三聚氰胺偶聯(lián)抗原制備及其免疫原性分析

趙彭花,張海祥,+,李 濤,王 鑫,宋 衛(wèi),劉海靜,謝 毅,霍雪萍,趙向絨,梁導(dǎo)艷,李 元,*,胡 軍,*

(1.陜西省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,陜西西安 710068;2.陜西省食品藥品檢驗(yàn)所,陜西西安 710065;3.西安華澳麗康生物工程有限公司,陜西西安 710061)

三聚氰胺偶聯(lián)抗原制備及其免疫原性分析

趙彭花1,張海祥1,+,李 濤2,王 鑫1,宋 衛(wèi)3,劉海靜2,謝 毅1,霍雪萍1,趙向絨1,梁導(dǎo)艷1,李 元1,*,胡 軍1,*

(1.陜西省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,陜西西安 710068;2.陜西省食品藥品檢驗(yàn)所,陜西西安 710065;3.西安華澳麗康生物工程有限公司,陜西西安 710061)

探討以2-氯-4,6-二胺-1,3,5-三嗪(CAAT)作為起始物,與6-氨基己酸(ACS)連接轉(zhuǎn)化得到半抗原Mel-ACS,再將其與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)形成具有連接手臂的抗原BSA-ACS-Mel,用于單克隆抗體(mAb)制備。經(jīng)過液相色譜、Western blot及ELISA等抗原特性分析,證明半抗原Mel-ACS的轉(zhuǎn)化效率達(dá)到了85.9%,且針對(duì)Mel特異性單抗獲得率達(dá)到了42.9%,抗原BSA-ACS-Mel免疫原性較好,完全可以適用于三聚氰胺分子的特異性檢測(cè)需要。這對(duì)其余小分子抗原的合成也起到一定的指導(dǎo)作用。

三聚氰胺,抗原,單克隆抗體,免疫原性

三聚氰胺(Melamine,Mel),俗稱密胺、蛋白精,IUPAC命名為“1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺”,分子式C3N6H6,是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物,它是一種用途廣泛的基本有機(jī)化工中間產(chǎn)品[1]。由于三聚氰胺分子中含有大量氮元素,而常規(guī)的“凱氏定氮法”檢測(cè)食品或飼料中蛋白質(zhì)含量時(shí)都是通過檢測(cè)蛋白里面的氮來推算蛋白質(zhì)含量,不能排除這類“偽蛋白氮”的干擾,因而被一些不法分子利用,以提高其產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)含量。2008年10月,我國(guó)制定了乳品中三聚氰胺管理限量值,嬰幼兒配方乳粉中三聚氰胺的限量值為1mg/kg;含乳15%以上的其它食品中三聚氰胺的限量值為2.5mg/kg[2]。

目前三聚氰胺檢測(cè)主要是以氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法為主[3-5],這些檢測(cè)方法所需設(shè)備價(jià)格昂貴,儀器操作復(fù)雜,檢測(cè)人員需受過專業(yè)訓(xùn)練,而且存在適用范圍和使用成本等限制,所以研制特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便的三聚氰胺檢測(cè)方法是十分必要的。以單克隆抗體為基礎(chǔ)的快速免疫檢測(cè)技術(shù)具有快速便捷、特異性強(qiáng)、敏感性高等顯著優(yōu)點(diǎn)[6-7],能夠較好的滿足對(duì)三聚氰胺的快速檢測(cè)需要,是目前三聚氰胺檢測(cè)技術(shù)研究的熱點(diǎn)。但是由于三聚氰胺本身分子量較小(MW:126.12),不具免疫原性,無法制備單克隆抗體[8],限制了快速免疫檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用。有文獻(xiàn)[9]報(bào)道,載體蛋白偶聯(lián)帶有6個(gè)碳連接手臂的三聚氰胺抗原有利于減少抗原抗體識(shí)別時(shí)空間位阻作用,更適合做免疫原,但其免疫原性如何,是否可以刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體？尚未見報(bào)道。

