基于分光光度法構(gòu)建納豆激酶纖溶活性快速測(cè)定方法

聶光軍,趙 銳,岳文瑾,楊超英,薛正蓮,魏 明,溫東升,聶智杰,葉裕超

(安徽工程大學(xué),生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000)

基于分光光度法構(gòu)建納豆激酶纖溶活性快速測(cè)定方法

聶光軍,趙 銳,岳文瑾*,楊超英,薛正蓮,魏 明,溫東升,聶智杰,葉裕超

(安徽工程大學(xué),生物與化學(xué)工程學(xué)院,安徽蕪湖 241000)

為建立一種快捷、有效的納豆激酶纖溶活性測(cè)定方法,在研究纖維蛋白平板法的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了以透明圈面積為中間參數(shù)的納豆激酶纖溶活力與吸光度值之間關(guān)系模型,通過(guò)測(cè)定納豆激酶顯色反應(yīng)中的吸光度值,直接獲得納豆激酶的纖溶活性。結(jié)果顯示改進(jìn)后的酪蛋白方法可行,其模型方程為y=1877.77x-481.08(R2=0.9924)。驗(yàn)證結(jié)果顯示模型相關(guān)性強(qiáng),準(zhǔn)確度較高,操作簡(jiǎn)便、快速、檢測(cè)成本低,是一種高效的納豆激酶纖溶活性快速檢測(cè)方法。

納豆激酶,纖維蛋白平板法,酪蛋白法,TAME法

納豆激酶(Nattokinase,NK)由枯草桿菌產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶,具有優(yōu)良的溶栓效果,能降低血粘度,改善血液循環(huán)等作用,對(duì)高血壓、衰老、中風(fēng)、肌肉痙攣和心腦血管疾病也有很好的療效[1-2]。相對(duì)于傳統(tǒng)藥劑,NK分子量小,安全高效,作用時(shí)間長(zhǎng)[3],不僅能抑制血栓形成,而且溶栓作用強(qiáng),并抗胰酶水解,在腸道內(nèi)穩(wěn)定性好,易被人體消化吸收,因而既可以靜脈給藥,也可以口服[4]。因此,NK有望成為新型溶栓藥物制劑[5]和功能性食品添加劑[6],其相關(guān)產(chǎn)品(如納豆)也將成為重要的保健食品或飲品。

目前,困擾NK研究的主要問(wèn)題之一是其纖溶活性檢測(cè)方法。經(jīng)典的NK纖溶活性測(cè)定方法是纖維蛋白平板法。該方法測(cè)定結(jié)果比較直觀,但由于所用試劑為生物制品,批次差異大且昂貴,實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜,實(shí)驗(yàn)過(guò)程耗時(shí),難以進(jìn)行大批量樣品高通量篩選[7]。其他常用的方法有四肽底物法[8]、血清板法[9]、甲基苯磺酰-L-精氨酸甲酯(Na-P-Tosyl-L-arginine methylester hydrochloride,TAME)法[10]、酪蛋白法[11]等。其中,TAME法和酪蛋白法基于顯色原理,利用分光光度法進(jìn)行檢測(cè),相對(duì)于經(jīng)典的纖維蛋白平板法,上述兩種方法具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低廉等優(yōu)點(diǎn);但是,它們表征的NK活力并非纖溶活性。因此,為高效檢測(cè)NK的纖溶活性,建立纖維蛋白平板法與TAME法和酪蛋白法的關(guān)聯(lián)十分必要。

本研究通過(guò)研究纖維蛋白法,并在此基礎(chǔ)上建立以透明圈面積為中間參數(shù)的纖溶活性與吸光度值之間的關(guān)系模型,嘗試構(gòu)建一種更為有效、快捷的NK纖溶活性測(cè)定方法,提高NK纖溶活性的檢測(cè)效率,降低其檢測(cè)成本。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納豆激酶,本實(shí)驗(yàn)室自制(所用菌種為枯草納豆桿菌 購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心和從市售納豆菌粉中分離所得);TAME Sigma公司;尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品(1280IU/支)、纖維蛋白原(98mg/支)和凝血酶(190bp/支) 中國(guó)藥物生物制品檢定所;瓊脂糖和福林酚試劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;酪蛋白 南京化學(xué)試劑一廠。

紫外分光光度計(jì)(SP-754) 上海光譜儀器有限公司;隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GNP-050)常州普天儀器制造有限公司;高速冷凍離心機(jī)(TGL-16G) 上海安亭科學(xué)儀器廠;數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-6) 金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 纖維蛋白平板法

