微波輔助提取油橄欖多酚及抗氧化活性研究

王寒冬,劉 靜,劉 露,向春蓉,李 天,楊澤身,丁春邦,*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,四川雅安 625014;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,四川成都 611130;3.涼山州中澤新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司,四川西昌 615000)

微波輔助提取油橄欖多酚及抗氧化活性研究

王寒冬1,劉 靜1,劉 露1,向春蓉1,李 天2,楊澤身3,丁春邦1,*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,四川雅安 625014;2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,四川成都 611130;3.涼山州中澤新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司,四川西昌 615000)

以油橄欖鮮果為實(shí)驗(yàn)材料,采用響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取油橄欖多酚的工藝,并分析多酚提取液的抗氧化活性。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理建立二次回歸模型,確定最佳提取工藝條件為料液比1∶23(g/mL)、微波時(shí)間48 s、微波功率490 W,油橄欖多酚實(shí)際平均得率為6.9659 mg/g,與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為1.12%。油橄欖多酚提取液對(duì)DPPH自由基和羥基自由基的最大清除率分別為87.85%、68.12%,其IC50分別為0.055、0.188 mg/mL,對(duì)Cu2+的最大螯合率為54.18%,半螯合濃度為0.277 mg/mL。

油橄欖,多酚,響應(yīng)面法,微波輔助提取,抗氧化性

油橄欖(OleaeuropaeaL.)是木犀科木犀欖屬亞熱帶常綠喬木,又名洋橄欖、齊墩果,與油棕、油茶和椰子并稱(chēng)為世界四大木本油料作物,盛產(chǎn)于地中海地區(qū)。我國(guó)自20世紀(jì)60年代開(kāi)始陸續(xù)引種,目前主要分布于甘肅隴南、四川廣元和涼山、云南西北部金沙江流域等地區(qū)[1]。

油橄欖是一種高效經(jīng)濟(jì)價(jià)值的樹(shù)種,其主要產(chǎn)品-橄欖油是由成熟的鮮果直接冷榨得到,不經(jīng)過(guò)熱處理和化學(xué)處理,保留了油橄欖原有的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,含有大量不飽和脂肪酸、維生素、類(lèi)胡蘿卜素、角鯊烯、甾醇、多種酚酸等生物活性成分[2-3],具有增進(jìn)消化能力、預(yù)防心腦血管疾病、促進(jìn)骨骼和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、防癌抗腫瘤、抗氧化等多種生物功能,享有“液體黃金”和“植物油皇后”之美譽(yù)[4]。多酚是橄欖油的主要活性物質(zhì)之一,已有研究證實(shí)多酚具有抗氧化、降脂降糖、抑菌抗炎、抗輻射、延緩骨質(zhì)疏松和抗腫瘤等多種功能[5-8]。橄欖油含有豐富的葉綠素,葉綠素及其衍生物都是光敏劑,在儲(chǔ)存過(guò)程中受環(huán)境等作用,會(huì)使油脂氧化酸敗[9]。橄欖油中多酚化合物的存在,有利于橄欖油的儲(chǔ)存。

目前植物多酚的提取方法主要有溶劑提取法、生物酶解提取法、微波輔助提取法、超臨界流體萃取法、膜技術(shù)提取法和超聲波輔助提取法等[10],其中,微波輔助提取法是利用微波提高有效成分提取率的一種技術(shù),具有低消耗、高效率、操作簡(jiǎn)便和節(jié)約時(shí)間的優(yōu)點(diǎn),現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物中有效成分的提取[11-12]。因此,本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法(response surface methodology,RSM)優(yōu)化油橄欖果中多酚的微波輔助提取工藝,并分析多酚提取液的抗氧化活性,為油橄欖果中多酚化合物的進(jìn)一步研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油橄欖鮮果 于2013年8月,采自四川省西昌北河油橄欖基地的皮瓜爾品種。清洗干凈冷凍儲(chǔ)藏備用。無(wú)水碳酸鈉、沒(méi)食子酸、福林酚顯色試劑溶液、抗壞血酸(VC)、鄰二氮菲 成都科龍化工試劑有限公司;2,2-二苯基-1-苦味基肼(DPPH) 美國(guó)Sigma公司;甲醇、CuSO4、FeSO4、EDTANa2均為分析純。

