新疆發(fā)酵駝乳對糖尿病大鼠血清氨基酸代謝的影響

劉健彤,肖雪筠,余 蘭,塔布斯·馬那爾,新華·那比,*

(1.新疆醫(yī)科大學 藥理教研室,新疆軍區(qū)機關(guān)醫(yī)院,新疆烏魯木齊 830011;2.新疆醫(yī)科大學 藥理教研室,新疆烏魯木齊 830011)

新疆發(fā)酵駝乳對糖尿病大鼠血清氨基酸代謝的影響

劉健彤1,肖雪筠2,余 蘭2,塔布斯·馬那爾2,新華·那比2,*

(1.新疆醫(yī)科大學 藥理教研室,新疆軍區(qū)機關(guān)醫(yī)院,新疆烏魯木齊 830011;2.新疆醫(yī)科大學 藥理教研室,新疆烏魯木齊 830011)

目的:利用HPLC法,開展糖尿病血清代謝組學研究新疆發(fā)酵駝乳抗糖尿病作用,并比較駝乳發(fā)酵前后氨基酸含量變化。方法:高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周并注射鏈尿佐菌素30 mg·kg-1建立糖尿病大鼠模型,成模后大鼠隨機分為五組,分別給予發(fā)酵駝乳低、中、高劑量和西格列汀,正常組大鼠給予新鮮駝乳。4周后采用HPLC法測定血清游離氨基酸含量。結(jié)果:與正常組比較,模型組大鼠血清天冬氨酸、苯丙氨酸含量升高,蘇氨酸、酪氨酸含量降低。發(fā)酵駝乳中劑量組可降低天冬氨酸、苯丙氨酸含量,提升甘氨酸、精氨酸含量。發(fā)酵駝乳高劑量組顯著升高血清精氨酸含量。西格列汀組可降低血清天冬氨酸含量,提升甘氨酸、精氨酸、亮氨酸和異亮氨酸含量。結(jié)論:發(fā)酵駝乳中高劑量組可降低糖尿病大鼠血清天冬氨酸、苯丙氨酸含量,增加甘氨酸、精氨酸含量,對糖尿病大鼠血清氨基酸代謝紊亂有一定調(diào)節(jié)作用。

發(fā)酵駝乳,糖尿病大鼠,HPLC,血清氨基酸

糖尿病(diabetes)是一種以高血糖癥為主要特征的代謝性疾病,與胰島素分泌缺乏或其生物功能受損有關(guān)[1]。糖代謝紊亂會影響氨基酸的代謝,氨基酸代謝在糖尿病物質(zhì)代謝中起到的作用日益受到關(guān)注[2]。有學者以糖尿病患者和正常人的尿液為研究對象,分析了糖尿病患者尿液的特征代謝譜,發(fā)現(xiàn)糖尿病患者尿液中的糖、脂、氨基酸等代謝通路都發(fā)生了紊亂[3]。有研究[4]利用血漿代謝譜分析證明了酪氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸等支鏈芳香族氨基酸能夠預測2型糖尿病的風險,其中亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸與2型糖尿病的關(guān)系研究最為廣泛[5]。亮氨酸能夠協(xié)助增加胰島素敏感性、抵抗高脂飼養(yǎng)誘發(fā)的肥胖、降低血糖[6-8];還能夠促進細胞對葡萄糖的攝取利用、使實驗動物血糖降低[9]。進一步測定血漿氨基酸可能有助于確定早期糖尿病的風險因素。氨基酸刺激胰島素分泌的理論也已得到證實,調(diào)節(jié)氨基酸代謝可能對糖尿病治療具有重大意義。

新疆哈薩克民族的飲食主要以肉食為主,攝入動物脂肪較多,但哈薩克族2型糖尿病患病率卻僅為1.56%,這與2型糖尿病的發(fā)病機制相悖。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)新疆發(fā)酵駝乳具有抗炎免疫調(diào)節(jié)作用和降糖作用[10],發(fā)酵乳酪乳清具有抗動脈粥樣硬化作用。糖尿病和動脈粥樣硬化都與慢性炎癥有關(guān),為此,本課題組認為哈薩克族糖尿病發(fā)病率低可能與經(jīng)常食用發(fā)酵乳品有關(guān)。

