IL-1RN-2018多態(tài)性及IL-1Ra/IL-1β比值與非小細(xì)胞肺癌的關(guān)系

李君蕊，肖 穎，付盈菊，張雅麗，盧玉娟，亢瑞娜，趙寶春

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院：1.感染科；2.腫瘤內(nèi)科；3.急診內(nèi)科；4檢驗科 063000)

IL-1RN-2018多態(tài)性及IL-1Ra/IL-1β比值與非小細(xì)胞肺癌的關(guān)系

李君蕊1，肖 穎2，付盈菊3，張雅麗1，盧玉娟4，亢瑞娜1，趙寶春1

(河北醫(yī)科大學(xué)附屬唐山工人醫(yī)院：1.感染科；2.腫瘤內(nèi)科；3.急診內(nèi)科；4檢驗科 063000)

目的 探討白細(xì)胞介素受體拮抗劑(IL-1Ra)編碼基因2018(IL-1RN-2018)多態(tài)性及血清IL-1Ra/IL-1β比值與非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的相關(guān)性。方法 2012年1月至2014年1月選取85例NSCLC患者作為NSCLC組，80例健康體檢者作為對照組，采用熒光定量PCR為基礎(chǔ)的高分辨率熔解曲線(HRM)技術(shù)檢測IL-1RN-2018 T/C基因SNP，隨機選取10%進行基因測序驗證，應(yīng)用ELISA法測定兩組血清中IL-1Ra及IL-1β水平。結(jié)果 (1)NSCLC組患者IL-1RN-2018基因的TC型、TC+CC型的NSCLC發(fā)病風(fēng)險分別為TT型的2.646倍和2.315倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(2)鱗癌患者與腺癌患者比較，IL-1RN-2018 T/C 基因型分布及等位基因頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(3)NSCLC組患者的血清中IL-1Ra、IL-1β水平顯著高于對照組，IL-1Ra/IL-1β低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。(4)NSCLC組中各基因型患者的血清IL-1Ra水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 IL-1RN-2018的C等位基因攜帶者的NSCLC患病風(fēng)險增加；IL-1Ra/IL-1β的降低可能預(yù)示NSCLC患病風(fēng)險。

白細(xì)胞介素1受體拮抗劑；白細(xì)胞介素1β；基因多態(tài)性；癌，非小細(xì)胞肺

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的發(fā)病率和病死率極高,其病因和發(fā)病機制尚未完全闡明，有流行病學(xué)調(diào)查研究顯示吸煙、日常飲食及生活環(huán)境等因素在肺癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要的作用[1],近年研究發(fā)現(xiàn)基因在其中扮演了重要的角色[2-3]。白細(xì)胞介素-1(IL-1)與NSCLC發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系，白細(xì)胞介素受體拮抗劑(IL-1Ra)可通過競爭性與IL-1受體結(jié)合從而參與腫瘤免疫反應(yīng)和調(diào)節(jié)過程[4]。本研究將通過檢測IL-1Ra編碼基因2018(IL-1RN-2018)rs419598位點的單核苷酸多態(tài)性(SPN)及血清IL-1Ra水平、IL-1β水平、IL-1Ra/IL-1β，探討其與NSCLC的關(guān)系，為NSCLC盡早診斷及治療提供依據(jù)。

1 資料及方法

1.1 一般資料 2012年1月至2014年1月選取85例NSCLC患者為研究對象(NSCLC組)，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者Karnofsky評分(KPS)≥60分；(2)患者均經(jīng)病理組織學(xué)、影像學(xué)確診；(3)患者TNM分期為Ⅰ～Ⅲ期；(4)患者在知情同意下參與研究。其中男48例，女37例，年齡28～78歲，平均(52.63±4.12)歲，病程3個月至2年，平均病程(8.12±2.12)個月。TNM分期為Ⅰ期35例，Ⅱ期30例,Ⅲ期20例。鱗癌52例，腺癌23例，其他類型10例。其中接受手術(shù)治療者60例，余下的患者行放射化學(xué)治療。排除急慢性感染，肝、腎、心腦血管及內(nèi)分泌疾病者。另選取同期在本院行身體檢查的80例健康體檢者為對照組，其中男 44例，女36例，年齡35～80歲，平均(51.98±4.24)歲，患者影像學(xué)、血液腫瘤標(biāo)記物及實驗室生化指標(biāo)診斷確診為健康人群。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 空腹抽取各組靜脈血3 mL，經(jīng)離心處理后留取上清液，采用乙二胺四乙酸二鉀抗凝全血標(biāo)本，采用日本TOYOBO磁珠法DNA提取試劑盒提取DNA，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明進行，將DNA標(biāo)本置入-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 引物及探針的設(shè)計與合成 IL-1RN-2018 rs419598 基因序列PCR擴增引物及探針由上海生工生物有限公司合成，由北京賽百盛生物技術(shù)公司提供。上游引物5′-GGG ATG TTA ACC AGA AG ACCT TCT ATCT-3′，下游引物5′-CAA CCA CTC ACC TTC TAA ATT GAC ATT-3′，DNA探針5′-A(FAM)AC AAC CAA CTA GTT GCT GGA TAC TTG CA(TAMRA)A-3′，探針3′端阻斷，避免反應(yīng)過程中延伸。

