卷枝毛霉Δ12-脫飽和酶基因的克隆及其在釀酒酵母中的高效表達(dá)

劉小琳,江賢章,張明亮,黃建忠

(1.福建師范大學(xué)閩南科技學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)系,福建泉州 362332;2.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院福建省現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)工程研究中心工業(yè)微生物教育部工程研究中心,福建福州 350108)

卷枝毛霉Δ12-脫飽和酶基因的克隆及其在釀酒酵母中的高效表達(dá)

劉小琳,江賢章,張明亮,黃建忠*

(1.福建師范大學(xué)閩南科技學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)系,福建泉州 362332;2.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院福建省現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)工程研究中心工業(yè)微生物教育部工程研究中心,福建福州 350108)

Δ12-脫飽和酶是亞油酸合成的關(guān)鍵酶,為提高Δ12-脫飽和酶的活性,本研究利用RT-PCR對(duì)Mucor sp. EIM-10的Δ12-脫飽和酶cDNA進(jìn)行克隆,并導(dǎo)入pYES2.0質(zhì)粒中,構(gòu)建重組表達(dá)載體。運(yùn)用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入釀酒酵母,成功構(gòu)建pYMD12釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)。為了進(jìn)一步提高Δ12-脫飽和酶的表達(dá)水平,用GAP啟動(dòng)子替代pYES2.0質(zhì)粒自帶的啟動(dòng)子,成功構(gòu)建pYGAPMD12重組菌。最終產(chǎn)物經(jīng)GC-MS檢測(cè)顯示,pYGAPMD12重組菌轉(zhuǎn)化C18∶1的轉(zhuǎn)化率為69.172%,比pYMD12重組菌提高32.771%。本文為進(jìn)一步提高Δ12-脫飽和酶的表達(dá)水平提供參考依據(jù)。

Δ12-脫飽和酶,GAP啟動(dòng)子,釀酒酵母,卷枝毛霉

多不飽和脂肪酸(PUFAs)在機(jī)體內(nèi)具有廣泛的生理功能和生物學(xué)效應(yīng)[1],亞油酸作為一種多不飽和脂肪酸,不僅具有降膽固醇和甘油三酯,預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的作用,而且還是亞麻酸和花生四烯酸等多不飽和脂肪酸的合成前體[2]。而Δ12-脂肪酸脫飽和酶[3-4]是脂肪酸生物合成途徑中形成亞油酸(LA)的限速酶,在脂肪酸鏈C12與C13之間插入1個(gè)雙鍵,催化油酸轉(zhuǎn)變?yōu)閬営退醄5-6]。

酵母表達(dá)系統(tǒng)具有脂肪酸延長(zhǎng)酶和脫飽和酶催化所需的各種因子,而且不存在脫飽和酶后的脂肪酸延長(zhǎng)酶和脫飽和酶,適用作脫飽和酶的表達(dá)系統(tǒng)。釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeINVSc是一種尿嘧啶合成缺陷型菌株,在不含尿嘧啶的SC-U選擇培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng),而釀酒酵母表達(dá)質(zhì)粒pYES2.0可以產(chǎn)生尿嘧啶,可以用來(lái)篩選陽(yáng)性克隆子[7-8]。

圖1 表達(dá)載體pYMD12和pYGAPMD12的構(gòu)建Fig.1 Construction of pYMD12 and pYGAPMD12 vector

本文從Mucorsp.EIM-10中克隆Δ12-脫飽和酶cDNA基因,連接到pYES2.0質(zhì)粒中,構(gòu)建重組表達(dá)載體,并實(shí)現(xiàn)其在釀酒酵母中的表達(dá),為進(jìn)一步研究脫飽和酶的高效表達(dá)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種與質(zhì)粒Mucorsp.EIM-10 福建師范大學(xué)工業(yè)微生物教育部工程研究中心;釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型INVSc1和pYES2.0載體 Invitrogen公司;pMD-18 Simple T載體 TAKARA公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 Sc-U培養(yǎng)基:成分均購(gòu)自Invitrogen公司,按其操作手冊(cè)推薦方法配制;誘導(dǎo)培養(yǎng)基:在SC-U液體培養(yǎng)基中添加2%半乳糖。

1.1.3 主要試劑與儀器 ExTaq DNA聚合酶,限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ,XhoⅠ,KpnⅠ和BamH Ⅰ、T4連接酶 TaKaRa公司;亞油酸、棉子糖、Sc-U培養(yǎng)基所需各種氨基酸 sigma公司;其余試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純,引物合成和測(cè)序由上海生工完成。

