慢病毒載體介導CGRP基因體外轉染及對MSC生物學特性的影響

陳攀科，石 蓓，許官學，劉志江，龍仙萍，張 巍，馬 帥

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，貴州遵義 563000)

慢病毒載體介導CGRP基因體外轉染及對MSC生物學特性的影響

陳攀科，石 蓓△，許官學，劉志江，龍仙萍，張 巍，馬 帥

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，貴州遵義 563000)

目的 探討慢病毒載體介導降鈣素基因相關肽(CGRP)基因體外轉染間充質干細胞(MSC)及其對MSC生物學特性的影響。方法 大鼠MSC進行分離、培養(yǎng)及鑒定。CGRP重組慢病毒轉染MSC后，采用熒光顯微鏡和流式細胞技術測定其轉染率。實時定量PCR、免疫熒光細胞化學及ELISA法檢測MSC中CGRP的表達。慢病毒轉染后通過MTT、β-半乳糖苷酶染色和誘導分化評價MSC的增殖、衰老及分化能力。結果 慢病毒載體介導CGRP基因轉染MSC后48 h可穩(wěn)定表達，MOI=30時，轉染率達80%以上。與MSC組和空載病毒轉染(MSC-EGFP組)比較，CGRP修飾的MSC(MSC-CGRP組)中CGRP的mRNA和蛋白表達水平增高(均P<0.01)。MTT、β-半乳糖苷酶染色和誘導分化結果顯示，病毒轉染后對MSC增殖、衰老及向內(nèi)皮分化基本沒有影響。結論 MSC是一種理想的基因載體細胞，可作為CGRP基因轉染的靶細胞用于基因治療，為后續(xù)體內(nèi)、體外實驗奠定基礎。

降鈣素基因相關肽；轉染；間充質干細胞；生物學特性

本研究小組前期的研究顯示,骨髓間充質干細胞(MSC)移植能在一定程度上促進損傷動脈內(nèi)皮的修復，但其對血管平滑肌細胞(VSMC)的影響較小[1-2]。降鈣素基因相關肽(CGRP)具有抑制VSMC增殖的作用，但CGRP在外周血的半衰期很短，需要通過合適的載體和靶細胞將其帶入體內(nèi)來持續(xù)發(fā)揮作用[3]。因此，本研究旨在研討慢病毒載體介導CGRP基因體外轉染MSC后，CGRP的表達及對MSC生物學特性的影響，為進一步在細胞和動物模型中的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料 雄性SD大鼠購自重慶第三軍醫(yī)大學動物實驗中心。慢病毒載體Lv-EGFP和Lv-CGRP由上海英為信公司提供；CGRP引物由上海英為信公司合成。所用的抗體均購自美國Abcam 公司。ELISA試劑盒購自美國Biosciences公司。MTT購自美國Promega公司。細胞衰老特異性檢測試劑盒購自上海杰美基因有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MSC的培養(yǎng)和鑒定 SD大鼠(100 g左右)脫臼處死后，無菌條件下獲取骨髓，離心純化并獲取MSC。MSC在10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每2～3天換液，棄懸浮細胞，細胞鋪滿瓶底約90%后傳代，第2～4代細胞用于實驗；取第3代細胞通過流式細胞術檢測MSC表面標記物(CD29 和CD45)來鑒定，分別加入各自IgG作為對照。

1.2.2 MSC基因修飾和轉染 空載病毒轉染MSC設為MSC-EGFP，CGRP重組慢病毒轉染設為MSC-CGRP。熒光顯微鏡初步評估轉染效率和最佳感染復數(shù)，進而用流式細胞術進一步證實。

1.2.3 實時定量PCR檢測 檢測上述最佳感染復數(shù)下MSC中CGRP的mRNA表達水平。按RNA抽提試劑盒操作說明，提取每一克隆的總RNA。通過逆轉錄酶行逆轉錄和按SYBR Green 混合試劑盒說明書進行cDNA擴增。CGRP基因用特殊的低聚核苷酸引物，并以大鼠18S-QP基因作為內(nèi)參對照。PCR引物序列如下，CGRP：5′-AGC CCC AGA TCT AAG CGG TGT G-3′ and 5′-TCC TTG GCC ATA TCC CTT TTC TTG-3′;18S：5′-AAA CGG CTA CCA CAT CCA AG-3′ and 5′-CCT CCA ATG GAT CCT CGT TA-3′。數(shù)據(jù)通過Ct比較法進行分析、定量(2-△△Ct)。