1.2.1.1 纖維蛋白平板的制備 基于馬恩平等[12]報(bào)道的方法,向10mL 2%的瓊脂糖溶液中添加1mL濃度為1bp/mL凝血酶溶液,混勻后,立即加入10mL 3%是纖維蛋白原溶液,迅速搖勻并快速倒入直徑為9cm的培養(yǎng)皿中,室溫下放置1h,再用孔徑為0.5cm的打孔器打孔備用。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及酶活測(cè)定 用微量移液器分別將10μL纖溶活力為20、40、60、80、100、150、200、300、400U/mL的尿激酶加入已制備好的纖維蛋白平板的點(diǎn)樣孔中;室溫放置10min后,再倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h;利用游標(biāo)卡尺檢測(cè)透明圈直徑(cm),并根據(jù)公式S=π(r+0.5)(r-0.5)計(jì)算透明圈面積(r為半徑),并以此和已知的活力為橫縱坐標(biāo),通過(guò)直線擬合得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=45.495x(R2=0.9906)。等量的未知樣品可通過(guò)上述相同步驟得出透明圈面積后,根據(jù)尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出未知樣品的纖溶活性。

1.2.2 酪蛋白法 NK為堿性蛋白酶,可降解酪蛋白為酪氨酸,酪氨酸與酚試劑反應(yīng)生成藍(lán)色化合物,在680nm處有最大吸收峰,其A680nm與NK活力呈正相關(guān)?？衫梅止夤舛扔?jì)測(cè)定其A680nm,并計(jì)算NK的纖溶活性,檢測(cè)耗時(shí)約為1h。基于魏華等[11]報(bào)道的方法設(shè)計(jì)具體步驟如下:分別將2mL 0.5%酪蛋白溶液和1mL酶樣品放置于30℃水浴中預(yù)熱5min,然后將二者充分混勻后,置于30℃水浴中反應(yīng)10min后,取出并立即加入3mL 10%三氯乙酸溶液,混勻后放置10min,濾紙過(guò)濾。同時(shí)另作一組對(duì)照,取酶液1mL先加3mL 10%三氯乙酸,再加2mL 0.5%酪蛋白溶液,30℃溫浴10min,放置15min后過(guò)濾;取3支試管并編號(hào),分別加入上述樣品濾液、對(duì)照濾液和水各1mL;再向各試管中加入5mL 0.55mol/L碳酸鈉混勻后再各加入酚試劑1mL,立即混勻,30℃顯色15min;以加水的一管為空白,應(yīng)用分光光度計(jì)分別檢測(cè)樣品和對(duì)照的A680nm,得A樣和A對(duì),由此計(jì)算得ΔA680nm(A樣-A對(duì)),該ΔA680nm與NK的活力呈正相關(guān)。

1.2.3 TAME法 NK對(duì)精氨酸羧端肽有較強(qiáng)的切割作用。37℃下,NK可將TAME切割成對(duì)甲基苯磺酰-L-精氨酸和甲醇;高錳酸鉀可將甲醇氧化成甲醛,甲醛與變色酸在沸水浴中發(fā)生顯色反應(yīng),574nm處有最大吸收峰,A574nm與NK活性成正相關(guān)。應(yīng)用分光度計(jì)檢測(cè)A574nm,并計(jì)算NK的活性。基于熊迎新等報(bào)道的方法[13],設(shè)計(jì)具體步驟如下:取具塞試管若干支,分別加入0.1mL 0.1mol/L TAME、pH8的磷酸鹽緩沖液0.1mL,NK樣品0.1mL(對(duì)照管樣品為加熱失活后的NK樣品),37℃水浴30min,取出后立即冰浴,同時(shí)加入0.2mL 15%三氯醋酸終止反應(yīng),然后,加入0.1mL 2%高錳酸鉀后振搖2min,使其充分反應(yīng),再加入0.1mL 10%亞硫酸鈉,最后加人4mL變色酸充分振搖混勻,放入沸水浴中顯色反應(yīng)25min,取出后冷水浴冷卻,測(cè)定其ΔA574nm。

