建立

1.2.1 溶液的配制 ①對(duì)照品溶液:精密稱取RVC游離堿25 mg，以二氯甲烷溶解并稀釋至50 mL 容量瓶中，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液(0.5 g/L)。精密量取1.0 mL貯備液，以二氯甲烷稀釋至50 mL 容量瓶中，作為對(duì)照品溶液(10 μg/mL)。②樣品溶液:精密稱取RVCPLGA-NPS 5 mg 于EP 管中，加入1 mL 蒸餾水再分散至10 mL，加入5 mL 二氯甲烷，渦旋10 min。靜置5 min 后用分液漏斗收集下層清液。精密量取下層液清液1 mL，以二氯甲烷稀釋至50 mL 容量瓶，搖勻，作為樣品溶液。③陰性樣品溶液:精密稱取空白納米粒5 mg，按“②”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

1.2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 以二氯甲烷作空白，在200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)分別掃描對(duì)照品溶液、樣品溶液、陰性樣品溶液，選定232 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.2.3 線性關(guān)系考察 精密量取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 對(duì)照品貯備液，分別加至50 mL 容量瓶中，以二氯甲烷稀釋，搖勻。以二氯甲烷作空白對(duì)照，于232 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度(A)，以A 值為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，公式如下:

C=46.087A+0.745（r=0.999 2）

RVC 在5～50 μg/mL 的線性范圍內(nèi)，C 與A 線性關(guān)系良好。

1.2.4 精密度實(shí)驗(yàn) 取上述配制的低、中、高濃度的對(duì)照品溶液，分別于1 d 內(nèi)測(cè)定5 次，計(jì)算日內(nèi)精密度;1 次/d，連續(xù)測(cè)定5d，計(jì)算日間精密度。結(jié)果顯示，各濃度的日內(nèi)精密度為0.12%、0.23%、0.14%，日間精密度分別為0.22%、0.36%、0.13%。

1.2.5 回收率實(shí)驗(yàn) 分別精密稱取RVC 游離堿2.5、5、7.5 mg 共3 份，分別精密加入空白納米粒5 mg，按“1.2.1②”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，在232 nm 波長(zhǎng)處掃描測(cè)得A 值，計(jì)算回收率，結(jié)果分別為98.44%、99.35%、94.71%，RSD 為0.45%。

1.3 RVC 游離堿的制備 RVC 游離堿的制備參照文獻(xiàn)［6］，納米粒的制備選擇乳化溶劑揮發(fā)法，此法較適用于親脂性藥物［7］，鹽酸RVC 原料藥為水溶性藥物，為提高包封率及載藥量，將其還原為RVC 游離堿。將1 g 鹽酸RVC 溶于25 mL 蒸餾水中，制成飽和水溶液，加入5 mL 90 g/L 氨水使RVC 沉淀完全，沉淀用蒸餾水洗滌至中性，于42 ℃干燥至恒重，即得親脂性的RVC 游離堿。

1.4 RVC-PLGA-NPS 的制備 RVC-PLGA-NPS 的制備參照文獻(xiàn)［8］，采用乳化溶劑揮發(fā)法制備納米粒。精密稱取RVC 游離堿10 mg 和PLGA 50 mg，溶解于二氯甲烷中，作為有機(jī)相。精密量取1%PVA 10 mL，作為水相，將有機(jī)相用5 mL 注射器緩慢滴入水相中，獲得的混合液在冰浴下探頭超聲得O/W乳液，在37 ℃下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1 h，除去有機(jī)相，即得淡藍(lán)色納米粒懸浮液。將此懸浮液以離心半徑為3 cm、10 000 r/min離心20 min，除去上層液，剩余納米粒再以5 倍蒸餾水洗滌，以離心半徑為3 cm、6000 r/min 離心5 min，去除上層液體，重復(fù)洗滌3 次，回收納米粒，凍干24 h，即得RVC-PLGA-NPS。同法制備空白納米粒。