1.2.4 免疫熒光細胞化學(ICC)法 通過ICC法檢測上述最佳感染復數(shù)下MSC中CGRP蛋白的表達。細胞爬片，多聚甲醛固定，0.3% Triton 破膜，山羊血清封閉，兔抗大鼠CGRP一抗4 ℃孵育過夜，用1∶100驢抗兔IgG-TRITC二抗37 ℃孵育 1 h，然后DAPI復染細胞核3～5 min，抗熒光淬滅劑封，激光共聚焦顯微鏡(LSCM)下拍照并定性分析。

1.2.5 ELISA 通過ELISA試劑盒檢測被轉染MSC上清中CGRP蛋白水平。取P3 MSC細胞按(0.5～1.0)×106個/孔的細胞密度接種于6孔板中，CGRP重組慢病毒按上述最佳轉染復數(shù)轉染MSC 48 h后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集上清液，然后根據(jù)ELISA試劑盒說明書方法檢測上清液中CGRP的蛋白水平(n=3)。

1.2.6 MTT檢測 實驗分MSC-CGRP組、MSC-EGFP組和對照組(MSC組)。取P3 MSC按(0.5～1.0)×104個/孔接種于96孔板中，細胞貼壁后按MOI=30進行病毒轉染，每天各取3組(每組6孔)行MTT檢測，通過紫外分光光度計(波長490 nm)進行比色，測定光密度(OD)值。

1.2.7 β-半乳糖苷酶檢測法 分組同上，病毒轉染后均按正常細胞培養(yǎng)，傳至P5，將(1.0～2.0)×103個/孔細胞接種于6孔板中(即接種細胞為P6)，培養(yǎng)48 h后，按試劑盒操作說明書進行染色。鏡下觀察衰老細胞(藍染細胞)并根據(jù)公式[藍染率=染色陽性細胞/總細胞數(shù)×100%(每孔觀察3個視野，n=3)]計算衰老率。

1.2.8 病毒轉染對誘導分化的影響 分組同上，病毒轉染后予培養(yǎng)基(含血管內(nèi)皮生長因子10 ng/mL、成纖維細胞生長因子β 5 ng/mL)連續(xù)培養(yǎng)14 d，收集細胞分別行流式細胞技術檢測CD29、CD31的表達。

2 結 果

2.1 MSC的形態(tài)及表型特征 原代細胞培養(yǎng)至第4天可見小集落形成，并相互交聯(lián)，7 d左右滿瓶底，形態(tài)呈長梭型，漩渦狀排列，每3～4天傳代1次，傳至第5代細胞形態(tài)未見明顯改變(圖1A)；流式細胞術檢測第3代MSC表面標記，結果顯示，CD29達98.05%，而CD45為 3.74%(圖1B)，符合MSC的生物學特征。

2.2 CGRP基因體外轉染MSC的效率 慢病毒載體介導(MOI=30)轉染MSC后，通過明暗視野對比，轉染率達80%以上(圖2A)，流式細胞術證實轉染率為83.16%(圖2B)。

2.3 CGRP修飾MSC中CGRP的表達 實時定量PCR檢測CGRP修飾MSC后CGRP的mRNA表達水平，結果顯示，與MSC組(1.00±0.12)、MSC-EGFP組(1.12±0.24)相比，MSC-CGRP組(9.85±0.28)表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。ICC法檢測MSC中CGRP蛋白的表達，結果顯示，CGRP修飾MSC中可見CGRP陽性表達，且表達部位位于細胞胞質中(圖3)。ELISA檢測其蛋白分泌水平，結果顯示,培養(yǎng)48 h后與MSC組和MSC-EGFP組的上清液中幾乎無CGRP表達，而MSC-CGRP組中水平為25.30 pg CGRP/5×105個細胞/mL，與前兩組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