1.3 反應(yīng)時(shí)間和酶活范圍的影響

應(yīng)用纖維蛋白平板法檢測(cè)NK的纖溶活性,以不同活力的尿激酶(20～400IU/mL)為研究對(duì)象,將上述等量不同活力的尿激酶點(diǎn)樣于纖維蛋白平板中,37℃下分別孵育6～21h,測(cè)其透明圈面積,再分別以透明圈面積和已知的活力為橫縱坐標(biāo),直線擬合不同反應(yīng)時(shí)間和不同活力范圍的實(shí)驗(yàn)散點(diǎn)得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的相關(guān)系數(shù)(R2)和斜率(Slope)。比較方程的R2和斜率,分析不同反應(yīng)時(shí)間和酶活范圍對(duì)纖維蛋白平板法測(cè)定效果的影響。

1.4 模型建立及驗(yàn)證

1.4.1 模型建立 選擇實(shí)驗(yàn)室制備的原始纖溶活力為1668IU/mL(該活力由纖維蛋白平板法測(cè)定)的NK為實(shí)驗(yàn)樣品,分別將其稀釋5、6、7、8倍,并編號(hào)為C05～C08。依次應(yīng)用酪蛋白法和TAME法測(cè)定相應(yīng)的ΔA680nm和ΔA574nm,分別以ΔA680nm、ΔA574nm和已知纖溶酶活為橫縱坐標(biāo),通過(guò)直線擬合得出NK ΔA680nm、ΔA574nm與其纖溶活力間的線性模型。

1.4.2 模型驗(yàn)證 應(yīng)用不同發(fā)酵批次和不同菌株發(fā)酵的NK粗酶液驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確度和適用性。具體如下:應(yīng)用購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心枯草納豆桿菌以市售黃豆為基質(zhì)進(jìn)行固體發(fā)酵15、18、21h后,以固液比1∶4的生理鹽水洗脫發(fā)酵后的固體基質(zhì),震蕩浸提得不同批次的NK樣品,分別編號(hào)為S1、S2和S3。再以市售納豆菌粉分離到的納豆桿菌發(fā)酵24h,通過(guò)相同的方法制備出不同菌株發(fā)酵生產(chǎn)的NK樣品S4。分別應(yīng)用纖維蛋白平板法、酪蛋白法和TAME法檢測(cè)S1、S2、S3和S4的纖溶活性(A1)、ΔA680nm、ΔA574nm,分別利用已建立的模型計(jì)算出纖溶活性模型估計(jì)值(A2),再應(yīng)用SPSS 10.0 軟件進(jìn)行T檢驗(yàn)和相關(guān)性分析A1和A2兩組值,驗(yàn)證已建模型的準(zhǔn)確度和適用性。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)為三個(gè)重復(fù),以算術(shù)平均數(shù)表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維蛋白平板法的研究

為深入了解纖維蛋白平板法檢測(cè)NK纖溶活性的準(zhǔn)確度,分析以透明圈面積和已知纖溶活力為橫縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和相關(guān)系數(shù)隨孵育時(shí)間的變化規(guī)律。結(jié)果顯示,斜率隨孵育時(shí)間增加而降低,相關(guān)系數(shù)隨孵育時(shí)間增加而增加,兩者都在18h后達(dá)到平衡(圖1)。結(jié)果表明孵育時(shí)間顯著影響該測(cè)定方法的準(zhǔn)確度,即孵育時(shí)間越長(zhǎng),測(cè)定準(zhǔn)確度越高;孵育時(shí)間達(dá)到18h后,準(zhǔn)確度最高。這可能是因?yàn)槊笜悠吩谀z介質(zhì)中的擴(kuò)散速度有關(guān),也證明了纖維平板制備的均一程度和酶樣品純度對(duì)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)備度存在顯著的影響。這表明了纖維蛋白平板法不僅測(cè)定周期長(zhǎng),而且隨機(jī)誤差大。此外,在實(shí)際測(cè)量過(guò)程中,孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng),人工血栓會(huì)自然解聚,即當(dāng)孵育時(shí)間超過(guò)15h后,透明圈變得模糊而觀測(cè)不清,進(jìn)而導(dǎo)致測(cè)定誤差顯著增大[14]。為此,構(gòu)建一個(gè)有效、快捷的NK纖溶活性測(cè)定方法十分必要。

圖1 不同孵育時(shí)間對(duì)模型斜率和相關(guān)系數(shù)(R2)的影響Fig.1 Effect of the slope on the correlation coefficient