ABI2720 PCR儀 Amersham Biosciences;JS-380A自動(dòng)凝膠圖像分析儀 上海培清科技有限公司;高速臺(tái)式冷凍離心機(jī) Beckman;氣質(zhì)聯(lián)用儀GC-MS 安捷倫。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 cDNA序列的克隆 利用Trizol法提取Mucorsp.EIM-10的總RNA。以總RNA為模板,以PC1(CCGGAATTCATGGCAACCAAGAGAAACG)和PC2(CCGCTCGAGTTAGTTCTTAAAGAAGACAACATCG)為上下游引物,通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增得到Δ12-脂肪酸脫飽和酶cDNA序列。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃ 5 min,94 ℃ 1 min,55 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,循環(huán)30次;72 ℃延長(zhǎng)10 min;1.0%的瓊脂糖凝膠電泳回收產(chǎn)物。

PC1和PC2引物是根據(jù)NCBI已報(bào)道的絲狀真菌的Δ12-脂肪酸脫飽和酶基因的保守序列進(jìn)行設(shè)計(jì),以Mucorrouxii delta-12 desaturasegene(登錄號(hào):AY533361)為模板,從頭設(shè)計(jì)引物,并在PC1和PC2前分別添加EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。

1.2.2 重組質(zhì)粒pYMD12的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化 pYES2.0載體和Δ12-脫飽和酶cDNA分別經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后,連接,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,運(yùn)用氨芐抗性平板篩選得到陽(yáng)性克隆子,命名為pYMD12重組質(zhì)粒(圖1)。運(yùn)用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法[9],將pYMD12轉(zhuǎn)化釀酒酵母尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株INVSc1感受態(tài),以pYES2.0質(zhì)粒為空白對(duì)照,涂布在Sc-U合成培養(yǎng)基,于28 ℃培養(yǎng)3 d,獲得陽(yáng)性克隆子。

1.2.3 重組質(zhì)粒pYGAPMD12的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

1.2.3.1 GAP啟動(dòng)子的克隆 運(yùn)用堿裂解法,提取畢赤酵母表達(dá)載體pGAPZα質(zhì)粒[10]。以pGAPZα質(zhì)粒DNA為模板,以Pgap1(CGGGGTACCAGATCTTT TTTGTAGAAATGTCTTGG)和Pgap2(CGCGGATCC ATAGTTGTTCAATTGATTGAAATAGG)為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃ 5 min,94 ℃ 1 min、53 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min,72 ℃ 10 min;循環(huán)30次。

Pgap1和Pgap2引物是根據(jù)畢赤酵母表達(dá)載體pGAPZα中GAP啟動(dòng)子[11]的序列設(shè)計(jì),并分別加入KpnⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)。

1.2.3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化 重組質(zhì)粒pYMD12和GAP啟動(dòng)子片段分別于37 ℃水浴,用KpnⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切,保溫過(guò)夜,酶切產(chǎn)物經(jīng)分別回收后,16 ℃連接過(guò)夜,將重組質(zhì)粒命名為pYGAPMD12,如圖1所示,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌,雙酶切驗(yàn)證。轉(zhuǎn)化和篩選方法同1.2.2。

1.2.4 重組質(zhì)粒的表達(dá) 分別挑取SC-U平板上的陽(yáng)性克隆子pYMD12,pYGAPMD12接種于2 mL SC-U液體培養(yǎng)基中,28 ℃,230 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜;取2 mL接種于30 mL的SC-U液體培養(yǎng)基中,28 ℃,230 r/min振蕩培養(yǎng),運(yùn)用分光光度計(jì)測(cè)量菌液OD600;培養(yǎng)至OD600=0.2～0.3時(shí),接種pYMD12的培養(yǎng)基中添加2%半乳糖進(jìn)行誘導(dǎo),而接種pYGAPMD12的培養(yǎng)基不添加,分別轉(zhuǎn)至25 ℃,230 r/min振蕩培養(yǎng)72 h。

1.3 測(cè)定方法

分別離心收集菌體,提取總油脂并甲酯化,利用安捷倫6890N/5975MS氣相色譜-質(zhì)譜分析脂肪酸組成。GC-MS分析條件如下[12]:.氣相色譜條件:氣相色譜儀,HP-INNOWax polyethylene glycol極性柱(30.0 m×0.25 mm×φ0.25 μm)。柱加熱程序:150 ℃維持1 min,150 ℃至210 ℃(10 ℃/min),210 ℃保持5 min,210 ℃至230 ℃(2 ℃/min),230 ℃保持4 min,240 ℃保持5 min。進(jìn)樣口溫度:250 ℃,檢測(cè)器溫度:280 ℃,進(jìn)樣量:1 μL的,分流比:5∶1。質(zhì)譜條件:質(zhì)譜儀,檢測(cè)器離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃;電離能70 eV,電離模式,EI;測(cè)量方式:全掃描,掃描范圍:M/Z30-500,1.61scans/s;溶劑切除時(shí)間:3 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組質(zhì)粒pYMD12的構(gòu)建