A：MSC傳代過程中的形態(tài)學變化；B：流式細胞術鑒定第3代MSC表面標記CD29和CD45表達。

圖1 MSC形態(tài)和表型特征

A：轉染48 h后明暗視野對比;B:流式細胞術檢測轉染率。

圖2 CGRP重組慢病毒在MSC中的轉染效率

a：P>0.05,與MSC組和MSC-EGFP組比較。

2.4 慢病毒載體轉染對MSC增殖的影響 通過MTT法檢測MSC組、MSC-EGFP組和MSC-CGRP組中VSMC的OD值，連續(xù)觀察6 d，結果顯示,在同一時間點，各組間相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.5 慢病毒載體轉染對MSC衰老的影響 通過β-半乳糖苷酶染色檢測各組細胞的衰老率，按公式計算各組衰老率，MSC組[(32.83±4.91)%]、MSC-EGFP組[(34.67±6.31)%]及MSC-CGRP組[(31.67±4.97)%]組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.6 慢病毒載體轉染對MSC分化的影響 通過流式細胞術檢測CD31的表達來判斷各組MSC向內(nèi)皮分化的能力，結果顯示，轉染CGRP對MSC向內(nèi)皮分化沒有影響。見圖4。

圖3 ICC法檢測CGRP修飾MSC后CGRP的蛋白表達

3 討 論

近來研究顯示，MSC移植治療心血管疾病是目前基礎和臨床研究的熱點[4-5]。MSC不僅具有不斷自我更新、多向分化潛能，還具有免疫耐受性，并且易于外源基因的轉染和表達而其多功能性不受影響等特點[6]。目前已有研究表明，體外培養(yǎng)的MSC可向心肌和血管內(nèi)皮等細胞分化，使其廣泛用于基礎研究中的新生血管化和促進血管生成[7-8]；同時，在損傷心臟模型中移植MSC，發(fā)現(xiàn)能促進心功能的恢復和血管生成，使其可能成為心血管修復的理想細胞群[9]。本研究小組先前的研究結果也顯示，MSC體內(nèi)移植在一定程度上能促進損傷動脈內(nèi)皮的修復，從而抑制新生內(nèi)膜的形成、減輕術后血管內(nèi)狹窄的程度，但其對VSMC的影響相對較小[1-2]。

CGRP是神經(jīng)肽家族的一種的血管活性肽，廣泛分布于神經(jīng)及心血管系統(tǒng)，主要由感覺神經(jīng)合成與分泌，具有多種生理功能，參與各種生理、病理過程，包括抑制炎癥、細胞增殖等，是目前體內(nèi)最強的內(nèi)源性擴血管肽之一[10]。在心血管系統(tǒng)，CGRP具有多種生物活性，如強大的擴血管作用、抑制VSMC增殖、保護內(nèi)皮細胞，以及參與血管新生等作用[11-12]。但CGRP在外周血的半衰期很短，直接注入體內(nèi)是很難持續(xù)發(fā)揮作用的，故需要通過合適的載體和靶細胞將其帶入體內(nèi)來發(fā)揮作用。對此，本研究旨在研討慢病毒載體介導CGRP基因體外轉染MSC后，CGRP的表達及對MSC生物學特性的影響。

本實驗首先通過熒光顯微鏡和流式細胞技術證實，慢病毒載體介導CGRP能成功轉染MSC，且當MOI為30時轉染率達80%以上。那么被慢病毒載體成功轉染的MSC是否表達CGRP呢？為了回答上述問題，本實驗從mRNA水平和蛋白水平兩個方面進行驗證。mRNA水平上，實時定量PCR檢測結果顯示，MSC自身即有少量CGRP的表達，且病毒轉染對其無明顯影響，而慢病毒載體介導CGRP基因轉染后的MSC，其CGRP表達量通過2-△△CT計算后[13]，是MSC-EGFP組和MSC組的9.85倍(P<0.01)。在蛋白水平上，通過多重ICC法結果發(fā)現(xiàn)，與MSC組和MSC-EGFP組相比，MSC-CGRP組中存在CGRP蛋白的表達，其表達部位位于細胞質；進而ELISA檢測結果證實，CGRP修飾的MSC能分泌CGRP，其水平為25.30 pg CGRP/5×105個細胞/mL，與MSC組和MSC-EGFP組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。由此說明CGRP修飾的MSC中高表達CGRP且能分泌CGRP蛋白。但病毒轉染是否對MSC的生物學特性有影響呢？