BT-124S電子天平 德國(guó)Sartorius公司;G70D20CN1P-D2(S0)微波爐 廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司;高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Thermo公司;RM-220實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī) 四川沃特爾科技發(fā)展有限公司;UV-1750分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 油橄欖果中多酚的提取 將冷凍的油橄欖果實(shí)去核,加液氮研成均勻的粉末,迅速稱(chēng)取0.5 g粉末,加入一定量的80%甲醇進(jìn)行微波輔助提取,提取液高速冷凍離心(4 ℃,8000 r/min,10 min),收集上清液,定容。

1.2.2 油橄欖果中多酚含量測(cè)定 采用Folin-Ciocalteu法[13],稍加改進(jìn)。取上清液100 μL,加3 mL蒸餾水,再加0.2 mL福林酚試劑混勻,約5 min左右加0.8 mL 10%的碳酸鈉溶液混勻,避光反應(yīng)1 h,于765 nm檢測(cè)吸光值。標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.0029X+0.0094,R2=0.9989,其中X為多酚濃度(μg/mL),Y為吸光值,以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品。

多酚得率(mg/g)=樣品液中多酚質(zhì)量濃度×樣品液體積/油橄欖粉末質(zhì)量/1000

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 料液比分別以1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL)于420 W的條件下微波輔助提取45 s,探討料液比對(duì)油橄欖果中多酚得率的影響;微波時(shí)間分別以30、45、60、75、90 s,以料液比1∶20(g/mL),420 W的條件下進(jìn)行微波輔助提取,探討微波時(shí)間對(duì)油橄欖多酚得率的影響;微波功率分別以140、280、420、560、700 W,于料液比1∶20(g/mL)的條件下微波輔助提取45 s,探討微波功率對(duì)油橄欖果中多酚得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,以料液比、微波時(shí)間和微波功率3個(gè)因素為自變量(X),以油橄欖多酚得率為響應(yīng)值(Y),根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理,設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)(表1),預(yù)測(cè)油橄欖多酚超聲輔助提取的最佳工藝。

表1 響應(yīng)面分析因素及水平表

1.2.5 油橄欖多酚提取液抗氧化活性研究

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定 采用分光光度法[14-15],取400 μL不同濃度的油橄欖多酚溶液,加入 2.0 mL 0.15 mmol/L DPPH溶液混勻,室溫暗反應(yīng)30 min,517 nm處測(cè)吸光值。以同濃度VC作為陽(yáng)性對(duì)照,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

DPPH自由基清除率(%)=(1-Ai/Aj)×100

式中,Ai為加入樣品的反應(yīng)液吸光值,Aj為用90%乙醇替代樣品的的反應(yīng)液吸光值。

1.2.5.2 羥基自由基清除能力的測(cè)定 參照J(rèn)in等[16]的方法,稍加改動(dòng)。取300 μL 0.75 mmol/L的鄰二氮菲溶液,加入100 μL不同濃度的油橄欖多酚溶液,加300 μL 0.75 mmol/L的FeSO4溶液,再加入200 μL 0.01% H2O2溶液,于室溫環(huán)境反應(yīng)1 h,535 nm處測(cè)吸光值。以同濃度VC作為陽(yáng)性對(duì)照,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

羥基自由基清除率(%)=(Ai-Aj)/(Ac-Aj)×100

式中,Ai為加入樣品的反應(yīng)液吸光值,Aj為用水替代樣品的反應(yīng)液吸光值,Ac為用水替代樣品和H2O2的反應(yīng)液吸光值。

1.2.5.3 Cu2+螯合能力的測(cè)定 參照Megías等[17]的方法,并適當(dāng)改進(jìn)。取400 μL 0.1 mg/mL CuSO4溶液,加入100 μL 4 mmol/L的鄰苯二酚紫溶液,再加入200 μL 不同濃度的油橄欖多酚溶液,室溫反應(yīng)20 min后于5000 r/min離心10 min,632 nm處測(cè)吸光值。以同濃度EDTANa2作為陽(yáng)性對(duì)照,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