1.2.3 以熒光定量PCR為基礎(chǔ)的高分辨率熔解曲線(HRM)分型 PCR采用ABI公司生產(chǎn)的5700型PCR擴增儀。PCR緩沖液、dNTP、rTaqDNA 聚合酶等由TaKaRa 公司生產(chǎn)。反應(yīng)體系中上下游引物濃度比為1∶10，反應(yīng)體系10 μL,上游引物終濃度0.3 pmol,下游引物終濃度3 pmol,探針3 pmol,PCR擴增長度163 bp,探針與T特異互補。循環(huán)參數(shù)：95 ℃將DNA預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，72 ℃延伸10 s，60 ℃復(fù)性20 s,55個反復(fù)循環(huán)擴增，后進入溶解曲線，60～95 ℃。采用熒光定量PCR儀Roche Light Cyclery?480軟件分析溶解曲線，得出基因型。純合子用TT、CC表示，雜合子用TC表示。等位基因頻率=(2×純合子+雜合子)/(2×受體人數(shù))。

1.2.4 基因測序驗證 將DNA 模板抽樣共10例，經(jīng)PCR法對IL-1RN-2018基因目的片段進行擴增，擴增長度163 bp,引物同前，PCR反應(yīng)總體系為50 μL，包括dNTP 4.0 μL(2.5 mmol/L)，Tap 0.25 μL,10×PCR緩沖液5 μL,上下游引物(10.0 μmol/L)各4 μL，模板DNA各4 μL，用滅菌去離子水補充至50 μL，反應(yīng)條件：95 ℃將DNA預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，72 ℃延伸10 s，56 ℃退火30 s,35個反復(fù)循環(huán)，再于72 ℃延伸5 min;PCR擴增產(chǎn)物送上海生工生物公司進行DNA測序，結(jié)果與熒光定量PCR結(jié)果相符。

1.2.5 血清IL-1Ra、IL-1β水平測定 抽取NSCLC組及對照組患者靜脈血3 mL，以3 000 r/min離心處理10 min，留取血清。采用ELISA法進行測定，試劑盒由上海生物試劑有限公司提供，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。

2 結(jié) 果

2.1 HRM分型及DNA測序結(jié)果 IL-1RN-2018位點基因型分為TT、TC及CC 3種基因型，見圖1、2。

圖1 IL-1-RN-2018位點HRM分型結(jié)果

2.2 Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢測 經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢測IL-1RN-2018基因rs419598位點，對照組和NSCLC組基因型的實際值和預(yù)測值結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，本實驗樣本具有代表性及可比性。

2.3 NSCLC組與對照組IL-1RN-2018基因多態(tài)性對比 IL-1RN-2018基因型及等位基因兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.831，P=0.020)。分析結(jié)果表明，攜帶IL-1RN-2018位點的TC基因型人群發(fā)病危險性是攜帶TT基因型的2.646倍(95%CI：1.327～5.280)，TC+CC基因型人群發(fā)病危險性是攜帶TT基因型患者的2.315倍(95%CI：1.233～4.347)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。NSCLC組攜帶C等位基因的比例明顯高于對照組(χ2=4.562，P=0.033)，見表1。

