炭黑氨基柱凈化-HPLC-ICP-MS測(cè)定黃酒中鉻價(jià)態(tài)及含量

宋偉華，董文洪，胡貝貞，林環(huán)宇

(紹興出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心,浙江紹興 312000)

炭黑氨基柱凈化-HPLC-ICP-MS測(cè)定黃酒中鉻價(jià)態(tài)及含量

宋偉華，董文洪，胡貝貞，林環(huán)宇

(紹興出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心,浙江紹興 312000)

建立了一種測(cè)定黃酒中Cr(Ⅲ)、Cr(Ⅵ)的高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜分析方法。黃酒經(jīng)炭黑氨基柱凈化,超純水洗脫,色譜條件為:Dionex AS11-HC陰離子預(yù)柱(4 mm×50 mm×9 μm);以60 mmol/L(pH9.0)硝酸銨作為流動(dòng)相,流量為1.5 mL/min;以電感耦合等離子體質(zhì)譜進(jìn)行定性和定量分析。結(jié)果表明:在0～20 μg/L范圍內(nèi)Cr(Ⅲ)、Cr(Ⅵ)線性良好,相關(guān)系數(shù)R2均在0.998以上;添加回收率在81.2%～94.8%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%～4.1%;定量限分別為0.12 μg/L和0.18 μg/L。本方法簡(jiǎn)單快速,適用于黃酒中鉻形態(tài)殘留的分析檢測(cè),并利用該方法對(duì)不同年份、不同企業(yè)及不同類型的黃酒進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)紹興地區(qū)的黃酒中的鉻主要以Cr(Ⅲ)形態(tài)存在。

高效液相色譜,炭黑氨基柱凈化,電感耦合等離子體質(zhì)譜,鉻形態(tài),黃酒

據(jù)統(tǒng)計(jì),我國(guó)約有十分之一的耕地被重金屬污染,形勢(shì)非常嚴(yán)峻[1]。因此,對(duì)環(huán)境、食品以及水資源中的重金屬含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)至關(guān)重要的。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)日常檢測(cè)發(fā)現(xiàn)黃酒中總鉻的含量在9.2～31.7 μg/L。環(huán)境中的鉻主要以兩種價(jià)態(tài)形式存在,維持人體生命的必需元素Cr(III)和具有高毒、強(qiáng)致癌性的Cr(VI)[2]。因此,對(duì)于鉻的檢測(cè)不能局限于總量，更要考慮其各價(jià)態(tài)的含量。當(dāng)前,對(duì)于水質(zhì)、食品、化妝品、尿液等中鉻的形態(tài)研究也有較多的報(bào)道[3-9]。但對(duì)于黃酒中鉻元素的檢測(cè)也僅限于總量[10]而未見(jiàn)于形態(tài)分析。為了有效地評(píng)價(jià)黃酒中鉻存在的形態(tài),實(shí)驗(yàn)室建立了炭黑氨基柱凈化-HPLC-ICP-MS測(cè)定黃酒中鉻形態(tài)及含量的方法,并利用此方法對(duì)紹興地區(qū)不同企業(yè)、不同年份及不同類別的黃酒進(jìn)行了鉻形態(tài)及含量的測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Cr(Ⅲ)、Cr(Ⅵ)標(biāo)準(zhǔn)品溶液 中國(guó)計(jì)量研究院;乙二胺四乙酸二氫二鉀二水合物 梯愛(ài)希化成工業(yè)有限公司;分析純氨水 江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)有限公司;UP級(jí)(71%)硝酸 蘇州晶瑞化學(xué)有限公司;色譜純甲醇 美國(guó)天地試劑公司。AG11-HC陰離子預(yù)柱(4 mm×50 mm×9 μm) 賽默飛世爾公司;炭黑氨基柱(500 mg/6 mL) 杭州福裕科技有限公司。

電感耦合等離子體質(zhì)譜Aurora M90 美國(guó)布魯克公司;超純水儀Millli. Q Element A10 法國(guó)Millipore公司;高效液相色譜儀1260 安捷倫科技;多功能純化器 美國(guó)加州儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備 實(shí)驗(yàn)用水由Milli.Q Element A10 超純水儀制得,用于配制實(shí)驗(yàn)所用的標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品溶液。硝酸與氨水分別由多功能純化器純化后再使用。炭黑氨基柱使用前用5 mL(50%甲醇水溶液)活化,再用25 mL超純水清洗。