新疆發(fā)酵駝乳含有多種益生菌,營養(yǎng)價值較高,其中的異亮氨酸、亮氨酸、蘇氨酸等氨基酸的比例均高于雞蛋、牛乳和內(nèi)蒙古駝乳。本研究采用HPLC法分析給予發(fā)酵駝乳后各組大鼠血漿的氨基酸水平,為進一步探討發(fā)酵駝乳防治糖尿病的作用機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鏈尿佐菌素(STZ) sigma公司;檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖液(0.1 mol·L-1);戊巴比妥鈉 德國默克公司;磷酸西格列汀片,規(guī)格:100 mg;無水乙酸鈉 優(yōu)級純,天津市光復化工廠;甲醇和乙腈 色譜純,美國TEDIA公司;Milipore超純水 美國Millipore公司。氨基酸對照品 上海國藥集團化學試劑有限公司,純度均大于98%。

實驗動物采用健康雄性Wistar大鼠 新疆醫(yī)科大學實驗動物中心,生產(chǎn)許可證:SCXK(新)2011-0004;飼養(yǎng)環(huán)境光照12 h/d,室溫21±2 ℃,濕度50%±5%。體重180±20 g;高糖高脂飼料(2.5%膽固醇、0.5%膽酸鈉、10%豬油、20%蔗糖、67%基礎(chǔ)飼料)喂養(yǎng)。

菌株 新疆傳統(tǒng)發(fā)酵駝乳樣品中分離,并由中國農(nóng)業(yè)科學院微生物研究所鑒定;新鮮駝乳 新疆吉木薩爾縣。

Waters e2695高效液相色譜儀 美國Waters公司;Waters 2475熒光檢測器 美國Waters公司;Waters 2487紫外檢測器 美國Waters公司;HSC-12A氮吹儀 天津恒奧科技;SK-1快速混勻器 金壇市醫(yī)藥儀器廠;TDL-5A菲恰爾離心機;MLS-3750高壓滅菌鍋;DK-600A電熱恒溫水浴箱;SANYO CO2孵箱;蘇凈安泰潔凈臺。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理及菌種的活化與擴大培養(yǎng) 取新鮮駝乳,在3000 r/min下離心脫脂20 min,棄去上層脂肪后,在15～20 MPa下均質(zhì)1～2 min,脫脂駝乳于95 ℃下殺菌10 min,后冷卻至37 ℃?zhèn)溆?。將乳酸菌菌種凍干粉溶解于少量滅菌蒸餾水中,用無菌槍頭吸取菌體溶解液置于MRS固體培養(yǎng)基中涂面和劃線,于37 ℃下培養(yǎng)48 h。挑取單個菌株于MRS肉湯液體培養(yǎng)基中,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,活化2～3代。挑取單個酵母菌菌種在沙氏瓊脂培養(yǎng)基中劃線,于37 ℃下培養(yǎng)48～72 h后,挑取單個菌株于麥芽汁液體培養(yǎng)基中,于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,活化2～3代[11]。取上述乳酸菌培養(yǎng)液和酵母菌培養(yǎng)液各5 mL,經(jīng)3000 r/min離心10 min,收集菌體,用0.9%生理鹽水洗滌2次后,混勻制成供試菌懸液,以2%接種量接種于滅菌脫脂駝乳中,分別置于37 ℃和35 ℃培養(yǎng)24 h,制成母發(fā)酵劑后備用。

