基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀在快速鑒定臨床酵母菌中的應(yīng)用

奚海燕，王 穎，黃 梅，李玲慧，范 明，邵海楓，王衛(wèi)萍，李曉軍

0 引 言

隨著廣譜抗生素、免疫抑制劑及抗腫瘤藥物等的廣泛應(yīng)用，真菌感染在臨床上越來越常見［1］。特別是在免疫抑制疾病、惡性血液系統(tǒng)疾病、干細(xì)胞移植和器官移植的患者中，真菌感染已成為影響預(yù)后的主要因素。念珠菌是引起院內(nèi)血源性感染第4 位最常見的病原體［2］。其中白念珠菌占血源性真菌感染的半數(shù)以上，近年來，非白念珠菌如光滑念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌等的感染比例也在升高［3］。非白念珠菌血癥的增多與預(yù)防性使用氟康唑有關(guān)［4］。這些非白念珠菌引起的系統(tǒng)感染預(yù)后較白念珠菌感染差［5］。尤其是對(duì)氟康唑不敏感的光滑和克柔念珠菌等引起的系統(tǒng)感染已成為臨床治療的難題。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法往往鑒定周期長、操作繁瑣、陽性率低，不能滿足臨床快速診斷和及時(shí)治療的需要。目前，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，出現(xiàn)許多快速鑒定酵母菌的方法，如核酸雜交技術(shù)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA 分析和rDNA ITS 序列分析等［6］，但這些技術(shù)復(fù)雜耗費(fèi)高，不適用臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測(cè)工作。基于蛋白組學(xué)的基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)是近年來發(fā)展起來的一種新型軟電離質(zhì)譜技術(shù)，在現(xiàn)今病原菌快速檢測(cè)方面得到廣泛關(guān)注［7－13］。本研究探討MALDI-TOF-MS 用于快速鑒定臨床酵母菌的可靠性和實(shí)用性。

1 材料與方法

1.1 菌株 收集南京軍區(qū)南京總醫(yī)院2013 年7－10 月自臨床標(biāo)本(血液、腦脊液、胸腹水、尿液、膿汁和傷口分泌物等)分離的非重復(fù)酵母菌共120 株。質(zhì)控菌株包括白念珠菌ATCC14053、ATCC 90028、大腸埃希菌ATCC8739 和釀酒酵母菌(中國科學(xué)院皮膚研究所真菌菌株保存中心贈(zèng)送)。

1.2 儀器與試劑 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(VITEK?-MS v2.0 MALDI-TOF system)及配套試劑(法國生物梅里埃公司，細(xì)菌數(shù)據(jù)庫版本V2.0);Vitek 2-Compact 全自動(dòng)微生物鑒定儀、API 酵母菌鑒定條和哥倫比亞血平板(法國生物梅里埃公司);念珠菌顯色培養(yǎng)基(鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司);ABI 3730XL 測(cè)序儀(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)。

1.3 酵母菌分離與生化鑒定 臨床標(biāo)本直接接種哥倫比亞血平板和念珠菌顯色平板，置28 ℃真菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h。用Vitek 2-Compact 酵母菌鑒定卡或API 生化鑒定條鑒定到種。

1.4 MALDI-TOF-MS 鑒定

1.4.1 靶板制備 用1 μL 一次性定量接種環(huán)先將校準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC 8793 涂在靶板的校準(zhǔn)點(diǎn)位上，然后取純待測(cè)菌落涂在測(cè)試點(diǎn)位上(每個(gè)靶板有48 個(gè)測(cè)試點(diǎn)位)，每個(gè)點(diǎn)位加1 μL α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)液，在空氣中自然晾干。