60 mmol的硝酸銨:取3.95 mL純化后的硝酸,定容到1000 mL,用純化后的氨水調(diào)pH到9.0。

1.2.2 樣品的前處理 移取黃酒樣品1.0 mL,加入已活化好的炭黑氨基柱中,然后以9.0 mL超純水進(jìn)行洗脫,收集15 mL于塑料離心管中,定容到10.0 mL。取收集液0.5 mL置于1.5mL的進(jìn)樣瓶中,加入10 mmol EDTA溶液0.5 mL,于65 ℃水浴中反應(yīng)45 min后冷卻至室溫后立即測(cè)定鉻形態(tài)。

1.3 檢測(cè)條件

高效液相色譜條件 色譜柱:AG11-HC陰離子預(yù)柱(4 mm×50 mm×9 μm);流動(dòng)相為60 mmol/L硝酸銨(pH9.0);流速1.5 mL/min;柱溫為20 ℃;進(jìn)樣量:50 μL。

電感耦合等離子體質(zhì)譜條件 射頻功率1400 W;等離子氣體流速18 L/min;輔助氣流速1.8 L/min;鞘氣流速0.2 L/min;霧化器流速1.0 L/min,駐留時(shí)間80000 μs;碰撞氣125 mL/min氦氣。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)日常檢測(cè)工作及參考文獻(xiàn)[12-13]知道,在黃酒中含有較高濃度的無(wú)機(jī)鹽,尤其是鈣離子含量在0.05～0.4 g/L范圍內(nèi)。因此,配制EDTA鉀鹽的溶液濃度為10 mmol/L,調(diào)pH7.0。標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品均用10 mmol/L的EDTA鉀鹽1∶1穩(wěn)定,以利于鉻形態(tài)的穩(wěn)定和色譜分離。

2.1 前處理方法的選擇

2.1.1 前處理方法的選擇 本實(shí)驗(yàn)比較了不同前處理的方法,如:直接進(jìn)樣、固相萃取柱凈化等。結(jié)果表明,直接進(jìn)樣方便,但由于黃酒中含有豐富的糖、氨基酸、色素等營(yíng)養(yǎng)成分,容易影響離子色譜的分離性能和使用壽命,且檢測(cè)再現(xiàn)性差,設(shè)備污染嚴(yán)重。最終選取了炭黑氨基柱凈化后洗脫稀釋進(jìn)樣的方式進(jìn)行處理,效果較佳。

2.1.2 前處理方法的優(yōu)化 黃酒中富含氨基酸,蛋白質(zhì)、糖、色素等多種有機(jī)物,對(duì)Cr在色譜柱上的形態(tài)分離會(huì)有干擾,同時(shí)高含量的氨基酸、蛋白質(zhì)等有機(jī)物也容易對(duì)離子色譜柱造成損傷,因此有必要在樣品進(jìn)色譜柱前進(jìn)行凈化處理。考慮到樣品的基質(zhì)特性,選取對(duì)氨基酸、蛋白質(zhì)及色素有比較好吸附能力的炭黑氨基萃取小柱作為凈化柱[14]。通過(guò)對(duì)活化后的炭黑氨基柱的空白洗脫液測(cè)試發(fā)現(xiàn),里面有一定量的殘留Cr(Ⅲ),我們采用25 mL超純水洗脫后,能使殘留在凈化柱中的Cr(Ⅲ)小于儀器檢出限。

考察了不同洗脫液的洗脫效果:1.0 mL空白溶液(含20 μg/L的Cr混標(biāo)和15%的乙醇)過(guò)凈化柱后,分別用9.0 mL純水、5%的甲醇、10%甲醇洗脫,測(cè)定并計(jì)算回收率,結(jié)果如表2所示。由表2可見(jiàn),鉻對(duì)洗脫溶劑中是否含有甲醇不敏感,所有條件下回收率都大于95%。因而,采用超純水作為洗脫液。

表1 過(guò)柱后的各個(gè)形態(tài)物質(zhì)的加標(biāo)回收率(%)

2.2 儀器條件的選擇

2.2.1 ICP-MS部分 聯(lián)機(jī)前使用布魯克.道爾頓公司提供的調(diào)諧液(Be、Mg、Co、In、Ba、Ce、TL、Pb、Th濃度 1 μg/L)對(duì)ICP-MS進(jìn)行自動(dòng)調(diào)諧校正,使儀器靈敏度和質(zhì)量數(shù)準(zhǔn)確度在最佳狀態(tài)。由于樣品及流動(dòng)相中都會(huì)有其他元素引入并在等離子體中形成多原子離子如ArC+和ClOH+對(duì)Cr52的檢測(cè)造成干擾。因此需要利用儀器具備的錐面碰撞技術(shù)導(dǎo)入碰撞氣以消除。采用儀器制造商推薦的He作為碰撞氣,優(yōu)化流量為125 mL/mim。