2.1.1 總RNA的提取 利用Trizol法提取Mucorsp.EIM-10總RNA,在2%瓊脂糖凝膠上明顯出現(xiàn)28S、18S兩條帶(圖2),說(shuō)明所提RNA的完整性好。

圖2 卷枝毛霉EIM-10總RNAFig.2 Total RNA of Mucor sp. EIM-10

2.1.2 cDNA序列克隆 以Mucorsp.EIM-10總RNA為模板,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增到約1200 bp的cDNA序列(圖3)。經(jīng)NCBI序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),與Mucorrouxii(登錄號(hào):AF533361.1)同源性高達(dá)94%,且該片段具有完整的閱讀框,說(shuō)明cDNA克隆成功。

圖3 cDNA序列克隆 Fig.3 Coloning of cDNA sequenceM:200 bp DNA marker;1，2：樣品。

2.1.3 重組質(zhì)粒pYMD12雙酶切驗(yàn)證 運(yùn)用EcoRⅠ和XhoI對(duì)篩選的陽(yáng)性克隆子進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,如圖4所示:雙酶切結(jié)果顯示兩條清晰的條帶且條帶的位置與PCR克隆的結(jié)果一致,說(shuō)明目的片段與pYES2.0載體成功連接。

圖4 雙酶切驗(yàn)證Fig.4 Digested identification M:200 bp marker;1,2:雙酶切樣品。

2.2 重組質(zhì)粒pYGAPMD12的構(gòu)建

2.2.1 GAP啟動(dòng)子克隆 以pGAPZα質(zhì)粒DNA為模板,以Pgap1和Pgap2為引物,克隆的GAP片段約為500 bp,且條帶單一。經(jīng)序列比對(duì),克隆片段與已報(bào)道的序列完全一致,說(shuō)明GAP片段克隆成功,結(jié)果如圖5:

圖5 GAP啟動(dòng)子克隆Fig.5 Coloning of GAP promoterM：200 bp marker;1，2:GAP樣品。

2.2.2 重組質(zhì)粒pYGAPMD12雙酶切驗(yàn)證 用kpnⅠ和BamHⅠ對(duì)重組質(zhì)粒pYGAPMD12進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證,結(jié)果顯示兩條清晰的條帶且條帶位置正確(圖6),說(shuō)明GAP啟動(dòng)子片段與pYMD12質(zhì)粒成功連接。

圖6 雙酶切驗(yàn)證Fig.6 Digested identification M:1000bp marker;1:雙酶切樣品。

2.3 重組質(zhì)粒pYMD12和pYGAPMD12的轉(zhuǎn)化

2.3.1 重組釀酒酵母的篩選和鑒定 運(yùn)用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒pYMD12和pYGAPMD12分別轉(zhuǎn)入釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株INVSc1,涂布在SC-U選擇性培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)3 d至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證,結(jié)果如圖7、圖8所示,PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期一致,表明重組釀酒酵母構(gòu)建成功。

圖7 pYMD12轉(zhuǎn)化子菌落PCR驗(yàn)證Fig.7 Identification of pYMD12 transformants by Colony PCRM:200bp marker;1，2:MD12樣品。

圖8 GAP轉(zhuǎn)化子菌落PCR驗(yàn)證Fig.8 Identification of GAP by Colony PCRM:200 bp marker;1，2:GAP樣品。

2.3.2 重組釀酒酵母的誘導(dǎo)表達(dá) 提取重組菌的總脂肪酸,并甲酯化,GC/MS分析結(jié)果顯示:重組菌pYMD12出現(xiàn)了與亞油酸(C18∶2)甲酯標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)應(yīng)的峰(保留時(shí)間為10.584 min),而空白對(duì)照沒(méi)有出現(xiàn)此峰(圖9)。通過(guò)質(zhì)譜分析證明新出現(xiàn)的峰為亞油酸(十八碳二烯酸)甲酯(保留時(shí)間為10.584 min)(圖10),說(shuō)明在半乳糖的誘導(dǎo)下,重組菌pYMD12成功表達(dá)的Δ12-脫飽和酶,將底物油酸催化生成亞油酸。

另外,重組菌pYGAPMD12出現(xiàn)了與十六碳二稀酸(C16∶2)甲酯標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)應(yīng)的峰(保留時(shí)間為8.115 min),而空白對(duì)照和重組菌pYMD12均沒(méi)有出現(xiàn)此峰(圖9)。通過(guò)質(zhì)譜分析證明新出現(xiàn)的峰為亞油酸甲酯(保留時(shí)間為10.584 min),十六碳二稀酸(保留時(shí)間為8.115 min)(圖10)。因此,無(wú)需誘導(dǎo)劑半乳糖的作用,重組菌pYGAPMD12表達(dá)的Δ12-脫飽和酶也具有催化效率。