1.5 處方優(yōu)化 由于影響納米粒的因素繁多，在單因素考察實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對(duì)RVC-PLGA-NPS 的制備和性質(zhì)影響較為顯著的3 個(gè)因素，即PLGA 濃度(X1)、RVCPLGA 濃度(X2)和油水體積比(X3)，以納米粒粒徑、包封率、載藥量為考察指標(biāo)，采用Design Expert 8.05 軟件進(jìn)行星點(diǎn)-效應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，各因素水平見(jiàn)表1。本實(shí)驗(yàn)采用“歸一化”法［9］，得總評(píng)歸一值(overall desirability，OD)。公式如下:

k 為指標(biāo)數(shù)，采用Hassan 方法分別進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換求歸一值dmin和dmax，公式如下:

再以O(shè)D 值為因變量，3 個(gè)指標(biāo)為自變量，對(duì)OD值進(jìn)行多元線性回歸和多元非線性回歸擬合，以模型的r、p 作為模型擬合的判定標(biāo)準(zhǔn)。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素水平Table 1 Factors and levels of central composite design

1.6 RVC-PLGA-NPS 體外性質(zhì)的研究

1.6.1 納米粒的粒徑、Zeta電位 取適量納米粒膠分散體系加蒸餾水稀釋至10 倍，用納米激光粒度及電位儀測(cè)定，觀察粒徑和電位。

1.6.2 包封率和載藥量的測(cè)定 精密稱取RVCPLGA-NPS 5mg 于10mL EP 管中，加入1mL 蒸餾水再分散，加入5 mL 二氯甲烷，渦旋10 min。靜置5 min 后用分液漏斗收集下層清液。精密量取下層清液1 mL，以二氯甲烷稀釋至50 mL 容量瓶，搖勻，作為樣品溶液，并在232 nm 波長(zhǎng)處掃描測(cè)得A 值，代入標(biāo)準(zhǔn)方程得納米粒中RVC 的含量，按照下式計(jì)算載藥量和包封率［7］。

包封率=納米粒中所含藥物/納米粒的總重量×100%

載藥量=系統(tǒng)中包封的藥量/系統(tǒng)中包封與未包封的總藥量×100%

1.6.3 納米粒的形態(tài)學(xué) 取納米粒膠體分散體系1～2 滴，滴于覆有支持膜的銅網(wǎng)上停留2 ～3 min干燥，滴入2%的磷鎢酸溶液于銅網(wǎng)上，染色2～3min，自然干燥，用掃描電子顯微鏡觀察納米粒外觀［10］。

1.6.4 RVC-PLGA-NPS 的體外釋放試驗(yàn) 精密稱取RVC-PLGA-NPS 25 mg，裝入預(yù)先處理好的透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量8000)中，加入4mL pH 7.4 磷酸鹽緩沖溶液，兩端扎緊，放入裝有適量pH 7.4 磷酸鹽緩沖溶液的具塞玻璃瓶中，于(37±0.5)℃，恒溫振蕩，取樣，同時(shí)補(bǔ)加等溫、同體積的釋藥介質(zhì)。樣品按UV法測(cè)定RVC 濃度，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3 次。以時(shí)間t為橫坐標(biāo)，累積釋放百分率Q 為縱坐標(biāo)，繪制納米粒的體外釋放曲線［11］。同法進(jìn)行鹽酸羅哌卡因(市售)的體外釋放行為試驗(yàn)并繪制其釋放曲線。

2 結(jié) 果

2.1 處方優(yōu)化結(jié)果 多元線性回歸、多元非線性回歸方程及其復(fù)相關(guān)系數(shù)如下:

星點(diǎn)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)安排和結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)安排和結(jié)果Table 2 Arrangement and results of central composite design

從擬合方程的相關(guān)系數(shù)r 值和P 值可見(jiàn)，采用的二項(xiàng)式方程擬合效果較好，可以用此模型對(duì)RVC-PLGA-NPS 的處方進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。以O(shè)D 值為因變量，固定3 個(gè)自變量之一為中值，相對(duì)于另2個(gè)自變量的效應(yīng)面三維圖和等高線，見(jiàn)圖1。

圖1 三維效應(yīng)面圖和二維等高線圖Figure 1 3D effect surfact and 2D contour maps

結(jié)合各主要因素的用量范圍與Design-Expert 8.5軟件給出的最佳處方結(jié)果，確定各因素水平為:X1=52.82，X2=8.04，X3=1 ∶10。按照以上處方配制3 批納米粒，并比較各考察指標(biāo)的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值，對(duì)模型的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值的比較Table 3 Comparison of predictive value and measured value