Cu2+螯合率(%)=(1-Ai/Aj)×100

式中,Ai為加入樣品的反應(yīng)液吸光值,Aj為用水替代樣品的反應(yīng)液吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均是3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值,應(yīng)用Microsoft Excel 2010、Origin 8.0、SPSS 20對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 料液比對(duì)油橄欖多酚得率的影響 由圖1可知,隨著料液比的增加,多酚得率不斷增加,當(dāng)料液比增加到1∶20(g/mL)時(shí),多酚得率達(dá)到最大6.6499 mg/g;隨后多酚得率隨著料液比的增加而減少。這可能是當(dāng)料液比為1∶20(g/mL)時(shí),材料中的多酚基本溶出,再增加提取劑的量則將多酚的濃度稀釋,同時(shí),更多的溶劑可能會(huì)消耗微波的能量,多酚得率會(huì)有所下降[18]?？紤]到成本和后續(xù)濃縮,將優(yōu)化料液比選為1∶10、1∶20、1∶30(g/mL)。

圖1 料液比對(duì)多酚得率的影響Fig.1 Effect of material-liquid ratio on the extraction yield of polyphenols

2.1.2 微波時(shí)間對(duì)多酚得率的影響 由圖2 可知,當(dāng)微波時(shí)間由30 s增加到45 s的過(guò)程中,油橄欖果中的多酚得率大幅度增加;且在45 s時(shí),多酚的得率達(dá)到最大值為6.4060 mg/g,之后多酚得率有所降低。這可能是提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng),微波的強(qiáng)烈作用使多酚物質(zhì)有所破壞,引起多酚得率降低。因此,將優(yōu)化微波時(shí)間選為30、45、60 s。

圖2 微波時(shí)間對(duì)多酚得率的影響Fig.2 Effect of microwave processing time on the yield of polyphenols

2.1.3 微波功率對(duì)多酚得率的影響 由圖3 可知,油橄欖果中的多酚得率先隨著微波功率的增加而增加,這是由于微波功率的增加,引起細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化和細(xì)胞壁的破壞,有利于油橄欖果中的多酚溶出。當(dāng)微波功率達(dá)到420 W時(shí),多酚得率達(dá)到最大值為6.3988 mg/g。之后微波功率的增加可能產(chǎn)生局部瞬間高溫破壞多酚的結(jié)構(gòu),引起多酚得率降低。因此,將優(yōu)化微波功率選為280、420、560 W。

圖3 微波功率對(duì)多酚得率的影響Fig.3 Efeect of microwave power on the yield of polyphenol

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化油橄欖多酚提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 利用Design-Expert8.0軟件對(duì)表2中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合,得到油橄欖果中的多酚得率(Y)與料液比(X1)、微波時(shí)間(X2)和微波功率(X3)之間的回歸模型為:

Y=6.69+0.59X1+0.27X2+0.25X3-0.26X1X2-0.21X1X3-0.023X2X3-0.61X12-0.43X22-0.18X32

表2 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 回歸模型方差分析與顯著性檢驗(yàn) 利用Design-Expert8.0軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析(analysis of variance,ANOVA)(表3),結(jié)果顯示,模型極顯著(p<0.01),失擬項(xiàng)不顯著(p>0.05);R2=0.9691,校正R2=0.9294,說(shuō)明該模型擬合度較好;CV=2.92%,該值相對(duì)較小,顯示實(shí)驗(yàn)操作具有可信度。

表3 回歸模型方差分析

注:表中**為極顯著(p<0.01),*為顯著(p<0.05)。

因此該模型可以用于預(yù)測(cè)油橄欖多酚微波輔助提取的最佳工藝。各因素對(duì)油橄欖多酚得率的影響程度依次是料液比>微波時(shí)間>微波功率。只有料液比和微波時(shí)間的交互作用顯著。