1.4.2 數(shù)據(jù)采集與分析 將靶板插入板架，儀器首先檢測(cè)校準(zhǔn)點(diǎn)位的大腸埃希菌ATCC 8739，與MS 數(shù)據(jù)庫中的大腸埃希菌ATCC 8739 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜進(jìn)行比較，匹配合格后儀器才能檢測(cè)標(biāo)本點(diǎn)位。待所有標(biāo)本點(diǎn)位檢測(cè)完成后，MS 將校準(zhǔn)點(diǎn)位的大腸埃希菌ATCC 8739 作為內(nèi)質(zhì)控菌株再次進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)通過后再將獲得的標(biāo)本蛋白質(zhì)譜傳送至分析服務(wù)器，與數(shù)據(jù)庫中已知菌質(zhì)譜進(jìn)行比較、分析從而得出最終鑒定結(jié)果。

1.4.3 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) Vitek MS(v2.0)軟件匹配模式可得到＜60%、＞60%(2 ～4 個(gè)選項(xiàng))和60.0%～99.9%(只有1 個(gè)選項(xiàng))概率，對(duì)應(yīng)表示無法鑒定、低分辨和好的鑒定。當(dāng)鑒定概率為60.0%～99.9%且只有1個(gè)選項(xiàng)，表示鑒定結(jié)果與數(shù)據(jù)庫質(zhì)譜圖高度匹配，結(jié)果高度可信;概率＞60%且有2～4 個(gè)選項(xiàng)，表示鑒定結(jié)果可信但需要進(jìn)一步試驗(yàn)區(qū)別;概率＜60%，表示鑒定結(jié)果與數(shù)據(jù)庫的任何質(zhì)譜不匹配，結(jié)果不可信。

1.5 ITS 基因測(cè)序 MALDI-TOF-MS 與Vitek 2-Compact 或API 鑒定結(jié)果不一致的菌株，送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，引物序列:正向5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和反向5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。結(jié)果與GenBank 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，相似率≥99%以上判定為同一菌種。

2 結(jié) 果

2.1 MALDI-TOF-MS 與Vitek 2-Compact 或API鑒定結(jié)果 120 株酵母菌平行進(jìn)行MALDI-TOF-MS和Vitek 2-Compact 或API 檢測(cè)，117 株(97.5%)鑒定到種水平且結(jié)果一致;1 株(0.8%)MALDI-TOFMS 和Vitek 2-Compact 均鑒定錯(cuò)誤;2 株(1.7%)均未給出鑒定結(jié)果，見表1。

表1 MALDI-TOF-MS 與Vitek 2-Compact/API 系統(tǒng)鑒定菌株數(shù)的結(jié)果對(duì)比(n)Table 1 Identification of yeast strains by MALDI-TOF-MS vs Vitek 2-Compact/API(n)

2.2 ITS 基因測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果 3 株鑒定不一致或未給出結(jié)果的菌株用ITS 基因測(cè)序驗(yàn)證，與MALDITOF-MS 和Vitek 2-Compact/API 鑒定結(jié)果均不一致，符合率為0。見表2。

表2 3 株鑒定不一致或未給出結(jié)果菌株的ITS 基因測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果Table 2 ITS gene sequencing of the 1 misidentified and 2 unidentified yeast strains