1.2.2 乳酸菌發(fā)酵劑活力測定及發(fā)酵乳樣品的制備 刃天青還原實驗法:在9 mL脫脂乳中加入1 mL發(fā)酵劑和0.005%刃天青溶液1 mL,在36.7 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)35 min,觀察溶液是否完全褪色[12]。新鮮駝乳由4層無菌紗布過濾2遍,經(jīng)過3000 r/min離心30 min,重復離心3次,脫脂;發(fā)酵所需容器高壓滅菌15 min,溫度121 ℃。脫脂后的駝乳90～95 ℃水浴滅菌15 min,冷卻為40～45 ℃;無菌條件下接種,接種量7%、培養(yǎng)溫度為37 ℃,發(fā)酵時間控制為24 h;發(fā)酵結(jié)束后冷卻并置于4 ℃冰箱中保存20～24 h進行后發(fā)酵。

1.2.3 動物模型制備 取Wistar雄性大鼠80只,體重為(180±20)g,適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d,隨機抽取10只大鼠做正常對照組,喂普通標準大鼠飼料,剩余70只大鼠給予高糖高脂飼料進行造模,自由進水,每周稱體重一次。在第8周末,大鼠禁食不禁水12 h,正常對照組大鼠一次性腹腔注射0.1 mol·L-1pH4.4的檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖液,其余造模組的大鼠一次性腹腔注射STZ30 mg·kg-1。3 d后,禁食12 h,尾尖取血,用精密血糖儀測定空腹血糖(FBG),注射STZ1周、2周,測定FBG(測定前禁食12 h),3次FBG均≥11.1 mmol·L-1作為糖尿病模型大鼠。

1.2.4 實驗動物分組 隨機將成模的60只大鼠分為:模型組、陽性藥西格列汀組(30 mg·kg-1)、發(fā)酵駝乳低劑量(6.97×106乳酸菌+2.2×104酵母菌)CFU·mL-1、中劑量(6.97×107乳酸菌+2.2×105酵母菌)CFU·mL-1、高劑量(6.97×108乳酸菌+2.2×106酵母菌)CFU·mL-1組,取同批正常大鼠作為正常對照組,每天固定時間(10:00～12:00)灌胃給藥,正常組大鼠給予等量蒸餾水,模型組給予滅菌駝乳,灌胃容積為10 mL·kg-1。除正常對照組外,其余5組繼續(xù)喂食高脂高糖飼料,自由飲水,連續(xù)灌胃4周。藥物干預4周后,各組大鼠禁食不禁水12 h,用3%的戊巴比妥鈉溶液30 mg·kg-1腹腔麻醉,開腹,經(jīng)腹主動脈取全血置預冷的含EDTA的采血管,立即離心(10000 r/min,10 min,4 ℃),分離血漿,置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.5 色譜條件 流動相A:有機相:甲醇∶水∶乙腈=20∶20∶60(v∶v∶v)混勻。流速:1.0 mL/min;檢測波長:254 nm;柱溫:35 ℃;進樣量:10 μL,使用前超生脫氣10 min,梯度洗脫程序見表1。流動相B:(水相)緩沖鹽:稱無水乙酸鈉7.4 g加水940 mL,加冰乙酸調(diào)pH約8.0至6.5,然后加70 mL乙腈,混勻,用0.45 μm濾膜過濾。

表1 梯度曲線

1.2.6 對照品溶液制備 準確稱取氨基酸標準品各10 mg,置于25 mL容量瓶中,用0.1 mol/L的HCl稀釋至刻度,搖勻,作為氨基酸貯備溶液,4 ℃冰箱儲存。

1.2.7 供試品溶液制備 血漿樣品在室溫下解凍,精密吸取血漿200 μL,加入400 μL乙腈除蛋白,振搖渦旋后,以12000 r/min離心10 min,取上清液置于2 mL離心管,40 ℃水浴中氮氣吹干,用100 μL水超聲復過濾,取10 μL放入進樣瓶進行衍生,渦旋,水浴15 min(55 ℃)。

1.2.8 測定 按1.2.6項下方法制備供試品溶液并適當稀釋,定性依據(jù)是各組分保留時間,定量分析采用外標法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學考察