2.2.3 響應(yīng)面分析 根據(jù)回歸方程,繪制多酚得率和實(shí)驗(yàn)因素料液比、微波時(shí)間和微波功率的響應(yīng)面圖(圖4～圖6)。等高線的形狀可以反映出交互作用的強(qiáng)弱,橢圓形表明交互作用顯著,而圓形則與之相反,有閉合的橢圓或圓形則表明有極大值[19]。由圖4可知,料液比和微波時(shí)間的交互作用顯著,其他交互作用不顯著,這與表3中的分析結(jié)果一致。

圖4為當(dāng)微波功率為420 W時(shí),料液比和微波時(shí)間的響應(yīng)面圖。微波時(shí)間一定時(shí),隨著料液比的增加,油橄欖多酚得率增大;當(dāng)料液比達(dá)到一定值之后,多酚得率隨之減少;當(dāng)料液比一定時(shí),多酚得率隨著微波時(shí)間的增加,先增大后減少。圖5為當(dāng)微波時(shí)間為45 s時(shí),料液比和微波功率的響應(yīng)面圖。微波功率一定時(shí),隨著料液比的增加,多酚得率迅速增;當(dāng)料液比達(dá)到一定值之后,多酚得率緩慢減少;當(dāng)料液比一定時(shí),多酚得率隨著微波功率的增加而增加。圖6為當(dāng)料液比為1∶20(g/mL)時(shí),微波時(shí)間和微波功率的響應(yīng)面圖。微波功率一定時(shí),隨著微波時(shí)間的增加,多酚得率增大,當(dāng)微波時(shí)間達(dá)到一定值之后,多酚得率隨之減少;當(dāng)微波時(shí)間一定時(shí),多酚得率隨著微波功率的增加而增加。

圖4 料液比和微波時(shí)間對(duì)多酚得率影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface of material-liquid ratio and microwave processing time on the yield of polyphenols

圖5 料液比和微波功率對(duì)多酚得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface of of material-liquid ratio and microwave power on the yield of polyphenols

圖6 微波時(shí)間和微波功率對(duì)多酚得率影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface of microwave processing time and microwave power on the yield of polyphenols

2.2.4 最佳工藝參數(shù)與驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化,得到的微波輔助油橄欖多酚提取的最佳工藝參數(shù)為料液比1∶23.2(g/mL)、微波時(shí)間48.15 s、微波功率474.6 W,在此條件下油橄欖多酚得率 為6.8833 mg/g。

考慮到實(shí)際操作條件,將最佳工藝參數(shù)調(diào)整為料液比1∶23(g/mL)、微波時(shí)間48 s、微波功率490 W,在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),油橄欖多酚實(shí)際平均得率為6.9659 mg/g,與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為1.12%。表明回歸模型擬合度高,可用于優(yōu)化微波輔助提取油橄欖多酚的工藝條件,具有實(shí)用價(jià)值。

2.3 油橄欖多酚提取液抗氧化活性分析

2.3.1 多酚提取液對(duì)DPPH自由基清除能力 由圖7可知,油橄欖多酚提取液和VC對(duì)DPPH自由基的清除能力接近,在低濃度范圍內(nèi),清除率與質(zhì)量濃度有明顯的量效關(guān)系;高濃度時(shí),清除率趨于平緩。當(dāng)質(zhì)量濃度大于0.092 mg/mL時(shí),清除率基本穩(wěn)定在87.85%,其IC50為0.055 mg/mL。表明油橄欖多酚提取液具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力。

圖7 多酚提取液和VC清除DPPH自由基的能力Fig.7 Scavenging capacity of polyphenol extracts and VC on DPPH radical

2.3.2 羥基自由基清除能力 由圖8可知,油橄欖多酚提取液對(duì)羥基自由基的清除能力低于VC對(duì)羥基自由基的清除能力,在低濃度范圍內(nèi),清除率與質(zhì)量濃度有較好的量效關(guān)系;高濃度時(shí),清除率趨于平緩。當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.288 mg/mL 時(shí),多酚提取液對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)到最大值68.12%,其IC50為0.188 mg/mL。表明油橄欖多酚提取液具有一定的清除羥基自由基的能力。