因此,在前期相關(guān)研究基礎(chǔ)上,本文對(duì)三聚氰胺抗原的制備方法進(jìn)行優(yōu)化,在偶聯(lián)載體與三聚氰胺分子之間加入連接手臂,分析其免疫原性。這不僅對(duì)獲得特異的三聚氰胺單抗有重要意義,而且對(duì)其它的小分子抗原的制備提供參考思路,具有較高的實(shí)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品 日本和光純藥業(yè)株式會(huì)社;2-氯-4,6-二胺-1,3,5-三嗪(CAAT)、2-羧酸-4,6-二胺-1,3,5-三嗪、6-氨基己酸(ACS)、氯金酸、檸檬酸三鈉、三聚氰胺單抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠多抗、牛血清白蛋白(BSA)單抗 Sigma公司;BSA Roche公司;鼠源單克隆抗體亞型檢測(cè)試劑盒,Imject Immunogen EDC Kit with mcKLH and BSA試劑盒 美國(guó)Pierce；其余化學(xué)試劑 國(guó)藥集團(tuán),分析純。

Epoch酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司,NanoDrop 2000c蛋白濃度測(cè)定儀 美國(guó)Thermo公司;HP1200高效液相儀 美國(guó)Aglient公司;Quattro Premier質(zhì)譜 日本W(wǎng)aters公司;DF-1集熱式磁力攪拌器 常州國(guó)華電器有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;電泳儀 北京市六一儀器廠;752N紫外可見分光光度計(jì) 上海精科儀器有限公司;WRS-5A熔點(diǎn)儀 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 三聚氰胺偶聯(lián)抗原的制備

1.2.1.1 制備無連接手臂的三聚氰胺偶聯(lián)抗原(BSA-Mel) 使用Imject Immunogen EDC Kit with mcKLH and BSA試劑盒,連接方法詳見說明書。將2mg的BSA加入200μL的試劑盒連接緩沖液,將1mg EDC溶入超純水100μL中,混勻,室溫反應(yīng)1h,加0.35mg的三聚氰胺,4℃攪拌,過夜。然后用10mmol/L,pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)透析除去未反應(yīng)游離小分子。具體連接過程如圖1所示。

圖1 無連接手臂三聚氰胺偶聯(lián)抗原(BSA-Mel)合成示意圖Fig.1 Synthesis route of melamine conjugate antigen(BSA-Mel)

三聚氰胺等小分子化學(xué)物質(zhì),一般只有反應(yīng)原性,沒有免疫原性,無法作為抗原直接免疫動(dòng)物制備單抗。所以,必須將其連接到一些大分子載體蛋白上,形成偶聯(lián)物-半抗原,借助大分子T細(xì)胞表位間接誘導(dǎo)B細(xì)胞激活、分化增殖,產(chǎn)生針對(duì)半抗原的特異性抗體[10-11]。而載體蛋白除應(yīng)具有較好的免疫原性外,還應(yīng)具有足夠的能反應(yīng)的側(cè)鏈活性基團(tuán),以便與抗原連接。相比于卵清蛋白(OVA)每個(gè)分子上平均含有20個(gè)氨基基團(tuán),鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)每個(gè)分子上平均含有6.9個(gè)氨基基團(tuán),一個(gè)BSA分子上平均含有多達(dá)59個(gè)氨基基團(tuán)[12],因此實(shí)驗(yàn)中選擇BSA為抗原的載體蛋白。

為了比較不同的偶聯(lián)方式轉(zhuǎn)化形成抗原的免疫原性,以常見的三聚氰胺直接與BSA偶聯(lián)的方式合成抗原。由于Mel與BSA在堿性有機(jī)溶劑中反應(yīng)時(shí)會(huì)導(dǎo)致BSA變性,因此選用較溫和的半抗原連接試劑盒,直接將Mel與BSA轉(zhuǎn)化連接得到BSA-Mel。

1.2.1.2 制備帶連接手臂的三聚氰胺抗原(BSA-ACS-Mel) 參考文獻(xiàn)[6]合成三聚氰胺與BSA之間帶有6個(gè)碳連接手臂的目標(biāo)抗原,具體的合成路線如圖2所示。