為了解樣品濃度范圍對(duì)測(cè)定方法的影響,依次以20～80、100～400、20～400U/mL三個(gè)濃度范圍的尿激酶為樣品,分析檢測(cè)活性與已知纖溶活性間的相關(guān)系數(shù)(圖2),結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述三個(gè)濃度范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)依次為0.9958、0.9902和0.9906。結(jié)果表明樣品濃度越低檢測(cè)的準(zhǔn)確度越高,樣品濃度范圍越窄檢測(cè)的準(zhǔn)確度也越高。這可能是因?yàn)闃悠窛舛仍礁?需要的擴(kuò)散時(shí)間越長(zhǎng),透明圈變得越模糊,隨機(jī)誤差增加;另外,濃度差異越大,所需的擴(kuò)散時(shí)間跨度也就越大,隨機(jī)誤差會(huì)隨之相對(duì)增加。

圖2 不同樣品濃度范圍的擬合曲線Fig.2 The fitting curve of enzyme activity against the size of transparent circle注:a:20～80IU/mL;b:100～400IU/mL;c:20～400IU/mL。

2.2 纖維蛋白平板法-酪蛋白法

以平板法的溶圈面積作為中間參數(shù),構(gòu)建酪蛋白法的吸光值(ΔA680nm)與尿激酶的纖溶活性單位數(shù)的關(guān)系(圖3),兩者呈良好的正相關(guān)。線性回歸方程為:y=1877.77x-481.08(R2=0.9924)。為驗(yàn)證該模型測(cè)定NK纖溶活性的準(zhǔn)確度和適用性,選擇不同發(fā)酵批次(相同菌株發(fā)酵)和不同菌株發(fā)酵的NK粗酶液為樣品,分別應(yīng)用纖維蛋白平板法和酪蛋白法檢測(cè),結(jié)果如表1所示。應(yīng)用SPSS軟件對(duì)A1和A2兩組值進(jìn)行配對(duì)樣品T檢驗(yàn)得:t值為0.989(>0.05),表明兩組值差異不顯著。相關(guān)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其相關(guān)系數(shù)為0.929,接近0.05的顯著性水平,表明具有較強(qiáng)的相關(guān)性。其中,在測(cè)定同一菌株不同發(fā)酵批次的NK樣品時(shí),準(zhǔn)確度明顯高于不同菌株發(fā)酵的NK樣品。由此推斷由同一菌株發(fā)酵產(chǎn)生的NK粗品,其中含有的雜質(zhì)對(duì)酶纖溶活性測(cè)定影響不明顯,而由不同菌株發(fā)酵產(chǎn)生的NK粗品可能因?yàn)榫臧l(fā)酵特征不同導(dǎo)致發(fā)酵液中的雜質(zhì)變化差異較大,進(jìn)而影響酶纖溶活性的準(zhǔn)確度。針對(duì)這種情況,可以通過(guò)重新構(gòu)建關(guān)系模型來(lái)規(guī)避由不同菌株發(fā)酵導(dǎo)致的雜質(zhì)誤差影響過(guò)大的問(wèn)題。綜上,可以認(rèn)定改進(jìn)后的酪蛋白法可用于測(cè)定NK的纖溶活性。

圖3 納豆激酶吸光度值與其纖溶活性間的關(guān)系曲線Fig.3 The model of nattokinase activity against its absorbance value 注:a:酪蛋白方法;b:TAME法。

表1 納豆激酶ΔA680nm與其纖溶活性關(guān)聯(lián)模型驗(yàn)證
Table 1 Verification of the model between the absorbance value(680nm)and the fibrinolytic activity of nattokinase

樣品ΔA680nm斜率截距A2(U/mL)A1(U/mL)S1S2S3S40.4770.4930.4520.5541877481414.6405.5444.6459.9367.6359.1559.2493.7

注:A1:直接應(yīng)用纖維蛋白平板法檢測(cè)得到的NK纖溶活性;A2:應(yīng)用酪蛋白法檢測(cè),并通過(guò)纖維蛋白平板法-酪蛋白法關(guān)聯(lián)模型計(jì)算得到的NK纖溶活性。S1～S3為同一菌株不同批次發(fā)酵的NK樣品,S4為不同菌株發(fā)酵的NK樣品。