可以看出，各項(xiàng)指標(biāo)偏差均＜5.00%，說(shuō)明建立的模型方程能較好的描述效應(yīng)面與因素之間的關(guān)系。

2.2 RVC-PLGA-NPS 體外性質(zhì)研究結(jié)果 通過(guò)RVC-PLGA-NPS 體外性質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，制得的納米粒平均粒徑為(331.2±2.1)nm，多分散系數(shù)(PI)為0.045，Zeta 電位為(8.34±1.32)mV，包封率、載藥量分別為(14.31±1.35)%、(74.82±2.53)%，且外觀為規(guī)則的圓球形，分散良好，見(jiàn)圖2。

圖2 鏡下觀察RVC-PLGA-NPs 形態(tài)(負(fù)染色)Figure 2 SEM image of RVC-PLGA-NPs(Negative staining technique)

96 h 內(nèi)該納米粒的累積釋放率達(dá)到73%，而RVC 在8 h 內(nèi)的釋放率為82.5%，說(shuō)明RVC-PLGANPS 具有平穩(wěn)而明顯的緩釋作用，見(jiàn)圖3。用一級(jí)動(dòng)力學(xué)、Higuch、Niebergull、Weibull 等方程對(duì)體外釋放數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合［12］，結(jié)果表明，體外釋放用代表擴(kuò)散機(jī)制的Higuch 方程擬合最好，見(jiàn)表4。

圖3 RVC-PLGA-NPs 體外藥物釋放曲線Figure 3 In vitro release curre of RVC

表4 體外釋放的擬合方程Figure 4 Fitting equation of in vitro release

3 討 論

載藥納米粒是直徑為10 ～500 nm 的固體膠體粒子，藥物或藥物活性成分通過(guò)溶解、包裹進(jìn)入粒子內(nèi)，或者通過(guò)吸附、耦合作用于粒子表面。這種微粒因直徑較小，能改善其透過(guò)細(xì)胞膜的能力，使藥物在體內(nèi)選擇性分布，從而提高藥物生物利用度，降低毒副作用［13－14］。

文獻(xiàn)報(bào)道中，諸多工藝研究常用的均勻設(shè)計(jì)和正交設(shè)計(jì)應(yīng)用過(guò)程存在誤區(qū)，忽略了影響因素與效應(yīng)間的非線性關(guān)系而進(jìn)行簡(jiǎn)單的線性模式設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，從而很大程度上使預(yù)測(cè)值跟真實(shí)值偏離，達(dá)不到實(shí)驗(yàn)要求［15］。本實(shí)驗(yàn)選用星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面優(yōu)化法對(duì)納米粒制備工藝的處方進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)非線性模式進(jìn)行設(shè)計(jì)和研究，同時(shí)在中心點(diǎn)進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，提高了實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性，可信度較好，預(yù)測(cè)值與真實(shí)值更接近。由OD 值的效應(yīng)面分析圖可以看出，三因素間存在有一定的交互作用，最佳點(diǎn)落在實(shí)驗(yàn)考察區(qū)域內(nèi)，經(jīng)驗(yàn)證該優(yōu)化處方體外釋放預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值吻合良好且符合設(shè)計(jì)要求。

由納米粒體外釋藥曲線可以看出分為突釋、緩釋2 個(gè)階段。在突釋階段，RVC 釋放幾乎呈線性，8 h累積釋放量達(dá)31.21%，可能是藥物吸附在納米粒表面脫吸附釋放導(dǎo)致的突釋。隨后96 h 內(nèi)，RVC體外釋藥進(jìn)入緩釋階段，累積釋放量為73.4%，主要原因是隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，PLGA 出現(xiàn)了生物降解，而在降解過(guò)程中納米粒表面不斷形成孔隙，使包裹內(nèi)部的RVC 以擴(kuò)散方式逐漸釋放，起到緩釋的效果［16－17］。

本課題組通過(guò)還原羅哌卡因游離堿，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化制處方，制得納米粒外觀圓整，有明顯的緩釋效果，為RVC-PLGA-NPS 的長(zhǎng)效注射劑研究打下基礎(chǔ)。

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