小鼠樹突狀細胞相關C 型凝集素-1 基因重組腺病毒載體的構建及鑒定

夏 迪，錢 倩，劉志成，譚鳴鳴，丁 媛，蘇 欣，孫文逵，施 毅

0 引 言

樹突狀細胞相關C 型凝集素-1(dendritic cellassociated C-type lectin-1，Dectin-1)是重要的模式識別受體，由CLEC7A 基因編碼，廣泛表達于樹突狀細胞、巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞等多種細胞表面，在肺、腸、胸腺和脾臟等器官中表達量高，提示其在免疫監(jiān)視和免疫防御中具有重要作用。Dectin-1受體通過識別真菌細胞壁的β-葡聚糖，介導宿主細胞對真菌的黏附和吞噬，啟動宿主抗真菌天然免疫［1－2］。此外，Dectin-1 能夠通過調(diào)節(jié)Th1 和Th17細胞的分化來調(diào)節(jié)獲得性免疫［3］。研究發(fā)現(xiàn)，受到真菌病原體刺激時，宿主細胞Dectin-1 表達量顯著增加［4］，而Dectin-1 基因敲除小鼠感染煙曲霉時，組織真菌負荷顯著增加［5］。因此，本研究設想使Dectin-1在靜息狀態(tài)下高表達，極可能增強宿主對真菌感染的抵抗力，為真菌感染防治提供新的思路。

小鼠Dectin-1 基因又名CLEC7A，位于6 號染色體上，含有6 個外顯子區(qū)，屬于C-型凝集素結構域家族7。本研究構建的重組腺病毒包含的目的基因為6 個外顯子中的CDS 區(qū)，全長735 bp，通過構建表達Dectin-1 基因的重組腺病毒，進行鑒定及純化，為后續(xù)體內(nèi)外實驗研究Dectin-1 高表達在抗真菌免疫中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 pMD19T simple-CLEC7A 載體、pIRES2-EGFP 載體、中間載體pDONR221、腺病毒骨架載體pAD/CMV/V5-DEST 由上海銳賽生物技術有限公司構建和提供;E.coli 感受態(tài)細胞DH5a 和人胚腎293(HEK293)細胞由本實驗室提供;限制性內(nèi)切酶NheⅠ、BamHⅠ、PacⅠ、DNA 連接酶購自Fermentas公司;RNA 提取試劑Trizol、逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR 試劑盒、病毒載體重組酶購自Invitrogen公司;膠回收試劑盒、質粒抽提試劑盒、基因組DNA抽提試劑盒購自Axygen 公司;Lipofectamine 2000試劑、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購自Hyclone公司;其余試劑為國產(chǎn)分析純。引物合成和測序由上海捷瑞生物工程有限公司完成。

1.2 重組穿梭質粒和重組腺病毒質粒的構建與鑒定 含目的基因片段的pMD19T simple-CLEC7A 載體與pIRES2-EGFP 載體分別經(jīng)NheⅠ和BamHⅠ雙酶切，用膠回收試劑盒回收酶切后的目的基因片段和pIRES2-EGFP 載體片段，加T4 DNA 連接酶體系在室溫下連接2 h 以上。產(chǎn)物CLEC7A-pIRES2-EGFP 轉化E.coli 感受態(tài)細胞DH5a，篩選卡那霉素抗性克隆，PCR 和NheⅠ+BamHⅠ酶切鑒定，兩者均呈陽性的克隆進行DNA 測序。根據(jù)Genbank 中小鼠CLEC7A 基因序列(NM_020008.2)設計引物，上游引物:5'-GCCACCATGAAATATCACTCTCATATAGAGAATC-3'，下游引物:5'-TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCC-3'。以CLEC7A-pIRES2-EGFP 重組質粒為模板，PCR 擴增目的片段，并將目的片段重組到中間載體pDONR221 上。重組產(chǎn)物pDONR221-CLEC7A-pIRES2-EGFP 轉化E.coli感受態(tài)細胞DH5a，小量擴增，抽提陽性質粒DNA，PCR 鑒定。將中間載體上攜帶的目的基因片段與腺病毒骨架質粒pAD/CMV/V5-DEST 進行重組，篩選氨芐青霉素抗性克隆，PCR 鑒定并測序。

1.3 重組腺病毒的包裝、擴增、純化和滴度測定重組腺病毒質粒經(jīng)濃度測定后用PacI 進行線性化，并用酚/氯仿抽提法純化與回收，通過Lipofectamine 2000 轉染至HEK293 細胞。轉染5～7 d 出現(xiàn)明顯的病毒空斑，至大量細胞崩解、脫落，收集病毒液于離心管，－80 ℃凍存，30 min 后放置于37 ℃水浴鍋中解凍15 min，反復凍融2 次使細胞充分裂解，反復凍融的病毒液3000 rpm/min，離心15 min 去除細胞碎片后，－80 ℃保存。取粗提的病毒液反復轉染HEK293細胞進行大量擴增，并將病毒液用0.45 μm 的醋酸纖維素膜及Millipore 濃縮柱進行純化，純化后的病毒液－80 ℃分裝保存。用TCID50 法測定病毒滴度。HEK293 細胞接種于96 孔板中，每孔細胞數(shù)為1×104個。將純化的病毒液從10－1～10－13依次梯度稀釋，將不同稀釋梯度的病毒液加入到準備好的96孔板中，100 μL/孔，同時設對照孔，放入37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)10 d，顯微鏡觀察計數(shù)每排出現(xiàn)細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)的孔數(shù)，陰性對照組不能出現(xiàn)CPE，按公式計算:

病毒滴度=101+d（s-0.5）/0.1 mL

式中d 為log10稀釋度;S 為各濃度CPE 陽性率之和。

1.4 熒光顯微鏡觀察目的基因表達 取處于對數(shù)生長期的HEK293 細胞，胰酶消化制成細胞懸液，調(diào)整細胞濃度至1×105/mL，接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后，按感染復數(shù)等于50 加入腺病毒進行轉染，轉染48 h 后通過熒光顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.5 實時熒光定量PCR 檢測目的基因表達 用Dectin-1 基因重組腺病毒和空病毒轉染HEK293 細胞，形成轉染重組腺病毒組和轉染空病毒組，并以空細胞(未轉染病毒的空細胞組)作為空白對照。棄培養(yǎng)上清，冰PBS 清洗2 遍，每孔加入500 μL Trizol裂解細胞，按標準步驟抽提總RNA，紫外分光光度計法測定含量后按逆轉錄試劑盒操作說明將RNA逆轉錄成cDNA。根據(jù)Genbank 中小鼠CLEC7A 基因和β-Actin 基因序列設計引物，CLEC7A 上游引物序列:5'-TTCAGCACTCAAGACATCCATAA-3'，下游引物序列:5'-CAGCAACCACTACTACCACAAAG-3';β-Actin 上游引物序列:5'-TCCTTCCTGGGCATGGAGT-3'，下游引物序列:5'-CAGGAGGAGCAATGATCTTGAT-3'。反應在EppendorfRealpLex 熒光定量PCR 儀上進行，β-Actin 為內(nèi)參基因。PCR 反應條件如下:95 ℃，2 min，95 ℃，15 s、58 ℃，20 s、72 ℃，20 s，40 個循環(huán)，70 ℃，30 s。

2 結 果

2.1 CLEC7A-pIRES2-EGFP 重組目的載體的鑒定 菌落PCR 擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示在735 bp 處可見明顯條帶，與目的基因片段大小一致，見圖1。酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示2 條條帶，其中一條位于735 bp 處，進一步證明重組質粒含有目的基因，見圖2。將PCR 及酶切鑒定均陽性的克隆測序，測序結果與Genbank 中小鼠CLEC7A 基因序列進行比對，序列完全一致。CLEC7A-pIRES2-EGFP 目的片段PCR 擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示在2051 bp 處可見明顯條帶，見圖3。

圖1 CLEC7A-pIRES2-EGFP 重組載體菌落PCR 鑒定Figure 1 PCR identification of the CLEC7A-pIRES2-EGFP recombinant vector

圖2 CLEC7A-pIRES2-EGFP 重組載體酶切鑒定Figure 2 Identification of the CLEC7A-pIRES2-EGFP recombinant vector by NheⅠand BamHⅠdigestion

圖3 CLEC7A-pIRES2-EGFP 目的片段PCR 鑒定Figure 3 PCR identification of the CLEC7A-pIRES2-EGFP fragment

2.2 pDONR221-CLEC7A-pIRES2-EGFP 重組中間載體的鑒定 將目的片段與中間載體的重組產(chǎn)物pDONR221-CLEC7A-pIRES2-EGFP 經(jīng)PCR 鑒定，結果顯示重組產(chǎn)物樣本中擴增出2051 bp 大小的條帶，與陽性對照目的片段的條帶一致，見圖4。

圖4 pDONR221-CLEC7A-pIRES2-EGFP 重組中間載體的菌落PCR 鑒定Figure 4 PCR identification of the pDONR221-CLEC7ApIRES2-EGFP recombinant vector

2.3 pAD-CLEC7A-pIRES2-EGFP 重組腺病毒載體的鑒定 將重組產(chǎn)物與腺病毒骨架質粒進一步重組，篩選陽性克隆，獲得腺病毒載體pAD-CLEC7ApIRES2-EGFP，PCR 鑒定擴增出與陽性對照一致的2051 bp 大小條帶，見圖5。重組腺病毒載體測序結果與Genbank 序列一致，說明重組腺病毒攜帶有目的基因。

2.4 重組腺病毒的滴度測定 采用TCID50 法計算得到pAD-CLEC7A-pIRES2-EGFP 重組腺病毒最終滴度為5×1011IU/mL。

2.5 熒光顯微鏡觀察目的基因表達 重組腺病毒轉染HEK293 細胞，48 h 后熒光顯微鏡觀察可見明顯的綠色熒光，表明重組腺病毒在宿主細胞中成功表達，見圖6。

圖5 pAD-CLEC7A-pIRES2-EGFP 腺病毒載體的菌落PCR 鑒定Figure 5 PCR identification of the pAD-CLEC7A-pIRES2-EGFP adenoviral vector