3 討 論

目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)100 多種對(duì)人類致病的酵母菌和類酵母菌。用傳統(tǒng)的培養(yǎng)和生物型鑒定方法來鑒定不斷變異的致病真菌既困難又耗時(shí)，且最后可能無法得到結(jié)果，尤其是對(duì)于不常見的酵母菌;因此非培養(yǎng)技術(shù)正是為滿足難培養(yǎng)或者感染早期診斷需要所建立的方法。如近年來發(fā)展的基于蛋白質(zhì)組學(xué)的MALDI-TOF-MS 技術(shù)，其基本原理是將微生物樣品與等量的基質(zhì)混合溶液點(diǎn)加在樣品的靶盤上，溶劑揮發(fā)后形成樣品與基質(zhì)的共結(jié)晶;利用激光作為能量來源輻射結(jié)晶體，基質(zhì)從激光中吸收能量使樣品解吸，基質(zhì)與樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使得樣品分子電離，樣品離子在加速電場(chǎng)下獲得相同的動(dòng)能，經(jīng)高壓加速，聚焦后進(jìn)入飛行時(shí)間檢測(cè)器進(jìn)行質(zhì)量分析，形成質(zhì)量圖譜;通過軟件分析比較，篩選并確定出微生物自身獨(dú)特的指紋譜圖，并與數(shù)據(jù)庫中各種已知微生物的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行比對(duì)，從而完成對(duì)微生物的鑒定。已有許多研究對(duì)MALDI-TOF-MS 用于酵母菌鑒定的能力進(jìn)行了評(píng)估，發(fā)現(xiàn)其鑒定酵母菌的準(zhǔn)確性高［7，10－11］;并且還可以準(zhǔn)確地區(qū)分近平滑念珠菌、擬平滑念珠菌、似平滑念珠菌復(fù)合體以及鑒別新生隱球菌和格特隱球菌亞種［12－13］。

本研究用MALDI-TOF-MS 系統(tǒng)對(duì)120 株臨床分離酵母菌進(jìn)行了鑒定，97.5%正確鑒定到種，只有3 株鑒定錯(cuò)誤(0.8%)或未給出鑒定結(jié)果(1.7%)，與有關(guān)文獻(xiàn)所得結(jié)果相符［10－11］。Marklein 等［11］利用MALDI-TOF-MS 技術(shù)對(duì)267 株臨床分離酵母菌進(jìn)行檢測(cè)，92.5%正確鑒定到種水平，但當(dāng)合適的標(biāo)準(zhǔn)菌株補(bǔ)充到數(shù)據(jù)庫中，所有的臨床分離菌株100%都能夠準(zhǔn)確鑒定到種。van Veen 等［14］鑒定了80 株酵母菌，97.5%鑒定到屬的水平，其中87.5%菌株正確鑒定到種水平，上述狀況學(xué)者分析認(rèn)為大部分沒有正確鑒定的菌株是因?yàn)榫鷰觳粔蛲晟?。本研究中? 株Candida butyric MALDI-TOF-MS 和Vitek 2-Compact/API系統(tǒng)都不能鑒定，該菌屬于臨床少見的念珠菌，可能未包含在兩系統(tǒng)目前的檢測(cè)譜中。另1 株Rhodosporidium fluvial，被MALDI-TOF-MS 和Vitek 2-Compact分別錯(cuò)誤鑒定為膠紅酵母和粘紅酵母，可能與2 種菌的同源性較高，生物學(xué)表型和蛋白質(zhì)組組成高度相似，需進(jìn)一步擴(kuò)充和完善數(shù)據(jù)庫的細(xì)微特征。因此MALDI-TOF-MS 技術(shù)鑒定的準(zhǔn)確性極大地依賴于配套數(shù)據(jù)庫中菌種圖譜的信息量。

臨床上由于酵母菌和類酵母菌引起的嚴(yán)重感染不斷增加，尤其是在免疫力低下的患者中［15－16］。每年全世界約有7280 萬的念珠菌條件致病患者，其死亡率為33.9%。近年來多種不同機(jī)制的抗真菌藥可以被臨床應(yīng)用，因此快速可靠的鑒定成為治療真菌感染的關(guān)鍵。MALDI-TOF-MS 最突出的優(yōu)勢(shì)是準(zhǔn)確、快速。比傳統(tǒng)方法和分子生物學(xué)鑒定都要快速，通常1 個(gè)標(biāo)本僅需3～5 min，大批量標(biāo)本在1 h 內(nèi)即可得出結(jié)果。由此可見此方法的使用可以節(jié)省檢驗(yàn)時(shí)間和成本，準(zhǔn)確快速地為臨床提供診斷結(jié)果，MALDI-TOF-MS 將會(huì)被臨床多數(shù)實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。

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