線性:以氨基酸峰面積為縱坐標,濃度為橫坐標進行線性回歸,線性相關(guān)系數(shù)(r)為0.9969～0.9998[13];精密度:取供試品溶液,連續(xù)進樣6次,每次10 μL,各樣本的相對峰面積的RSD均小于7%,滿足分析要求;穩(wěn)定性:取供試品溶液,在0、2、4、6、8、12 h進樣,衍生后12 h內(nèi)氨基酸峰面積RSD值在8%以內(nèi),說明衍生化后的樣品至少在12 h內(nèi)比較穩(wěn)定;回收率:回收率由添加的高、中、低三個濃度,本法中氨基酸的回收率RSD值在88.5%～123.4%之間。

2.2 大鼠血清樣品中氨基酸含量測定分析色譜圖

氨基酸標準品分析色譜圖如圖1所示,中劑量駝乳組大鼠血清中氨基酸的色譜圖如圖2所示,均按1.2.5所述色譜條件下測定,氨基酸經(jīng)衍生后,在30 min內(nèi)得到有效分離,各氨基酸之間或血漿中內(nèi)源性物質(zhì)無相互干擾,說明方法專屬性良好,且所對應(yīng)的峰形近似于對稱正態(tài)分布曲線。

圖1 17種混合性氨基酸標準品的色譜圖Fig.1 17 kinds of mixed amino acids standard chromatogram注:1:天門冬氨酸;2:谷氨酸;3:絲氨酸;4:甘氨酸;5:組氨酸;6:精氨酸;7:蘇氨酸;8:丙氨酸;9:脯氨酸;10:酪氨酸;11:纈氨酸;12:甲硫氨酸;13:胱氨酸;14:異亮氨酸;亮氨酸;15:苯丙氨酸;16:賴氨酸。

圖2 中劑量駝乳組大鼠血清中氨基酸的色譜圖Fig.2 Chromatogram of camel milk amino acid in serum of rats注:圖2中1～16同圖1所注。

2.3 HPLC法測定大鼠血清氨基酸

2.3.1 發(fā)酵駝乳對糖尿病大鼠血清中必需氨基酸含量影響 如表2所示,與正常組相較,模型組血清游離苯丙氨酸、蘇氨酸含量有顯著差異(p<0.01)。與模型組相較,中劑量組血清游離苯丙氨酸,西格列汀組亮氨酸和異亮氨酸含量有顯著差異(p<0.05或p<0.01)。這與文獻報道[4]的苯丙氨酸等能預測糖尿病相符,給予駝乳后能降低糖尿病鼠血清的苯丙氨酸含量,說明駝乳能夠調(diào)節(jié)氨基酸代謝水平,對防治糖尿病有重要意義。

表2 發(fā)酵駝乳對糖尿病大鼠血清中必需氨基酸含量影響(均數(shù)±標準差)單位(μg/mL)

注:和正常組相較##p<0.01,和模型組相較*p<0.05,**p<0.01。

表3 發(fā)酵駝乳對糖尿病大鼠血清中非必需氨基酸含量影響(均數(shù)±標準差)單位(μg/mL)

注:和正常組相較##p<0.01,和模型組相較*p<0.05,**p<0.01。

2.3.2 發(fā)酵駝乳對糖尿病大鼠血清中非必需氨基酸含量影響 如表3所示,與正常組相較,模型組血清游離天冬氨酸含量顯著升高。與模型組相較,中劑量組血清游離精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸含量有顯著差異(p<0.05或p<0.01)。高劑量組血清游離精氨酸含量顯著升高(p<0.05)。西格列汀組血清游離甘氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸含量有顯著差異(p<0.05或p<0.01)。在葡萄糖刺激胰島素分泌的特異性缺乏的同時,精氨酸促胰島素分泌作用也會顯著降低,甘氨酸能夠促進組織對葡萄糖的利用,有降血糖的潛能,而服用過發(fā)酵駝乳的糖尿病大鼠精氨酸和甘氨酸含量顯著升高,近似于陽性藥西格列汀,為駝乳用于防治糖尿病提供了依據(jù)。

2.3.3 發(fā)酵駝乳對糖尿病大鼠血清中半必需氨基酸含量影響 如表4所示,與正常組相較,模型組血清游離酪氨酸含量顯著降低(p<0.01)。與模型組相較,其他組血清游離氨基酸含量變化沒有統(tǒng)計學意義。