2.3 纖維蛋白平板法-TAME法

以平板法的溶圈面積作為中間參數(shù),構(gòu)建TAME法吸光值(ΔA574nm)與尿激酶的纖溶活性的關(guān)系(圖3b),兩者呈良好的正相關(guān)。線性回歸方程為:y=1251.03x+114.76(R2=0.9809)。為驗(yàn)證該模型的準(zhǔn)確度和適用性,選擇不同發(fā)酵批次(相同菌株發(fā)酵)和不同菌株發(fā)酵的NK粗酶液為樣品,分別應(yīng)用纖維蛋白平板法和TAME法檢測(cè),結(jié)果如表2所示。比較A1和A2兩組值發(fā)現(xiàn)兩者差異較大(遠(yuǎn)大于誤差范圍),可能因?yàn)榘l(fā)酵液中的雜質(zhì)嚴(yán)重影響TAME的顯色反應(yīng),這一結(jié)論與熊迎新等[13]報(bào)道的結(jié)果一致。由此表明該模型難以適用對(duì)NK粗品纖溶活性的檢測(cè)。

表2 納豆激酶ΔA574nm與其纖溶活性關(guān)聯(lián)模型驗(yàn)證Table 2 Verification of the model between the absorbance value(574nm)and the fibrinolytic activity of nattokinase

注：A1:直接應(yīng)用纖維蛋白平板法檢測(cè)得到的NK纖溶活性;A2:應(yīng)用TAME法檢測(cè),并通過(guò)纖維蛋白平板法TAME法關(guān)聯(lián)模型計(jì)算得到的NK纖溶活性。S1～S3為同一菌株不同批次發(fā)酵的NK樣品,S4為不同菌株發(fā)酵的NK樣品。

3 結(jié)論

經(jīng)典的納豆激酶纖溶活性單位是以藥典收載的尿激酶為參照的,常用測(cè)定方法為纖維蛋白平板法。該方法操作比較繁瑣,耗時(shí)長(zhǎng)達(dá)18h,且通過(guò)表觀的溶解圈面積大小定量纖溶活性,檢測(cè)誤差大;此外,該方法受樣品純度、平板制備均一程度(不同批次)、孵育時(shí)間等影響較大,方法靈敏度低;因纖維蛋白原和凝血酶的高價(jià)格導(dǎo)致檢測(cè)成本難以降低。因此,纖維蛋白平板法不宜作為一種常規(guī)的檢測(cè)手段。改進(jìn)后的酪蛋白法是基于分光光度法進(jìn)行體外定量測(cè)定NK纖溶活性,用時(shí)約為1h,大大少于纖維蛋白平板法,具有及時(shí)、高效、低成本的優(yōu)勢(shì),適用于保健食品纖溶活力的體外測(cè)定。此外,針對(duì)不同的NK的濃度范圍,可構(gòu)建不同區(qū)間的關(guān)系模型;針對(duì)不同發(fā)酵條件,可與纖維蛋白平板法結(jié)合使用,有效提升NK纖溶活性的準(zhǔn)確度和精密度。因此,改進(jìn)后的酪蛋白法是一種高效的NK纖溶活性快速檢測(cè)方法。

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Construction of a rapid method for assaying the fibrinolytic activityof Nattokinase based on spectrophotometric assay method

NIE Guang-jun,ZHAO Rui,YUE Wen-jin*,YANG Chao-yin,XUE Zheng-lian,WEI Ming,WEN Dong-sheng,NIE Zhi-jie,YE Yu-chao

(College of Biochemical Engineering,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China)

To construct a rapid,efficient method for assaying the fibrinolytic activity of nattokinase,two models between fibrinolytic activity of nattokinase in fibrin plate method and absorbance value of nattokinase in casein method or in TAME method were formed with the size of transparent zone as an intermediate parameter based on the study on fibrin plate method. The fibrinolytic activity can be directly determined by detecting the absorbance value of nattokinase in casein method or in TAME method. The results showed that the improved casein method can be applied in determining the fibrinolytic activity of nattokinase,the model in the improved method was as the following:y=1877.77x-481.08(R2=0.9924). The result of verification experiment indicated that the model owned such advantages as strong correlation,high degree of accuracy,easy operation,high efficiency,and low cost. Therefore,the improved casein method was an efficient method for real time detecting the fibrinolytic activity of nattokinase.

Nattokinase;fibrin plate method;casein method;TAME method

2014-07-28

聶光軍(1976-)，男，博士，副教授，研究方向：分子生物學(xué)。

*通訊作者:岳文瑾(1979-)，女，博士，副教授，研究方向：生物納米材料。

安徽省自然科學(xué)基金(1508085SMC212);安徽省高校自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2014A025)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(201210363042, 201310363076)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)13-0298-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.054