2.2.2 液相色譜部分 因Cr(Ⅲ)和Cr(VI)在有氧化或還原物條件下形態(tài)間易互相轉(zhuǎn)化,所有器皿的清洗與試劑的配制均采用超純水。液相色譜的不銹鋼(Cr含量>13%)也會(huì)帶入本底污染,本實(shí)驗(yàn)中將液相部件間的連接不銹鋼管路及定量環(huán)換成PEEK管,再用磷酸清洗,硝酸溶液(v∶v,1∶1)對(duì)液相色譜中剩余的不銹鋼泵體及切換閥進(jìn)行鈍化處理,再用超純水清洗至流出液pH為中性,并選擇PEEK管裝的離子色譜柱來(lái)分析樣品。以60 mmoL的硝酸銨溶液(pH9.0)為流動(dòng)相,流速為1.5 mL/min,進(jìn)樣量為50 μL為液相分析條件,比較發(fā)現(xiàn)戴安的離子色譜柱對(duì)于Cr的分離優(yōu)于漢密爾頓的柱子。漢密爾頓的色譜柱也能對(duì)Cr的兩種形態(tài)進(jìn)行分離,但分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng),整個(gè)分離過(guò)程將近10 min。而戴安的柱子可以在3 min內(nèi)完成分析與沖洗,并有較好的分離效果,0.2 μg/L的Cr(Ⅲ)、Cr(VI)標(biāo)樣色譜圖見(jiàn)圖1。因而采用戴安AG11-HC陰離子預(yù)柱(4 mm×50 mm×9 μm)來(lái)作為樣品分離的色譜柱。

圖1 0.2 μg/L的Cr(Ⅲ)、Cr(VI)標(biāo)樣色譜圖Fig.1 Chromatogram of a mixture of Cr(Ⅲ)and Cr(VI)standards

2.3 線性關(guān)系、測(cè)定低限、添加回收率及精密度

2.3.1 線性關(guān)系及測(cè)定低限 0～20.0 μg/L范圍內(nèi)配制濃度為0.0、0.2、0.5、1.0、2.0、10、20 μg/L的2種鉻形態(tài)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,并分別以v∶v(1∶1)與10 mmol/L EDTA鉀鹽溶液混合,在50 ℃水浴中反應(yīng)1 h,使Cr(Ⅲ)生成穩(wěn)定的Cr(Ⅲ)-EDTA配合物,冷卻后上機(jī)檢測(cè)?；貧w出鉻形態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)表3),Y為響應(yīng)值,X為測(cè)試濃度(μg/L),在0～20.0 g/L范圍內(nèi),2種鉻形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好,相關(guān)系數(shù)均大于0.998。將0.5 μg/L的混標(biāo)溶液逐級(jí)稀釋,以3倍信噪比為檢出限,10倍信噪比為定量限,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

表2 Cr價(jià)態(tài)線性關(guān)系及檢出限

2.3.2 添加回收及精密度 在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)按照1.2條件對(duì)添加標(biāo)準(zhǔn)溶液黃酒樣品進(jìn)行測(cè)定,驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性和添加回收率。三個(gè)濃度下回收率在81.2%～94.8%,精密度1.7%～4.1%,檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表4。

2.4 方法的驗(yàn)證

聯(lián)系三家不同的實(shí)驗(yàn)室對(duì)加標(biāo)2.5、5.0、10.0 μg/L含有基質(zhì)的樣品,按照方法對(duì)回收率和穩(wěn)定性進(jìn)行了驗(yàn)證,驗(yàn)證情況如表5。各實(shí)驗(yàn)室回收率在81.6%～89.2%,精密度0.8%～4.8%。

表3 黃酒樣品添加結(jié)果及精密度數(shù)據(jù)

表4 方法驗(yàn)證數(shù)據(jù)

2.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

選取鉻總量含量較高的酒按照2.2條件對(duì)紹興地區(qū)不同廠家的年份酒樣中的鉻形態(tài)及含量進(jìn)行了測(cè)定并確定了各形態(tài)的含量,數(shù)據(jù)如表6所示,并以產(chǎn)品種類較豐富的A廠家為列,做了不同類型黃酒中鉻形態(tài)分析測(cè)定,結(jié)果如表7所示。

