基于核酸適體微球的沙門氏菌檢測方法研究

金 娜,孔先利,林 敏,左 鵬

(1.溫州出入境檢驗檢疫局,浙江溫州 325000;2.臺州出入境檢驗檢疫局,浙江臺州 318000;3.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室,上海 200237)

基于核酸適體微球的沙門氏菌檢測方法研究

金 娜1,孔先利2,林 敏1,左 鵬3

(1.溫州出入境檢驗檢疫局,浙江溫州 325000;2.臺州出入境檢驗檢疫局,浙江臺州 318000;3.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室,上海 200237)

目的:研究基于核酸適體的微球芯片系統(tǒng)應(yīng)用于沙門氏菌檢測的可行性。方法:采用偶聯(lián)有沙門氏菌適體的微球作為載體,以熒光作為檢測信號建立微球芯片體系,并優(yōu)化影響檢測結(jié)果的各項因素。結(jié)果:通過此方法檢測20份水產(chǎn)樣品,6份檢出沙門氏菌,檢出率為30%。結(jié)論:建立的檢測體系能實現(xiàn)對沙門氏菌的快速,準確的檢測,且具有較高的特異性。

沙門氏菌,適體,微球,檢測

沙門氏菌(Salmonella)是重要的腸道致病菌,根據(jù)抗原成分的不同分成2000多個血清型,我國已發(fā)現(xiàn)的血清型有216個[1]。沙門氏菌在港灣環(huán)境里可繁殖和生活數(shù)周,魚類和貝類由于生活在污水中而遭受沙門氏菌污染[2-4]。人類由于食用了生鮮或未經(jīng)徹底加熱的水產(chǎn)品而導(dǎo)致食物中毒,臨床表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹瀉、發(fā)熱、頭痛,嚴重時引起胃腸炎、敗血癥和其它炎癥,甚至危及生命。世界各國均對水產(chǎn)品中沙門氏菌的污染狀況非常重視,將其列為水產(chǎn)品中不得檢出的致病菌并進行嚴格的檢測和監(jiān)控。我國對水產(chǎn)品的致病菌檢測中,沙門氏菌被定為必檢項目。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示,水產(chǎn)品沙門氏菌的檢出率約為20%[5]。

目前沙門氏菌的主要檢測方法有國標法、ELISA[6-7]、免疫磁珠法[8-10]、PCR[11-13]等。傳統(tǒng)檢測方法包括前增菌、增菌、生化鑒定,以及血清學(xué)鑒定等,不僅耗時長,也易發(fā)生漏檢;ELISA由于抗原抗體的交叉反應(yīng),靈敏度低,很難對致病菌進行準確的檢定,容易造成漏檢,同時抗體的生產(chǎn)、保存以及抗體效價也受到一定條件的限制,這也在一定程度上限制了ELISA方法的應(yīng)用;PCR技術(shù)以其敏感性、特異性、簡單快速的優(yōu)點,已廣泛應(yīng)用,但PCR往往需要昂貴的儀器,同時容易非特異性擴增導(dǎo)致假陰性(假陽性);而核酸適體(aptamer)的出現(xiàn)為傳統(tǒng)免疫傳感器的發(fā)展開辟了一條新的道路。由于核酸適體的高親和力、高特異性、易合成和標記、易儲存且成本低等優(yōu)點,現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于各類目標物質(zhì)的富集和檢測[14-17],本研究主要以納米微球為載體,利用沙門氏菌與相應(yīng)適體的特異性結(jié)合能力,從而達到對沙門氏菌的檢測。

表1 本實驗中使用的沙門氏菌適體[14]和寡核苷酸序列Table 1 Sequence of salmonella aptamer and oligonucleotides used

注:Ap為氨基修飾的沙門氏菌適體;Cy5-Ap為熒光修飾的沙門氏菌適體;Target A為與沙門氏菌適體等堿基數(shù)的經(jīng)氨基修飾的任意寡核苷酸。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙門氏菌ATCC15611、副溶血性弧菌ATCC17802、志賀氏菌ATCC29930、金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希氏菌ATCC25922,以及李斯特菌CICC21633 均由溫州出入境檢驗檢疫局微生物實驗室菌種中心提供；玻璃微珠(平均直徑250μm,密度:2.05g/mL) 購自sigma-aldrich公司；實驗所需各種致病菌的培養(yǎng)基以及配套試劑 均由北京陸橋技術(shù)有限責任公司提供；其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純 購自溫州金山化學(xué)試劑公司;寡核苷酸探針和引物 均為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成,并經(jīng)反向高壓液相層析純化。