2.4 NSCLC組鱗癌患者與腺癌患者基因型對比 鱗癌與腺癌患者IL-1RN-2018基因型及等位基因頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.074，P=0.964)。

A：T/T；B：T/C；C：C/C。

圖2 IL-1RN-2018測序結(jié)果

2.5 NSCLC組與對照組各基因型血清中IL-1Ra對比 NSCLC組中患者血清IL-1Ra、IL-1β水平顯著高于對照組，而IL-1Ra/IL-1β明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 NSCLC組與對照組血清中IL-1Ra、IL-1β及IL-1Ra/IL-1β的比較(±s，pg/mL)

2.6 不同病理類型NSCLC患者血清IL-1Ra表達(dá)水平對比 雖然鱗癌患者的血清IL-1Ra水平高于腺癌(P<0.05)，但IL-1Ra/IL-1β在兩種病理類型的患者中未見明顯差別(P>0.05)，見表3。

表3 鱗癌與腺癌患者血清中IL-1Ra、IL-1β及IL-1Ra/IL-1β的比較(±s，pg/mL)

2.7 NSCLC組中不同基因型患者的血清IL-1Ra水平的比較 NSCLC組中TT、TC、CC型患者的血清IL-1Ra水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

肺癌發(fā)生的微環(huán)境中包含一部分炎癥細(xì)胞，這些細(xì)胞可以產(chǎn)生一些細(xì)胞因子、生長因子，以及促進腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)移的黏附因子等，而IL-1是引起腫瘤免疫反應(yīng)重要的細(xì)胞因子。IL-1有2個結(jié)構(gòu)亞型,為IL-1α和IL-1β,是腫瘤免疫中的重要細(xì)胞因子，其可刺激細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等細(xì)胞因子，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的移動、增殖，還可刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖與分裂，增強基質(zhì)蛋白酶活性，從而促進血管生成，參與NSCLC的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移過程[5-6]。IL-1β、IL-6及TNF-α等多種細(xì)胞因子及趨化因子可活化核因子-κB，繼而易位到細(xì)胞核，誘導(dǎo)與腫瘤相關(guān)的基因表達(dá)[7]。IL-1Ra可由中性粒細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，可競爭性地與IL-1受體結(jié)合，阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進而特異地抑制IL-1的生物學(xué)功能，從而抑制腫瘤生長[4]。

肺癌的發(fā)生、發(fā)展受多種因素影響，宿主的基因多態(tài)性的影響不容忽視，IL-1Ra的編碼基因IL-1RN存在多基因位點的多態(tài)性，目前多項研究表明IL-1RN的VNTR區(qū)的2等位基因可減低肺癌的發(fā)病、進展和轉(zhuǎn)移[7-9]。而目前IL-1RN其他基因位點與肺癌的關(guān)系研究較少。

本研究對IL-1RN-2018位點進行了研究，結(jié)果顯示NSCLC組患者CT型、CC型及CT+CC型比例顯著高于對照組，C等位基因頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，TC基因型人群發(fā)病危險性是攜帶TT基因型的2.646倍，TC+CC基因型人群發(fā)病危險性是攜帶TT的攜帶者2.315倍，提示IL-1RN-2018 C基因的攜帶者NSCLC的患病風(fēng)險增加。進一步比較鱗癌與腺癌之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。該位點的基因多態(tài)性與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，Burada等[10]對結(jié)腸癌的研究結(jié)果顯示IL-1RN-2018 CC基因型與大腸癌的早期發(fā)病存在明顯的相關(guān)性，Al-Moundhri等[11]研究結(jié)果顯示IL-1RN-2018 CT及CT+CC基因型的胃癌發(fā)病率是TT基因型的2.6倍和2.2倍，C等位基因與胃癌發(fā)病相關(guān)。肺癌的發(fā)病可能與該基因的多態(tài)性相關(guān)，但各病理類型間無明顯差別，表明宿主的基因因素可能影響肺癌的發(fā)病風(fēng)險，但其發(fā)生可能涉及多途徑、多因素共同作用的結(jié)果。