圖9 含有重組質(zhì)粒的酵母脂肪酸甲酯的GC/MS分析Fig.9 GC/MS analysis of fatty acid methyl esters extracted from transformed yeast containing pYMD12

圖10 脂肪酸成分質(zhì)譜鑒定Fig.10 Identification of fatty acid compositions by mass spectrometry

綜上,由于強(qiáng)啟動(dòng)子GAP的引入,重組菌pYGAPMD12相比重組菌pYMD12的優(yōu)勢(shì)在于無(wú)需誘導(dǎo)劑半乳糖的誘導(dǎo),且重組菌pYGAPMD12可以催化十六碳一稀酸(C16∶1)生成十六碳二稀酸(C16∶2)。

2.3.3 脂肪酸轉(zhuǎn)化效率 內(nèi)源油酸(C18∶1)在Δ12-脫飽和酶的催化下生成亞油酸(C18∶1)的轉(zhuǎn)化效率為:轉(zhuǎn)化效率=產(chǎn)物/(底物+產(chǎn)物)×100%。由此可知從油酸到亞油酸,重組菌pYMD12和pYGAPMD12表達(dá)的Δ12-脫飽和酶的轉(zhuǎn)化效率分別為36.401%和69.172%。另外,重組菌pYGAPMD12催化十六碳一稀酸(C16∶1)生成十六碳二稀酸(C16∶2)的轉(zhuǎn)化效率為32.943%,而重組菌pYMD12不能催化十六碳一稀酸(C16∶1),結(jié)果如表1所示。

表1 各表達(dá)載體脂肪酸轉(zhuǎn)化效率

3 結(jié)論

本文成功地從Mucor sp.EIM-10中獲得Δ12-脫飽和酶cDNA序列,并將該序列導(dǎo)入pYES2.0載體中,構(gòu)建成功pYMD12重組質(zhì)粒。運(yùn)用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法成功將pYMD12重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株INVSc1中,從SC-U缺陷型平板中篩選得陽(yáng)性克隆子,提取總脂肪酸進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析,結(jié)果顯示:內(nèi)源油酸(C18∶1)在Δ12-脫飽和酶的催化下生成亞油酸(C18∶1)的轉(zhuǎn)化效率為36.401%。

為了進(jìn)一步提高表達(dá)量,用畢赤酵母表達(dá)載體pGAPZα上的GAP強(qiáng)啟動(dòng)子替代pYES2.0質(zhì)粒自帶的啟動(dòng)子,成功構(gòu)建pYGAPMD12表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化表達(dá),提取總脂肪酸進(jìn)行GC-MS檢測(cè)分析,結(jié)果顯示:無(wú)需半乳糖誘導(dǎo),pYGAPMD12轉(zhuǎn)化C18∶1的轉(zhuǎn)化率為69.172%,相對(duì)pYMD12,轉(zhuǎn)化率提高了32.771%,而且pYGAPMD12可以轉(zhuǎn)化C16∶1,轉(zhuǎn)化效率為32.943%。

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Cloning and high expression of Δ12-desaturase genes fromMucorcircinelloidesEIM-10

LIU Xiao-lin,JIANG Xian-zhang,ZHANG Ming-liang,HUANG Jian-zhong*

(1.Department of Chemistry and Life Science,Minnan Science and Technology Institute Fujian Normal University,Quanzhou 362332,China；2.Engineering Research Center of Industrial Microbiology,Engineering Research Center of Fujian Modern Ferment Technology,Ministry of Education,College of Life Science,Fujian Normal University,Fuzhou 350108,China)

Δ12-desaturase plays an important role in the biosynthesis of linoleic acid inMucorspEIM-10. To improve enzymatic on the Δ12-desaturase activity,a recombinant expression vector was constructed. The Δ12-desaturase gene was cloned by RT-PCR technology. The PCR products were ligated into pYES2.0 plasmid. And then the recombinant plasmid(pYMD12)was transformed intoSaccharomycescerevisiaestrain INVSc1 by lithium acetate method. To improve enzymatic activity,built-in promoter of pYES2.0 was replaced by GAP promoter,another new recombinant expression(pYGAPMD12)were constructed inSaccharomycescerevisiaestrain INVSc1. Gas chromatography analysis showed that conversion efficiency of pYGAPMD12 was 69.172% and the conversion efficiency of pYMD12 was 36.401%. This paper was provided important reference for further stay of Δ12-desaturase.

TS201.3

A

1002-0306(2015)21-0196-05

2015-01-12

劉小琳(1987-)，女，碩士，助教，研究方向：微生物學(xué)，E-mail：liuxiaolin19872@163.com。

*通訊作者:黃建忠(1966-)，男，博士，教授，研究方向：微生物學(xué)，E-mail：hjz@fjnu.edu.cn。

福建省發(fā)改委產(chǎn)業(yè)化項(xiàng)目(閩教發(fā)[2010]77號(hào))。

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.032