Gene pix 4000B掃描儀 帶分析軟件GenePix Pro 3.0,美國AXON instruments;全自動微生物鑒定及藥物敏感實驗分析系統(tǒng) VITEK32,法國梅里埃公司;微量核酸定量儀 ND-1000 Spectrophotometer,美國thermo fisher公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 納米微球制作方法

1.2.1.1 玻璃微珠的酸洗(微珠表面羥基活化)500mg未經(jīng)處理的玻璃微珠浸入1mL 6mol/L HCl溶液中,室溫振蕩反應(yīng)過夜,多遍水洗至中性,110℃ 真空干燥2h。

1.2.1.2 玻璃微珠的硅烷化 將酸洗玻璃微珠浸入2% 3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)的無水甲苯溶液,室溫下振蕩反應(yīng)5h,用無水甲苯溶液清洗5次,每次3min;110℃真空干燥至少3h。硅烷化反應(yīng)后的微珠直接置于室溫下保存。

1.2.2 活性基團的偶聯(lián) 在用APTMS硅烷化試劑反應(yīng)得到氨基硅烷珠后,本文用1,4-苯二異硫氰酸酯(PDITC)偶聯(lián)得到異硫氰酸化珠NCS-Beads。

異硫氰酸化珠NCS-Beads的制備：10mg硅烷化處理的玻璃微珠浸泡在500μL 0.2% PDITC/10%吡啶的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中,37℃振蕩反應(yīng)2h,DMF洗5遍,無水乙醇洗3遍,二氯甲烷洗3遍,室溫真空干燥。

1.2.3 沙門氏菌適體(Ap)在微珠上的固定 2mg異硫氰酸化珠NCS-Beads置于5μmol/L NH2-Ap的0.05mol/L硼酸鈉緩沖液(pH8.5)20μL,37℃振蕩避光反應(yīng)過夜,用去離子水洗5次,常溫真空干燥。

1.2.4 適體與沙門氏菌在NCS-Beads反應(yīng)條件的優(yōu)化 將S.enterica標準菌株用營養(yǎng)肉湯活化(37℃,24h),劃線接種于DHL和BS平板,單菌落以血平板純化后,進行VITEK鑒定,同時挑取血平板純菌落溶于結(jié)合緩沖液(50mmol/L Tris-HCl,5mmol/L KCl,100mmol/L NaCl,1.0mmol/L MgCl2pH7.4),制得目標菌懸液濃度,加入NCS-Beads-NH2-Ap,室溫反應(yīng)10min后,吸取上清液后,以結(jié)合緩沖液清洗三次后,加入20μL 5μmol/L Cy5標記適體(Cy5-Ap),室溫反應(yīng)10min后,吸取上清液后,以結(jié)合緩沖液清洗三次,常溫真空干燥。將微珠進行掃描。

1.2.4.1 反應(yīng)時間對沙門氏菌適體固定量的研究 按照1.2.3.1反應(yīng)過程,選取了8個時間點(4、8、12、18、24、30、36、48、60h)作為研究,觀察適體固定量的變化。

1.2.4.2 特異性研究 適體與S.enterica特異性研究:實驗選取了金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌、志賀氏菌和李斯特菌作為對照菌株與沙門氏菌適體進行特異性反應(yīng)。各菌種標準菌株經(jīng)肉湯活化后接種選擇性培養(yǎng)基并純化后,制得菌懸液。

S.enterica與寡核苷酸DNA特異性研究:實驗選取了一段堿基數(shù)量與適體相同的寡核苷酸序列(Target A),與沙門氏菌進行特異性反應(yīng)。取適量(2mg)的異硫氰酸化微珠溶于20μL 0.05mmol/L硼酸鈉(pH8.5)緩沖液后加入20μL 5μmmol/L Ap和Target A,37℃振蕩避光反應(yīng)48h,以去離子水洗5次,常溫真空干燥后加入50μL沙門氏菌菌懸液(濃度0.2MCF),室溫反應(yīng)10min,以結(jié)合緩沖液清洗三次,加入20μL 5μmol/L Cy5標記適體,室溫反應(yīng)10min,吸取上清液,以結(jié)合緩沖液清洗三次,常溫真空干燥。將微珠進行掃描。