表4 發(fā)酵駝乳對糖尿病大鼠血清中半必需氨基酸含量影響(均數(shù)±標準差)單位(μg/mL)

注:##p<0.01。

3 結(jié)論

實驗結(jié)果顯示糖尿病大鼠血清氨基酸代謝發(fā)生了顯著變化,而發(fā)酵駝乳對糖尿病大鼠血清氨基酸代謝紊亂有一定的調(diào)節(jié)作用。支鏈芳香族氨基酸(亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸),特別是三種支鏈氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸),確實與2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展有著密不可分的聯(lián)系,苯丙氨酸與酪氨酸能合成重要的神經(jīng)遞質(zhì)與激素,這種合成物能夠參與到機體的糖和脂肪代謝中。亮氨酸是是唯一可以在無葡萄糖和其他氨基酸存在的條件下直接促進胰島素釋放的氨基酸,異亮氨酸通過調(diào)節(jié)糖和能量的水平來促進骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取與利用,達到降低血糖的目的。這些氨基酸的變化可能承載著糖尿病代謝途徑變化的重要信息。有研究表明[14]誘導胰島細胞一氧化氮合酶,抑制胰島素分泌,是導致糖尿病病人胰腺β細胞的功能障礙和破壞的原因。精氨酸被認為是首選的β-cell功能評估指標[15],其能夠明顯抑制組織山梨醇的積累、ROS生成處理和PKC激活這三個關(guān)鍵的導致異常高血糖的生化指標。通過氨基的三羧酸循環(huán),能夠?qū)被?、葡萄糖和脂質(zhì)代謝聯(lián)系在一起。如果機體糖代謝紊亂必然會導致氨基酸的代謝紊亂,而氨基酸代謝紊亂同樣會造成糖代謝的紊亂。服用新疆發(fā)酵駝乳能夠調(diào)節(jié)氨基酸代謝紊亂,可能是其具有降糖作用的機制之一。

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Effect of Xinjiang fermented camel milk on serum amino acid metabolism in diabetic rats

LIU Jian-tong1,XIAO Xue-jun2,YU Lan2,Tabusi·Manaer2,Xinhua·Nabi2,*

(1.Xinjiang Medical University,Pharmacology department,Xinjiang Military Area Command Hospital,Urumqi 830011,China;2.Xinjiang Medical University,Pharmacology department,Urumqi 830011,China)

Objective:Using HPLC to study the serum metabolites of antidiabetic diabetes effect of Xinjiang fermented camel milk,and compared the change of the amino acid content of fresh and fermented camel milk. Methods:high sugar and high fat feed eight weeks and injected STZ with 30 mg·kg-1to establish the model of diabetic rats,then the rats were randomly divided into five groups,they were given fermented camel milk low,medium and high dose and Sitagliptin,normal group rats given fresh camel milk. After four weeks of treatment,HPLC to determinate the content of serum free amino acid. Results:Compared with the normal group,model group rats serum aspartic acid,increase the content of phenylalanine,threonine and tyrosine content reduced. Fermented camel milk in middle dose group can reduce the content of aspartic acid,phenylalanine,glycine,arginine content increased. Fermented camel milk in high dose group significantly increased serum levels of arginine. Sitagliptin group can reduce the serum aspartic acid content increased,glycine,arginine,leucine and isoleucine content.Conclusion:fermented camel milk middle and high dose group can decrease the content of diabetes rats serum aspartate and phenylalanine,increase the content of glycine and arginine,adjust the serum amino acid metabolic disorder of diabetes rats.

fermented camel milk;diabetes rat;HPLC;serum amino acid

2015-04-09

劉健彤(1987-),女,碩士,研究方向:心血管藥理,E-mail:liujiantong0708@163.com。

*通訊作者:新華·那比(1967-),女,博士,教授,研究方向:心血管藥理,E-mail:xinhua99@hotmail.com。

國家自然科學基金(81160344)。

TS201.4

A

1002-0306(2015)23-0339-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.062