連接轉(zhuǎn)化三聚氰胺半抗原(Mel-ACS):分別稱取CAAT 0.5g(3.4mmol)和ACS 0.5g(3.8mmol),溶于體積濃度為75%的乙醇溶液,加入縛酸劑,80℃回流滴加24h。用薄層層析法檢測(cè)反應(yīng)進(jìn)度,展開液組成及體積比例(乙酸乙酯∶甲醇∶甲酸=8∶2∶1),紫外燈顯色檢測(cè),半抗原及前體的最大紫外吸收波長(zhǎng)為241nm。將反應(yīng)產(chǎn)物放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸干,滴加質(zhì)量濃度為10%的檸檬酸水溶液,調(diào)節(jié)酸堿度至pH2～3。過濾后,濾液減壓濃縮蒸干,即為目標(biāo)產(chǎn)物(Mel-ACS)。為比較不同縛酸劑的作用效果,反應(yīng)過程中分別等摩爾(即均以金屬陽(yáng)離子四倍于ACS的量)加入NaOH 0.61g(15.2mmol)、KOH 0.85g(15.2mmol)、Na2CO30.81g(7.6mmol)、NaHCO31.29g(15.2mmol)和K2CO31.05g(7.6mmol)進(jìn)行比較。

活化三聚氰胺半抗原:稱取Mel-ACS 20mg置于反應(yīng)瓶中,依次加入N-羥基丁二酰亞胺(NHS)17mg(0.148mmol)和1mL二甲基甲酰胺(DMF),攪拌溶解,然后加入N,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)31mg(0.15mmol),于4℃攪拌過夜,離心除去白色沉淀,得到上清液。

合成三聚氰胺偶聯(lián)抗原(BSA-ACS-Mel):在上清溶液中滴加溶有113mg BSA的PBS緩沖液(10mmol/L,pH7.4)8mL。混合物4℃攪拌過夜,最后用PBS透析,除去小分子雜質(zhì)。

圖2 帶手臂三聚氰胺偶聯(lián)抗原(BSA-ACS-Mel)合成示意圖Fig.2 Synthesis route of melamine conjugate antigen(BSA-ACS-Mel)

由于三聚氰胺的分子結(jié)構(gòu)高度對(duì)稱,三個(gè)氨基之間活性相同,反應(yīng)活化過程難以控制,因此,選用結(jié)構(gòu)與之接近但化學(xué)性質(zhì)較活潑的氯代物CAAT作為反應(yīng)起始物。通過CAAT活潑的氯與6個(gè)碳連接手臂ACS的氨基反應(yīng),連接形成Mel-ACS,然后活化ACS端的羧基端,在比較溫和的條件下將Mel-ACS與BSA連接。

1.2.2 三聚氰胺偶聯(lián)抗原的性質(zhì)鑒定

1.2.2.1 三聚氰胺半抗原(Mel-ACS)的質(zhì)譜表征 按1.2.1.2的方法,將所得純化目標(biāo)物進(jìn)行質(zhì)譜表征,質(zhì)譜儀的工作條件為:N2激光337nm,4次/秒脈沖,加速電壓20kV,真空度5×10-8mbar,真空管長(zhǎng)度為1.5m,線性模式下操作,所得數(shù)據(jù)用Bruket XMASS軟件分析。

1.2.2.2 三聚氰胺半抗原的色譜測(cè)定 按1.2.1.2的方法,將所得的目標(biāo)產(chǎn)物及反應(yīng)前加入的CAAT、ACS進(jìn)行色譜分析,二極管陣列檢測(cè)器波長(zhǎng)215nm條件下HP1200高效液相色譜儀檢測(cè)。

1.2.2.3 CAAT轉(zhuǎn)化半抗原效率測(cè)定 將1.2.1.2合成三聚氰胺半抗原(Mel-ACS)中所得的白色固體稱重,熔點(diǎn)儀測(cè)熔點(diǎn),并計(jì)算半抗原Mel-ACS的轉(zhuǎn)化效率。

Mel-ACS的轉(zhuǎn)化率(%)

1.2.2.4 三聚氰胺偶聯(lián)抗原反應(yīng)原性鑒定 ELISA法鑒定三聚氰胺偶聯(lián)抗原:包被BSA-Mel、BSA-ACS-Mel及BSA,用最佳稀釋濃度的特異三聚氰胺單抗為一抗,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠多抗為二抗,四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色。