1.2.4.3 微珠顆粒數(shù)量的影響 本實驗中選取了20、50和100顆微珠研究其微珠數(shù)量對其結(jié)合力的影響,實驗過程同上。

1.2.4.4 適體與沙門氏菌反應(yīng)時間的研究 本實驗中選取了5、10、15、20、25、30min六個時間點研究其反應(yīng)時間長短對其結(jié)合力的影響,實驗過程同上。

1.2.4.5 微珠重復(fù)性研究 適體與靶標分子結(jié)合后,可用洗脫緩沖液(elution buffer)進行洗脫,從而將靶標分子與適體分離,實現(xiàn)NCS-beads-Aptamer的重復(fù)利用,本實驗將洗脫下來的NCS-beads-Aptamer進行重復(fù)利用反應(yīng),觀察其重復(fù)利用次數(shù)。

1.2.5 樣本測定 樣品處理過程參照《飼料中沙門氏菌的快速檢測方法 PCR 法》(GB/T 28642-2012)和《出口食品沙門氏菌屬檢驗方法》(SN0170-1992),過程如下:取25g樣品于225mL的緩沖蛋白胨水中,37℃培養(yǎng)4h進行預(yù)增菌,取10mL預(yù)增菌液于100mL四硫磺酸鹽煌綠增菌液中42℃培養(yǎng)20h進行選擇性增菌,取選擇性增菌液1mL于離心管中10000g離心10min,棄上清液,1mL結(jié)合緩沖液去離子水懸浮離心10min,棄上清,再以0.2mL結(jié)合緩沖液制得樣品菌懸液。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)時間對沙門氏菌適體固定量的研究

研究表明[15,18],長鏈DNA相對于短鏈DNA需要更長的固定時間,而該研究中DNA固定量對于檢測結(jié)果具有很大影響,從理論上來說,固定在微球的DNA量越多,結(jié)合的沙門氏菌靶標量越多,從而提高檢測靈敏度。從圖1中可以看出,適體Aptamer的固定量在48h左右趨于穩(wěn)定,此后隨著時間的延長,其固定量基本沒有變化,說明適體在微珠上的固定量基本趨于飽和狀態(tài)。因此本實驗中確定適體Aptamer固定NCS-Beads的反應(yīng)時間為48h。

圖1 反應(yīng)時間對適體固定量的影響Fig.1 Effect of immobilization time of binding amount aptamer onto NCS beads

2.2 特異性研究

S.enterica與寡核苷酸DNA特異性研究：從圖2信號值可以看出,適體Aptamer與沙門氏菌的特異性很好,與其他的致病菌(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、志賀氏菌、李斯特菌和副溶血性弧菌)基本不發(fā)生反應(yīng),圖3中等堿基數(shù)的任意DNA寡核苷酸鏈與沙門氏菌之間也不發(fā)生反應(yīng),說明該適體與沙門氏菌的特異性較好,而且適體合成簡單方便,這也是未來適體代替抗體的一大優(yōu)勢。

圖2 不同標準菌株與適體特異性研究Fig.2 Selectivity of salmonella towards different bacteriums

圖3 DNA寡核苷酸與沙門氏菌特異性研究Fig.3 Selectivity of aptamer towards target B

2. 3 微珠顆粒數(shù)量的影響

理論上來說,微珠數(shù)量越多,固定適體量相應(yīng)增加,同時可以加強沙門氏菌檢測靈敏度。但是DNA適體和沙門氏菌反應(yīng)本身結(jié)構(gòu)變化目前還未有詳細研究,DNA的固定化密度過大,會由于空間位阻[19]和DNA片段上帶電磷酸基團之間的靜電排斥作用等原因[20],使反應(yīng)特異性降低;密度過小,則會使雜交的量減小,靈敏度降低。因此,DNA的固定化密度是研究DNA固定的重要內(nèi)容之一。從圖4中可以看出,隨著微珠顆粒數(shù)目增加至50個時,熒光值達到一個較高值,而當微珠數(shù)量繼續(xù)增加至100顆時,信號值反而下降,說明隨著微珠顆粒數(shù)的增加,固定適體量的增加可能導(dǎo)致了DNA的空間位阻,最終影響信號DNA分子的結(jié)合。