圖6 pAD-CLEC7A-pIRES2-EGFP 重組腺病毒轉染HEK293細胞48h 的光鏡圖(×10)Figure 6 HEK293 transfected with the pAD-CLEC7ApIRES2-EGFP recombinant adenoviral vector for 48 h by fluorescence microscopy(×10)

2.6 實時熒光定量PCR 檢測目的基因表達 實時熒光定量PCR 結果顯示，pAD-CLEC7A-pIRES2-EGFP重組腺病毒轉染的HEK293 細胞中，轉染重組腺病毒組Dectin-1 表達量是轉染空病毒組的8677.25倍，見表1。

表1 重組腺病毒轉染HEK293 細胞的實時熒光定量PCR 結果Table 1 Real-time qPCR results of HEK293 transfected with the pAD-CLEC7A-pIRES2-EGFP recombinant adenoviral vector

3 討 論

Dectin-1 屬于Ⅱ型跨膜受體，胞外部分為單個C型凝集素樣結合域，胞內(nèi)部分為一個免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)。Dectin-1 通過胞外部分識別曲霉、念珠菌、青霉、肺孢子菌等多種真菌細胞壁表面的β-葡聚糖，激活細胞吞噬作用、產(chǎn)生呼吸爆發(fā)、誘導樹突狀細胞成熟、釋放大量炎癥因子和趨化因子，發(fā)揮抗真菌作用［6］。研究發(fā)現(xiàn)，靜息狀態(tài)下氣道上皮細胞膜表面Dectin-1 表達水平極低，煙曲霉孢子刺激能夠誘導其啟動表達Dectin-1 受體，而沉默Dectin-1表達后的氣道上皮細胞與煙曲霉孢子共孵育，炎癥因子及抗菌肽表達水平顯著下降［7］。另有研究提示，人體內(nèi)Dectin-1 基因缺陷與黏膜表面真菌感染密切相關，可能機制為Dectin-1 低表達導致細胞結合β-葡聚糖的能力下降，進而使細胞因子產(chǎn)生減少，人體對真菌的抵抗力下降［8］。因此，本研究設想在靜息狀態(tài)下使細胞高表達Dectin-1 受體，當受到真菌侵襲時，這些高表達Dectin-1 的宿主細胞識別并結合β-葡聚糖的能力增強，細胞因子產(chǎn)生增加，宿主清除真菌的能力提高，從而達到預防和治療真菌感染的目的。

既往有研究嘗試高表達Dectin-1 受體，用于診斷和防治真菌感染。Graham 等［9］首次通過構建非穩(wěn)定性二氫葉酸還原酶表達載體，成功表達含有Dectin-1 受體胞外區(qū)的可溶性蛋白，用于檢測β-葡聚糖。后有研究者通過大腸桿菌無細胞翻譯系統(tǒng)［10］和家蠶桿狀病毒翻譯系統(tǒng)［11］成功表達了帶有六聚組氨酸標記的Dectin-1 融合蛋白，并證實其能特異性結合β-葡聚糖。Mattila 等［12］首次利用腺病毒載體構建了Dectin-1 受體胞外區(qū)和小鼠IgG1Fc段相連的融合蛋白(Dectin-Fc)，將該蛋白加入到巨噬細胞與煙曲霉共孵育的培養(yǎng)基中，巨噬細胞殺滅煙曲霉的能力顯著增強;體內(nèi)試驗也提示，經(jīng)尾靜脈注射Dectin-Fc 融合蛋白腺病毒載體能提高小鼠煙曲霉感染后的生存率，降低肺組織真菌負荷。綜上，高表達Dectin-1 在抗真菌免疫中的作用已受到廣泛關注，但目前為止研究局限于高表達Dectin-1 受體的胞外區(qū)，尚沒有研究探索高表達較完整Dectin-1受體對宿主抗真菌免疫的影響，因此本研究嘗試構建表達含有胞內(nèi)區(qū)和胞外區(qū)的較為完整Dectin-1 受體的腺病毒載體，通過菌落PCR 鑒定、酶切鑒定及測序結果證實重組腺病毒載體含有Dectin-1 基因。重組腺病毒轉染HEK293 細胞后可見綠色熒光蛋白表達，實時熒光定量檢測到Dectin-1 基因表達顯著升高，進一步表明腺病毒載體構建成功。

腺病毒是目前常用的基因表達載體，宿主范圍廣，轉染效率高，已廣泛應用于多種疾病的基因治療研究和臨床研究［13－14］。目前，免疫治療是感染性疾病防治的重要手段之一，而在真菌感染的防治中，抗真菌藥物是主要手段，免疫治療仍是空白。腺病毒具有肌肉注射、靜脈注射、口服和霧化吸入等多種途徑給藥的優(yōu)勢，且安全性好［15］。因此，本研究選擇腺病毒作為載體，構建含有完整Dectin-1 基因的表達載體，并證實Dectin-1 基因能夠成功高表達，為進一步研究Dectin-1 高表達在宿主抗真菌感染中的作用以及未來探索抗真菌免疫治療奠定基礎。

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