Western blot鑒定三聚氰胺偶聯(lián)抗原:BSA-Mel、BSA-ACS-Mel及BSA進(jìn)行電泳,特異三聚氰胺單抗作一抗,辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠多抗作二抗,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。

1.2.3 三聚氰胺偶聯(lián)抗原的免疫原性分析

1.2.3.1 三聚氰胺單克隆抗體的制備 用合成的三聚氰胺抗原分別免疫Balb/C小鼠,3次免疫后,取其脾細(xì)胞與Sp2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,用ELISA法篩選分泌抗體的陽(yáng)性細(xì)胞,用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆,經(jīng)過3次克隆后,建立穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞系,凍存。復(fù)蘇細(xì)胞,擴(kuò)大培養(yǎng),收集細(xì)胞培養(yǎng)上清[13]。

1.2.3.2 三聚氰胺單克隆抗體生物學(xué)特性鑒定 抗體類別鑒定:采用SBA ClonotypingTMSystem/HRP 抗體類型和亞類鑒定試劑盒,利用ELISA雙抗夾心法鑒定小鼠B淋巴細(xì)胞雜交瘤培養(yǎng)上清中單克隆抗體的類別。采用羊抗鼠抗體包被微孔板,與加入的培養(yǎng)上清中的小鼠抗體結(jié)合,再加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗小鼠抗體分別反應(yīng),最后用TMB底物系統(tǒng)顯色并用稀硫酸終止,通過酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度判斷被測(cè)單克隆抗體的類別。

1.2.3.3 單克隆抗體反應(yīng)性鑒定 包被BSA-Mel及BSA-ACS-Mel抗原于聚苯乙烯酶標(biāo)板,分別加入免疫制得的細(xì)胞培養(yǎng)上清孵育;以辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠多克隆抗體為二抗,TMB底物顯色;2M的硫酸水溶液終止,酶標(biāo)儀A450nm檢測(cè)。

1.2.3.4 單克隆抗體的特異性鑒定 采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA法,選取反應(yīng)性強(qiáng)的單克隆抗體,以間接ELISA測(cè)得A450nm在1.0左右的稀釋度作為工作濃度。將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋,酶標(biāo)板用4μg/mL的Mel-ACS-BSA包被,質(zhì)量濃度為2%的PBS溶液封閉后,加入不同濃度的競(jìng)爭(zhēng)三聚氰胺溶液50μL和稀釋為工作濃度的三聚氰胺單抗50μL,混勻后,37℃孵育1h。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照,依據(jù)A450nm的變化判斷是否發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 合成三聚氰胺半抗原(Mel-ACS)的條件優(yōu)化

在合成半抗原(Mel-ACS)的過程中,參考文獻(xiàn)[9],通過加入不同的縛酸劑NaOH、KOH、Na2CO3、NaHCO3和K2CO3進(jìn)行比較,結(jié)果只有K2CO3的催化效果最佳,轉(zhuǎn)化率達(dá)85.9%(見表1)。

在轉(zhuǎn)化連接帶手臂的半抗原時(shí),對(duì)Mel與ACS的反應(yīng)過程中加入等摩爾的縛酸劑,能吸收反應(yīng)中產(chǎn)生的酸,避免影響反應(yīng)或反應(yīng)平衡。各組分經(jīng)過熔點(diǎn)定性、色譜純度等分析比較,使用K2CO3的催化性能明顯好于NaOH、KOH、Na2CO3和NaHCO3,生成產(chǎn)物Mel-ACS的轉(zhuǎn)化連接效率高于其他縛酸劑的效率,達(dá)到了85.9%,為文獻(xiàn)[9]報(bào)導(dǎo)6.6%的十幾倍?？赡苁怯捎贙2CO3堿性相對(duì)較弱,在反應(yīng)體系中向副產(chǎn)物提供未共用電子對(duì)的能力也較弱,反應(yīng)的副產(chǎn)物少,CAAT轉(zhuǎn)化成Mel-ACS的反應(yīng)效率較高。

2.2 三聚氰胺半抗原的鑒定

2.2.1 Mel-ACS高效液相色譜圖 對(duì)于轉(zhuǎn)化Mel-ACS前所用的原料CAAT(溶于DMF)、ACS(溶于水)以及轉(zhuǎn)化后的Mel-ACS(溶于水)在二極管陣列檢測(cè)器波長(zhǎng)215nm條件下用HP1200高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè),其色譜如圖3所示。