圖4 微珠顆粒數(shù)量對熒光信號值的影響Fig.4 Effect of different bead number on fluorescence intensity

2. 4 適體與沙門氏菌反應(yīng)時間的研究

由于適體與靶標分子的結(jié)合力相對于抗原抗體反應(yīng)更強,適體與靶標分子的結(jié)合常數(shù)Kd通常為nmol/L級[21],因此反應(yīng)相對于抗原抗體而言更快速,且通常于室溫條件進行,從圖5中可以看出,適體與靶標分子的反應(yīng)在15min基本已經(jīng)達到平衡狀態(tài),隨著時間的延長,沙門氏菌的結(jié)合率反而下降,導(dǎo)致最終熒光信號值的降低,因此本研究選取最適合的反應(yīng)時間為15min。

2.5 微珠重復(fù)性研究

從圖6中可以得知,固定了Ap的微球在重復(fù)利用5次后,信號值可達到原始值的70%左右,對于檢測完全符合要求,可以達到二次利用的目的。說明適體在微球上的共價作用結(jié)合的比較穩(wěn)定,而隨著重復(fù)次數(shù)達到7次或更多時,熒光信號值基本只剩下原始值的20%左右,此時已不適合作為檢測載體,從環(huán)保經(jīng)濟的角度,本實驗將微球的重復(fù)利用次數(shù)確定為5次。

圖5 反應(yīng)時間對熒光信號值的影響Fig.5 Effect of reaction time on fluorescence intensity

圖6 微珠重復(fù)性研究Fig.6 The repetition of NCS-beads

2.6 樣本的測定

對20例水產(chǎn)實際樣本以建立的微球芯片分析系統(tǒng)進行了檢測,同時以GB4789.4-2010作為比較參照,兩種方法的陽性符合率為100%,其中沙門氏菌陽性(6例)符合率為100%,陰性符合率為100%,該分析系統(tǒng)能夠有效對沙門氏菌進行快速檢測,檢測時間比傳統(tǒng)檢測方法5d(數(shù)據(jù)未給出)縮短至2d。

3 結(jié)論

隨著適體研究的廣泛發(fā)展與其相對應(yīng)的適體傳感器有望得到更深入與快速的發(fā)展,為生命科學(xué)研究中核酸與其它生物分子間的相互作用提供更多的分析方法。此外也為臨床診斷和環(huán)境檢測等領(lǐng)域提供更先進的測試工具,為核酸傳感技術(shù)與方法的研究與應(yīng)用注入新的活力。

本文以250μm的玻璃微珠作為固定適體DNA的載體,與沙門氏菌特異性結(jié)合后,以熒光標記的適體進行信號輸出,研究了反應(yīng)過程中適體固定時間,適體與沙門氏菌的特異性,微珠顆粒數(shù)以及重復(fù)性各項因素的影響,最終建立了一種快速簡便的方法實現(xiàn)了對沙門氏菌的檢測,該方法檢測時間比傳統(tǒng)方法縮短了3d。 同時隨著篩選得到的致病菌和病毒的適體越來越多,該項技術(shù)可以應(yīng)用到更多的致病菌檢測系統(tǒng)中,達到快速而有效的檢測目的,同時可以考慮在微珠上同時固定兩種或其以上的適體探針,以期達到多元檢測的目的。

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Study on detection method ofsalmonellausing aptamer-conjugated microbeads

JIN Na1,KONG Xian-li2,LIN Min1,ZUO Peng3

(1.Wenzhou Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau of P.R.C,Wenzhou 325000,China2.Taizhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Taizhou 318000,China;3. East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China)

Objective:To investigate the feasibility of aptamer-conjugated microbeads for the detection ofsalmonella. Methods:Amino-terminal aptamer probes were covalently attached onto the surface of microbeads. Fluorescence from microbeads was detected as signal source,and parameters were optimized which may affect detection of the target. Results:Salmonellawere detected in six of 20 aquatic product samples by this method,and the detection rate was 30%. Conclusion:The aptamer-conjugated microbeads can be used for high throughput and accurate detection ofsalmonella.

salmonella;aptamer;microbeads;detection

2014-09-09

金娜(1983-)，女，碩士研究生，研究方向：食品安全與檢測。

TS201.1

A

1002-0306(2015)13-0321-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.058