多種肺癌腫瘤標(biāo)志物的檢測應(yīng)用到臨床上，如CEA、NSE、CYFRA21-1、胃泌素釋放肽前體(pro-GRP)等，有研究表明包括IL-1Ra、基質(zhì)金屬蛋白酶-2及TNF-α在內(nèi)的炎癥指標(biāo)也可作為早期診斷肺癌的有效指標(biāo)[12]。本研究結(jié)果顯示NSCLC組的IL-1β及IL-1Ra水平均高于對照組，腫瘤引起的免疫反應(yīng)可引起炎癥因子水平的增加，但二者增加的水平不平行，NSCLC組中IL-1Ra/IL-1β比值明顯低于對照組，多項研究表明IL-1Ra對肺癌的發(fā)生、進展存在一定的保護作用，IL-1Ra/IL-1β比值的降低可能增加NSCLC的風(fēng)險。Shiels等[13]研究顯示IL-1Ra的升高可降低肺癌的發(fā)病風(fēng)險，且Bunt等[14]研究發(fā)現(xiàn)IL-1Ra生成缺陷的小鼠的肺癌的發(fā)病風(fēng)險明顯增加。有研究顯示，給帶瘤的小鼠注射緩釋的IL-1Ra可延緩腫瘤的生長，這些結(jié)果均支持IL-1Ra對NSCLC存在一定的保護作用[15-16]。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中IL-1β起促進作用，高水平的IL-1Ra更能有效與IL-1β競爭受體，從而阻斷IL-1的生物活性，對肺癌的發(fā)生起到一定的保護作用。Bar等[15]研究顯示包括IL-1Ra、基質(zhì)金屬蛋白酶-2及TNF-α在內(nèi)的炎癥指標(biāo)可作為早期診斷肺癌的有效指標(biāo)。此外，在霍奇金淋巴瘤、結(jié)腸腫瘤及婦科腫瘤患者血中都可檢測到IL-1Ra增高[7]，因此，IL-1Ra及IL-1Ra/IL-1β可能作為非特異的腫瘤標(biāo)志物進行包括NSCLC的檢測。

IL-1Ra的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)受多種因素的影響，如機體的免疫狀態(tài)，各細(xì)胞因子間的相互作用及基因調(diào)節(jié)等，本試驗結(jié)果顯示NSCLC組各基因型患者的血清IL-1Ra水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，表明該基因位點可能不是IL-1Ra的產(chǎn)生原因，可能是其他基因位點的調(diào)節(jié)因素，如IL-1RN的VNTR的Ⅱ等位基因可使IL-1Ra的產(chǎn)生明顯增加[10]，也有研究其產(chǎn)生可能受IL-1β基因的影響[16]，機體對各種物質(zhì)的調(diào)節(jié)均有其復(fù)雜性，其調(diào)節(jié)機制有待進一步研究。

IL-1RN-2018的基因型檢測及IL-1Ra/IL-1β比值的測定可能為早期識別肺癌發(fā)病的風(fēng)險及盡早干預(yù)提供依據(jù)，但肺癌的發(fā)病機制復(fù)雜，還有待于加大樣本量，多種族多地區(qū)聯(lián)合，優(yōu)化試驗方法，進一步加以驗證。

[1]De Groot P,Munden RF.Lung cancer epidemiology,risk factors,and prevention[J].Radiol Clin North Am,2012,50(5):863-876.

[2]Landvik NE,Hart K,Haugen A,et al.Functional analysis of a lung cancer risk haplotype in the IL 1B gene regulatory region[J].J Hum Genet,2012,57(11):747-752.

[3]Kaabachi S,Kaabachi W,Rafrafi A,et al.Tumor necrosis factor gene polymorphisms in Tunisian patients with non-small cell lung cancer[J].Clin Lab,2013,59(11/12):1389-1395.

[4]Melo Barbosa HP,Martins LC,Dos Santos SE,et al.Interleukin-1 and TNF-alpha polymorphisms and Helicobacter pylori in a Brazilian Amazon population[J].World J Gastroenterol,2009,15(12):1465-1471.

[5]Goldstraw P,Crowley J,Chansky K,et al.The IASLC Lung Cancer Staging Project:proposals for the revision of the TNM stage groupings in the forthcoming (seventh) edition of the TNM Classification of malignant tumours[J].J Torac Oncol,2007,2(8):706-714.