表1 不同縛酸劑對(duì)三聚氰胺半抗原合成的影響Table 1 Effect of different acid binding agents for the synthesis of melamine haptens

圖3 三聚氰胺半抗原色譜圖Fig.3 Chromatogram of melamine haptens注：A:CAAT;B:ACS;C:Mel-ACS純化前；D:Mel-ACS純化后。

由 CAAT、ACS及純化前的Mel-ACS色譜圖對(duì)比,可以看出純化前的Mel-ACS有別于CAAT(3.15min)和ACS,有新峰(4.28min)生成,對(duì)該峰進(jìn)行純化得到純化后的Mel-ACS,見圖3D,產(chǎn)物進(jìn)一步做質(zhì)譜分析。

2.2.2 Mel-ACS質(zhì)譜圖 對(duì)純化后的Mel-ACS的主峰進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)分析,其結(jié)果如圖4所示。

圖4 三聚氰胺半抗原質(zhì)譜圖Fig.4 Mass spectrometry of melamine haptens

半抗原Mel-ACS的分子式為C9H16N2O2,分子量為240.26,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物Mel-ACS經(jīng)質(zhì)譜鑒定,質(zhì)譜圖有一峰值240.26,說明連接轉(zhuǎn)化是成功的。

2.3 三聚氰胺抗原反應(yīng)原性的鑒定

使用三聚氰胺特異性單抗、BSA單抗及作為對(duì)照的PBS分別與包被的BSA-ACS-Mel、Mel-BSA及BSA進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn),辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠作為二抗反應(yīng),TMB顯色;結(jié)果只有BSA-ACS-Mel抗原與三聚氰胺特異性結(jié)合,如表2所示。

表2 三聚氰胺偶聯(lián)抗原反應(yīng)性比較Table 2 Comparison of melamine conjugate antigens reactivity

注:“-”陰性;“+”陽(yáng)性。

同時(shí),對(duì)BSA-ACS-Mel、BSA -Mel、BSA進(jìn)行電泳,特異性三聚氰胺單抗為一抗,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠多抗為二抗,DAB顯色,做Western blot,結(jié)果如圖5所示。

圖5 三聚氰胺偶聯(lián)抗原Western blot鑒定示意圖Fig.5 Identification of melamine conjugate antigen by Western blot注:Marker中70ku位置條帶為BSA,在2,3泳道相同位置均有顯色條帶,泳道4則無顯色。

在偶聯(lián)BSA后,由于抗原分子量太大,質(zhì)譜、色譜等檢測(cè)方法已不適用,因此主要采用ELISA、Western blot等生物學(xué)方法測(cè)定。從Western blot電泳圖可以看出,泳道2和3特異的三聚氰胺抗體對(duì)兩種三聚氰胺偶聯(lián)抗原均有顯色,而與泳道4的BSA不反應(yīng),說明特異的三聚氰胺單抗可以識(shí)別偶聯(lián)抗原并與其反應(yīng)顯色,證明三聚氰胺已偶聯(lián)到BSA上;泳道2反應(yīng)明顯強(qiáng)于泳道3,表明帶手臂的偶聯(lián)抗原反應(yīng)原性更強(qiáng)。而將兩種抗原均包被ELISA板,用特異三聚氰胺單抗做一抗,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠多克隆抗體為二抗,TMB染色,結(jié)果只有帶連接手臂的偶聯(lián)抗原與特異三聚氰胺單抗結(jié)合顯色,無連接手臂的偶聯(lián)抗原不與特異三聚氰胺單抗結(jié)合顯色。進(jìn)一步表明帶連接手臂的三聚氰胺偶聯(lián)抗原可能由于手臂的托舉提呈作用,Mel分子顯現(xiàn)出來,因此具有更好的反應(yīng)原性。