圖8 多酚提取液和VC清除羥基自由基的能力Fig.8 Sacvenging capacity radical of polyphenol extracts and VC on hydroxyl

2.3.3 多酚提取液對(duì)Cu2+螯合能力 由圖9可知,油橄欖多酚提取液對(duì)Cu2+的螯合能力略低于VC對(duì)Cu2+的螯合能力,在考察濃度范圍內(nèi),螯合率隨著樣品濃度的增大逐漸增強(qiáng),與濃度有明顯的量效關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為0.288 mg/mL時(shí),油橄欖多酚提取液對(duì)Cu2+的螯合率為54.18%,其半螯合濃度為0.260 mg/mL。表明油橄欖多酚提取液具有較強(qiáng)的Cu2+螯合能力。

圖9 多酚提取液和EDTANa2對(duì)Cu2+螯合的能力Fig.9 Chelating capacity of Cu2+ of polyphenol extracts and EDTANa2

3 結(jié)論

3.1 利用響應(yīng)面法優(yōu)化得到微波輔助提取油橄欖果中多酚的最佳工藝條件為:料液比1∶23(g/mL),微波時(shí)間48 s,微波功率490 W,在此條件下進(jìn)行3次平行重復(fù)實(shí)驗(yàn),得到油橄欖多酚實(shí)際平均得率為6.9659 mg/g,與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差為1.12%。說(shuō)明此優(yōu)化工藝參數(shù)可靠,具有實(shí)用價(jià)值。

3.2 通過(guò)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明,油橄欖多酚提取液對(duì)DPPH自由基和羥基自由基都具有一定的清除能力,對(duì)Cu2+具有一定的螯合能力;清除DPPH自由基的IC50為0.055 mg/mL,清除羥基自由基的IC50為0.188 mg/mL,對(duì)Cu2+的半螯合濃度為0.277 mg/mL。因此,油橄欖鮮果中的多酚具有較好的抗氧化活性。

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Study on the microwave-assisted extraction and antioxidant capacity of polyphenols from olive fruits

WANG Han-dong1,LIU Jing1,LIU Lu1,XIANG Chun-rong1,LI Tian2,YANG Ze-shen3,DING Chun-bang1，*

(1.College of Life Sciences,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China；2.College of Agronomy,Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130,China；3.Liangshan Zhongze New Tech Development Co.Ltd,Xichang 615000,China)

Response surface analysis methodology(RSM)was applied to optimize the microwave-assisted extraction conditions of polyphenols from fresh olive fruits,furthermore,the study investigated the antioxidant activity of polyphenols extracts. Based on single factor experiments,a quadratic regression model was established according to the Box-Behnken experimental design. The optimum microwave-assisted conditions were material-liquid ratio 1∶23(g/mL),microwave time 48 s,microwave power 490 W. Validation experiments were carried out at the optimum microwave-assisted conditions,the average yield of polyphenols was 6.9659 mg/g,the relative error between experimental values and the predicted value was 1.12%. It showed that the optimization process was feasible. The maximum inhibition percentage of DPPH and hydroxyl radical of polyphenol extracts were 87.85% and 68.12%,respectively. The IC50value were 0.055 mg/mL and 0.188 mg/mL,respectively. In addition,the maximum chelating rate of Cu2+was 54.18%,the Cu2+chelating concentration in half of polyphenols extracts was 0.277 mg/mL.

olive;polyphenols;response surface analysis methodology(RSM);microwave-assisted extraction;antioxidant capacity

2015-02-12

王寒冬(1993-)，女，碩士研究生，主要從事油橄欖品種選育研究，E-mail:1091228832@qq.com。

*通訊作者:丁春邦(1966-)，女，博士，教授，主要從事植物學(xué)教學(xué)與科研工作，E-mail:dcb@sicau.edu.cn。

四川省科技廳科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2013NZ0047)。

TS201.2

B

1002-0306(2015)21-0204-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.034