[6]Yao PL,Lin YC,Wang CH,et al.Autocrine and paracrine regulation of interleukin-8 expression in lung cancer cells[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2005,32(6):540-547．

[7]Cheng CY,Hsieh HL,Sun CC,et al.IL-l beta induces urokinase-plasminogen activator expression and cell migration through PKC alpha,JNK1/2,and NF-kappaB in A549 cells[J].J Cell Physiol,2009,219(1):183-193．

[8]Hu Z,Shao M,Chen Y,et al．Allele 2 of the interleukin-1 receptor antagonist Gene (IL1RN*2)is associated with a decreased risk of primary lung cancer[J].Cancer Lett,2006，236(2)：269-275．

[9]Lim WY,Chen Y,Ali SM,et al.Polymorphisms in inflammatory pathway genes,host factors and lung cancer risk in Chinese female never-smokers[J].Carcinogenesis,2011,32(4):522-529.

[10]Burada F,Dumitrescu T,Nicoli R,et al.IL-1RN +2018 T>C polymorphism is correlated with colorectal cancer[J].Mol Biol Rep,2013,40(4):2851-2857.

[11]Al-Moundhri MS,Al-Nabhani M,Al-Bahrani B,et al.Interleukin-1beta gene (IL-1B) and interleukin 1 receptor antagonist gene (IL-1RN) polymorphisms and gastric cancer risk in an Omani Arab population[J].Gastric Cancer,2006,9(4):284-290.

[12]Farlow EC,Vercillo MS,Coon JS,et al.A multi-analyte serum test for the detection of non-small cell lung cancer[J].Br J Cancer,2010,103(8):1221-1228.

[13]Shiels MS,Pfeiffer RM,Hildesheim A,et al.Circulating inflammation markers and prospective risk for lung cancer[J].J Natl Cancer Inst,2013,105 (24):1871-1880.

[14]Bunt SK,Yang L,Sinha P,et al.Reduced inflammation in the tumor microenvironment delays the accumulation of myeloid-derived suppressor cells and limits tumor progression[J].Cancer Res,2007,67(20):10019-10026.

[15]Bar D,Apte RN,Voronov E,et al.A continuous delivery system of IL-1 receptor antagonist reduces angiogenesis and inhibits tumor development[J]．FASEB J,2004,18(1):161-163．

[16]Vomnov E,Carmi Y,Apte RN.Role of IL-1-mediated inflananation in tumor angiogenesis[J]．Adv Exp Med Bid,2007,601(9):265-270．

Association between IL-1RN-2018 gene polymorphism and IL-1Ra/IL-1β with non-small cell lung cancer

LiJunrui1,XiaoYing2,FuYingju3,ZhangYali1,LuYujuan4,KangRuina1,ZhaoBaochun1

(1.DepartmentofInfectiousDisease;2.DepartmentofOncology;3.DepartmentofEmergency;4.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedTangshanWorker′sHospitalofHebeiMedicalUniversity,Tangshan,Hebei063000,China)

Objective To investigate the association between interleukin receptor antagonist (IL-1Ra) encoded genes(IL-1RN-2018) polymorphisms and serum IL-1Ra/IL-1β with non-small cell lung cancer (NSCLC).Methods Totally 85 cases of NSCLC were selected as the NSCLC group and 80 cases of healthy physical examination were selected as the control group from January 2012 to January 2014.The IL-1RN-2018 T/C gene polymorphisms of the two groups were determined with the fluorescence quantitative PCR technique based on high resolution melting,10% randomly selected samples were sequenced to prove the accuracy.The levels of IL-1Ra and IL-1β of two groups were determined with ELISA.Results (1)The onset risk of NSCLC in TC and TC+CC genotypes on IL-1RN-2018 site in the NSCLC group were increased by 2.646 times and 2.315 times respectively compared with TT genotype,the difference had statistical significance(P<0.05).(2)No statistically significant difference of IL-1RN-2018 T/C were found between patients with squamous cell carcinoma and adenocarcinomas(P>0.05).(3)The serum IL-1Ra and IL-1β levels in the NSCLC group were significantly higher than those in the control group,but IL-1Ra/IL-1β in the NSCLC group was significantly lower (P<0.05).(4)The serum IL-1Ra levels in the NSCLC group had no statistically significant difference among genotypes (P>0.05).Conclusion The C allele in IL-1RN-2018 site may increase the onset risk of NSCLC;the reduction of serum IL-1Ra/IL-1β may presage the risk of NSCLC.

interleukin 1 receptor antagonist;interleukin 1 bata;polymorphism;carcinoma,non-small cell lung

李君蕊(1974-)，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事感染科工作。

·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.14.020

R734.2

A

1671-8348(2015)14-1924-04

2015-01-10

2015-02-20)