對此，本實驗使用MTT和β半乳糖苷酶染色法測定各組MSC的存活率，以MSC組為對照，結果發(fā)現(xiàn)MSC-EGFP組和MSC-CGRP組兩組細胞增殖和衰老水平均無明顯差異，說明轉染CGRP基因后的MSC仍具有其基本的生物活性，細胞存活率及生長未受到抑制。雖然既往有文獻報道,外源性CGRP對MSC增殖有促進作用，且能促進MSC的DNA合成和有絲分裂，但本實驗通過MTT法連續(xù)觀察6 d并未發(fā)現(xiàn)轉染CGRP基因組的MSCs增殖能力有所增加，這可能與CGRP基因通過慢病毒已整合到MSC中，并成為其中一部分的有關[14]。對CGRP基因修飾的MSC予血管內(nèi)皮生長因子、成纖維細胞生長因子β誘導分化后發(fā)現(xiàn)，CD31的表達較對照明顯升高，CD31為內(nèi)皮細胞的特異性標志，這說明轉染后的MSC仍具有向內(nèi)皮分化的能力。

綜上所述，慢病毒載體介導CGRP基因能成功轉染MSC，轉染的MSC穩(wěn)定高表達CGRP且能分泌CGRP蛋白；轉染對MSC增殖、分化等生物學特性無明顯影響。由此可知，MSC是一種理想的基因載體細胞，為CGRP基因轉染MSC后續(xù)的體內(nèi)、體外實驗奠定了基礎。

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Lentiviral vector mediated CGRP gene in vitro transfection and its effects on biological properties of MSC*

ChenPanke,ShiBei△,XuGuanxue,LiuZhijiang,LongXianping,ZhangWei,MaShuai

(DepartmentofCardiology,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi,Guizhou563000,China)

Objective To explore in vitro mesenchymal stem cell (MSC) transfection of lentiviral vector mediated calcitonin gene-related peptide(CGRP) gene and its effects on biological properties of MSC.Methods MSC were isolated,cultured and identified.MSC were infected by lentivirus encoding recombinant enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene and CGRP (Lv-EGFP-CGRP).The transfection efficiency was determined by the inverted fluorescence microscope and flow cytometry.The expression levels of CGRP were detected in CGRP-modified MSC by using real-time PCR,immunocytochemistry and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).The proliferation,aging and differentiation ability of MSC were evaluated by MTT,β-galactosidase staining and inducing differentiation respectively.Results After 48 h of MSC transfection by Lv-EGFP-CGRP,EGFP/CGRP could be expressed stably.When multiplicity of infection (MOI) was 30,the transfection efficiency reached more than 80%.Compared with the MSC group and the MSC-EGFP group,the mRNA and protein expression levels of CGRP in CGRP-modified MSC(MSC-CGRP group) were markedly increased(allP<0.01).The results of MTT,β-galactosidase staining and inducing differentiation assay demonstrated that the transfected CGRP basically had no effect on the proliferation,aging and endotheliocyte differerntiation of MSC.Conclusion MSC is a kind of ideal genetic vector cell,which can serve as the target cell of CGRP gene transduction for the application of gene therapy and lays the foundation for follow-up in vitro and vivo experiments.

calcitonin gene-related peptide；transfection；mesenchymal stem cells；biological property

國家自然科學基金資助項目(81060014)。 作者簡介：陳攀科(1982-)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事血管及冠心病介入研究?！?/p>

，E-mail:Shibei2147@163.com。

著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.14.001

R543.4

A

1671-8348(2015)14-1873-03

2014-12-10

2015-02-16)