2.4 三聚氰胺免疫原性的鑒定

使用兩種三聚氰胺偶聯(lián)抗原免疫小鼠,用各自的免疫抗原篩選,分別制備得到14株和34株單抗,經(jīng)三聚氰胺阻斷鑒定,BSA-ACS-Mel抗原免疫所獲得的單克隆抗體中有6株具有較好的反應(yīng)特異性,占總數(shù)的42.9%,免疫原性較強(qiáng)。而BSA-Mel抗原免疫所獲得的單克隆抗體則未能篩選出特異性的三聚氰胺單抗。以兩種不同抗原免疫得到的單克隆抗體亞類數(shù)量及其用三聚氰胺阻斷實(shí)驗(yàn)的測(cè)定結(jié)果如表3所示:

表3 三聚氰胺偶聯(lián)抗原免疫原性對(duì)比Table 3 Comparison on immunity of melamine conjugates antigens

經(jīng)過動(dòng)物體內(nèi)免疫,帶連接手臂的抗原得到了14株單抗,其中6株三聚氰胺單抗具有特異性,而無連接手臂的抗原得到34株單抗,但經(jīng)阻斷實(shí)驗(yàn)證明均不具有特異性。說明無連接手臂的偶聯(lián)抗原免疫原性弱,很難獲得針對(duì)三聚氰胺的特異性單抗。而帶連接手臂的三聚氰胺抗原,由于手臂有利于減少抗原抗體識(shí)別時(shí)的空間位阻作用,能將三聚氰胺分子提呈到整個(gè)抗原分子的表面,因而具有較好的免疫原性,更適合做為免疫原。

3 結(jié)論

通過改進(jìn)抗原制備方法得到帶手臂的三聚氰胺抗原,免疫動(dòng)物后獲得特異性單克隆抗體,經(jīng)ELISA、Western blot等方法進(jìn)行免疫原性分析,證明該方法具有轉(zhuǎn)化效率高(轉(zhuǎn)化率85.9%),偶聯(lián)抗原的反應(yīng)原性及免疫原性(特異性單抗獲得率42.9%)均較好等優(yōu)點(diǎn),可以用于三聚氰胺的快速免疫檢測(cè)等方面,并對(duì)其它小分子抗原的合成和鑒定提供參考。

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Preparation and immunogenicity analysis of melamine conjugate antigen

ZHAO Peng-hua1,ZHANG Hai-xiang1,+,LI Tao2,WANG Xin1,SONG Wei3,LIU Hai-jing2,XIE Yi1,HUO Xue-ping1,ZHAO Xiang-rong1,LIANG Dao-yan1,LI Yuan1,*,HU Jun1,*

(1.Center Laboratory,Shaanxi Provincial People’s Hospital,Xi’an 710068,China;2.Shaanxi Institute for Food and Drug Control,Xi’an 710065,China;3.Xi’an Huaaolikang Biology Engineer Co.,Ltd.,Xi’an 710061,China)

The starting material 2- chloro-4,6- diamine-1,3,5- triazine(CAAT)reacted with 6- aminocaproic acid(ACS)to create a hapten Mel-ACS,then this hapten was conjugated with bovine serum albumin(BSA)to form BSA-ACS-Mel,which was supposed to have a connection arm and would be used as an antigen for the preparation of monoclonal antibody(mAb). Antigenic characteristics analysis by HPLC,Western blot and ELISA proved that the yield of hapten Mel-ACS reached 85.9% and specific monoclonal antibodies against Mel reached 42.9%. The antigen BSA-ACS-Mel had good immunogenicity and can be applied to detect melamine molecule specifically. This method played a guiding role in the synthesis of other small molecule antigens.

melamine;antigen;monoclonal antibody;immunogenicity

2014-09-04 +并列第一作者。

趙彭花(1984- )，女，碩士，助理研究員，研究方向:生物化學(xué)合成及應(yīng)用。 張海祥(1975-)，男，碩士，高級(jí)工程師，研究方向:生物技術(shù)。

*通訊作者:李元(1960-)，男，博士，教授,研究方向:微生物學(xué)。 胡軍(1962-)，男，博士，研究員, 研究方向:免疫學(xué)。

陜西省食品藥品快速檢測(cè)公共服務(wù)平臺(tái)建設(shè)項(xiàng)目(2014FWPT-01)；陜西省科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2014K12-05)。

TS207.3

A

1002-0306(2015)13-0329-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.060