由表6、表7中數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn):黃酒中的鉻以Cr(Ⅲ)的形態(tài)存在,只有味淋酒中檢測(cè)出少量的Cr(Ⅵ)。分析原因,可能是黃酒中在發(fā)酵過(guò)程中普遍會(huì)產(chǎn)生少量乙酸等酸性物質(zhì),導(dǎo)致黃酒的pH在3～4左右,同時(shí)黃酒中含有總酚、氨基酸等抗氧化物,容易使Cr(Ⅵ)轉(zhuǎn)化成Cr(Ⅲ)。為了驗(yàn)證這個(gè)轉(zhuǎn)化過(guò)程,將10 μg/L Cr(Ⅵ)黃酒加標(biāo)樣品兩天前后Cr(Ⅵ)檢測(cè)結(jié)果的對(duì)比,如圖2所示,由圖可見(jiàn),2 d后,Cr(Ⅵ)的峰消失了,在Cr(Ⅲ)的位置出現(xiàn)了峰,由此推測(cè),Cr(Ⅵ)在酸性黃酒中不穩(wěn)定,易向Cr(Ⅲ)轉(zhuǎn)化。而味淋酒由于不經(jīng)過(guò)發(fā)酵處理,其pH相對(duì)較高,一般在6.0左右,同時(shí)含有的總酚、氨基酸等的發(fā)酵產(chǎn)物的含量也相對(duì)較低,為Cr(Ⅵ)存在創(chuàng)造了一定條件。

表5 不同廠家不同年份酒中的鉻形態(tài)分析

表6 同廠家不同品種的酒的比較

圖2 1 μg/LCr(Ⅵ)黃酒加標(biāo)2 d前后譜圖對(duì)照Fig.2 1 μg/L Cr(Ⅵ)rice wine with standard spectra comparison before and after two days

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)色譜及光譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化,建立了炭黑氨基柱凈化-HPLC-ICP-MS測(cè)定黃酒中鉻價(jià)態(tài)及含量的方法。該方法簡(jiǎn)單快速,適用于黃酒中鉻形態(tài)殘留的分析檢測(cè)，在0～20 μg/L范圍內(nèi)Cr(Ⅲ)、Cr(Ⅵ)線性良好,添加回收率在81.2%～94.8%之間,定量限分別為0.12 μg/L和0.18 μg/L。利用該方法對(duì)不同年份、不同企業(yè)及不同類型的黃酒進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)紹興地區(qū)的黃酒中的鉻主要以Cr(Ⅲ)形態(tài)存在,此項(xiàng)工作的開(kāi)展有助于黃酒消費(fèi)者選擇性的采購(gòu)和監(jiān)管部門(mén)采取相應(yīng)的措施。

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Determination of chromium species and content in rice wine by high performance liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry

SONG Wei-hua,DONG Wen-hong,HU Bei-zhen,LIN Huan-yu

(Comprehensive Technologic Service Center of Shaoxing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shaoxing 312000,China)

A high performance liquid chromatography and inductively coupled plasma mass spectrometry(HPLC-ICP-MS)method was developed for determination of Cr(Ⅲ),Cr(Ⅵ)in rice wine. The wine sample was purified with Carb-NH2SPE column,eluted with ultra-pure water and then separated on a Dionex AS11-HC(4 mm×50 mm×9 μm)column using 60 mmol/L ammonium nitrate(pH9.0)at 1.5mL/min as mobile phase. Identification and quantification were achieved by inductively coupled plasma mass spectrometry(ICP-MS). It showed good liner correlation between 0 and 20 μg/L with correlation coeficients better than 0.998.The average recoveries of Cr(Ⅲ)and Cr(Ⅵ)ranged from 81.2% to 94.8% at different spiked level sand the relative standard deviations ranged from 1.7% to 4.1%. The quantification limits of Cr(Ⅲ)and Cr(Ⅵ)were 0.12 μg/L and 0.18 μg/L respectively. The method was suited for determination of chromium species in rice wine. Shao xing rice wines of different kind and different age from different manufacturers were determinted using the established method,results showed that Cr(Ⅲ)was the main specie.

high performance liquid chromatography;carbon black amino column;inductively coupled plasma mass spectrometry;chromium species;rice wine

2015-01-23

宋偉華(1982-)，女,碩士研究生，工程師，從事食品工業(yè)品檢測(cè)工作,E-mail：zcswh@sx.ziq.gov.cn。

浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究(分析測(cè)試)項(xiàng)目(2013C37095)。

TS207

A

1002-0306(2015)21-0303-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.054